Identifikasi Bakteri Fitase Ekstrak kasar Fitase
D. PROSEDUR PENELITIAN
1. Isolasi Bakteri dari sampel Abu Vulkanik
Bakteri fitase diisolasi dari abu vulkanik gunung Merapi dengan menggunakan metode seri pengenceran (Platting Method). 1 gram abu dilarutkan ke dalam 10 ml aquades ditambah larutan NaCl fisiologis 1%. Diambil sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan fisiologis sehingga didapat pengenceran 10-2. Pengenceran dilanjutkan sampai 10-6, 10-7 dan 10-8. Masing-masing seri pengenceran diambil 10 µl dimasukkan kedalam cawan Petri yang telah berisi media LB (Luria bertani). Kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. Subkultur dilakukan terhadap hasil kultur sebelumnya sehingga diperoleh koloni tunggal.
2. Seleksi bakteri Fitase
Masing masing koloni tunggal ditumbuhkan pada media LB (Luria bertani) yang mengandung 0,4% Na fitat, dengan komposisi media LB (Luria bertani); 1
commit to user
Tripton : 1 yeast ekstrak : 2 NaCl. Koloni bakteri diinokulasi pada 10 mL media cair. Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16 jam. Produksi ekstrak kasar enzim fitase dilakukan dengan sentrifugasi kultur cair 4000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim fitase. Kemudian dilanjutkan dengan pengukuran aktivitas fitase.
3. Pengukuran Aktivitas Fitase
Pengukuran aktivitas bakteri penghasil fitase dengan metode dari Sajidan (2002): 25 µl enzim, 125 µl susbtrat 0,4 % natrium fitat dalam 100 mM Natrium asetat diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. Reak si dihentikan dengan penambahan larutan STOP yang terdiri dari 2,352 g Ammonium molibdate/100 ml Aquadest sebagai larutan A, 10 g Ammonium metavanadate/100 ml Aquadest sebagai larutan B. Larutan STOP dibuat dengan perbandingan : 1,5 volume larutan A + 1,5 volume larutan B + 1 volume HNO3 pekat + 2 volume aquades.
Warna kuning dari fosfomolibdovanadat diukur dengan spektrofotometer pada ʎ=415 nm
4. Tahap Identifikasi
Bakteri penghasil fitase dengan aktivitas tertinggi selanjutnya dilakukan identifikasi berdasarkan karakter morfologi dan analisis gen 16s rRNA.
a. Pewarnaan Gram dan pengamatan Koloni
Kaca objek ditetesi dengan aquades, kemudian jarum ose steril diusapkan dalam biakan bakteri, dihomogenkan dan difiksasi diatas nyala bunsen (± 30 cm). Usapan yang telah kering ditetesi satu tetes kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya diteteskan satu tetes lugol dan dibiarkan selama 30 detik. Bercak Lugol dibilas sampai warna bilasan bening menggunakan etanol 95%. Kemudian diteteskan larutan safranin, dibiarkan 30 detik dan dibilas dengan aquades. Warna koloni diamati dengan
commit to user
mikroskop. Warna ungu pada sel menunjukkan Gram positif dan warna merah menunjukkan Gram negatif.
b. Isolasi DNA Bakteri
Isolat bakteri ditumbuhkan dalam medium LB (Luria bertani), sebanyak 1 ml kultur disentrifugasi pada 12.000 rpm. Kemudian DNA diekstrak dengan DNA kit (Promega USA) dengan langkah kerja sebagai berikut:
i. Pellet sel yang diperoleh ditambah 480 µL 50 mM EDTA dicampur sehingga tersuspensi, kemudian ditambahkan 120 µL Lisozim 10mg/ml dan diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit, kemudian di sentrifuge 12.000 rpm selama 2 menit. (Untuk bakteri gram Positif)
ii. Pellet sel ditambah 600 µL Nuclei Lysis Solution (Promega) dicampur sehingga sel tersuspensi kembali.
iii. Inkubasi 800C selama 5 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. iv. Ditambahkan 3 µL RNAse Solution (Promega) mikro tube dibolak balik
sampai tercampur.
v. Inkubasi 370C selama 60 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. vi. Ditambahkan 200 µL Protein precipitation Solution, vortex dengan
kecepatan tinggi selama 20 detik
vii. Inkubasi dalam es selama 5 menit, kemudian sentrifuge 12.000 rpm selama 3 menit.
viii. Supernatan dipindahkan ke dalam mikro tube baru yang telah berisi 600 µL isopropanol (mikro tube dibolak balik sehingga tercampur dan benang- benang DNA terlihat)
ix. Sentrifuge 12.000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatant dibuang dan tube dikeringkan
commit to user
x. Ditambahkan 600 µL 70% etanol, kemudian sentrifuge 12.000 rpm selama 2 menit
xi. Mikro tube dikering-anginkan selama 10 sampai 15 menit
xii. Ditambahkan 100 µL DNA Rehidration Solution (Promega), inkubasi pada suhu 650C selama 60 menit.
xiii. Disimpan pada suhu 40C
Kualitas DNA diketahui melalui spektrofotometer (A260) dan kemurnian DNA yang telah berhasil diisolasi di cek melalui elektroforesis pada agaros gel 1%.
c. Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan universal primer (Shobirin et al., 2009) Primer Forward :
(5'GAGAGTTTGATCCTGGCCAG-3'), Primer Reverse:
(5‘CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3‘). 1 mikrotube reaksi PCR berisi 25 µl yang terdiri dari; 6, 5 µl master mix PCR go-Taq Green Promega, 2 DNA µl, 2 µl primer forward, 2 µl primer reverse, 12,5 µl dH2O filter. Siklus PCR
(Polymerase Chain Reaction) meliputi 3 tahap yaitu; denaturasi, annealing dan ekstention. Denaturasi awal pada 94°C selama 2 menit dilanjutkan dengan 30 siklus, denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, 45 detik annealing pada 50° C dan 1.5 menit primer ekstension pada 72°C. Kemudian 72°C ektra ektension selama 5 menit dan terakh ir 4°C selama 1 menit.
Pita DNA dari reaksi PCR diamati dengan 1% agarosa, dengan DNA marker 1 Kb. Setelah itu dilakukan sekuensing pada hasil PCR di laboratorium 1st base Singapura.
commit to user
5. Karakterisasi Ekstrak Kasar Fitase dari Isolat Terpilih
Isolate bakteri yang mempunyai aktivitas fitase paling tinggi ditumbuhkan dalam 5 ml medium screening cair pada suhu 370C selama 16 jam. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit pada suhu 40C. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar fitase.
Karakterisasi ekstrak kasar fitase meliputi penentuan pH optimum, suhu optimum, efektor logam (MgCl2, ZnCl2, CaCl2, FeCl3 pada 10-3 dan 10-4
M), stabilitas pH dan stabilitas suhu. 5.1. pH optimum
pH optimum ditentukan dengan cara mengukur aktivitas enzim pada berbagai pH substrat yaitu pada rentang 3 – 9. 0,4% Na-fitat dalam 100 mM Na-asetat digunakan sebagai substrat di atur tingkat keasamannya sehingga mempunyai pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
5.2. Suhu optimum
Suhu optimum ditentukan dengan cara mengukur aktifitas enzim pada berbagai suhu inkubasi enzim-substrat. Mulai dari suhu diruang, 370C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C. Ekstrak kasar enzim fitase sebanyak 25 µL ditambahkan substrat 125 µL dan diinkubasi selama 60 menit pada berbagai suhu yang telah ditentukan tersebut. Setelah itu ditambahkan 400 µL larutan STOP, kemudian diukur absorbansi larutan pada ʎ = 415 nm.
Stabilitas termal enzim diketahui dengan memanaskan enzim pada suhu optimum selama rentang waktu tertentu dan diukur aktivitasnya sampai enzim tidak memperlihatkan aktivitas yang signifikan. Pada pengukuran stabilitas pH dilakukan dengan cara melarutkan enzim dalam larutan buffer dengan berbagai pH. Masing masing campuran diinkubasi pada suhu
commit to user
optimum selama 1 jam kemudian diukur aktifitas fitase pada tiap-tiap pH tersebut.
5.3. Efektor Logam
Kedalam setiap larutan enzim-substrat ditambahkan 10 µL FeCl3,
MgCl2, CaCl2, dan ZnCl2 dengan konsentrasi 10-3 dan 10-4 M. Kemudian
diinkubasi pada pH dan suhu optimum selama 60 menit.