cDNA ASAL DAUN KARET
IDENTIFIKASI TRANSKRIP TANAMAN KARET YANG DIEKSPRESIKAN DALAM INTERAKSI DENGAN CENDAWAN
PATOGEN Corynespora cassiicola MELALUI ANALISIS cDNA-AFLP
ABSTRAK
Salah satu teknik yang dapat diaplikasikan untuk mengidentifikasi transkrip tertentu adala h cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism
(cDNA-AFLP). Teknik tersebut digunakan pada tanaman karet dengan tujuan mengidentifikasi transkrip asal daun karet yang diekspresikan secara diferensial selama terjadi interaksi antara tanaman karet dengan cendawan C. cassiicola.
Untuk mencapai tujuan tersebut digunakan klon AVROS 2037 dan PPN 2444, masing-masing memiliki sifat resisten dan rentan terhadap C. cassiicola. Daun diinfeksi dengan konidia C. cassiicola dan kemudian contoh daun diambil pada waktu 0, 24, 36, 48 dan 72 jam setelah inokulasi. Beberapa metode isolasi RNA diterapkan untuk mendapatkan RNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik sehingga cDNA yang diperoleh juga memiliki kualitas tinggi. Analisis cDNA- AFLP dilaksanakan dengan menggunakan pasangan enzim restriksi VspI dan
TaqI, dengan demikian adapter dan primer memiliki sekuen pengenalan kedua enzim restriksi tersebut. Produk cDNA-AFLP yang diperoleh melalui reaksi amplifikasi dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dipisahkan pada gel poliakrilamid dan divisualisasikan pada film sinar-X. Fragmen cDNA target diisolasi dari gel, dimurnikan dan diklon pada vektor pGEMT Easy, kemudian diintroduksikan ke sel bakteri E. coli DH5á. Perunutan sekuen fragmen cDNA dilaksanakan melalui proses sekuensing. Dari analisis cDNA-AFLP tersebut diperoleh sebanyak 35 fragmen asal transkrip (transcript-derived fragment, TDF) dengan pola ekspresi berbeda, baik antar klon maupun antar perlakuan pada masing-masing klon. Ke-35 fragmen tersebut dikelompokkan berdasarkan homologi sekuennya dan menghasilkan 19 contigs serta 9 macam sekuen yang tidak dapat dikelompokkan dalam contig yang sama. Sisanya merupakan sekuen yang terlalu pendek hanya terdiri atas beberapa nukleotida saja. Sebanyak 10 dari 19 contigs dan 5 dari 9 sekuen tersebut memiliki homologi dengan produk gen yang telah dikenal yang terdapat di database GenBank, seperti putative Ran binding protein, protein transporter, regulator transkripsi, arginase, GTP-binding protein, heat shock protein (HSP) dan aconitase. Beberapa di antaranya seperti
putative Ran binding protein, protein transporter dan GTP-binding protein dikenal sebagai protein membran,sedangkan arginase dan HSP merupakan protein atau enzim yang ekspresinya pada tanaman antara lain dipengaruhi oleh adanya pelukaan dan perlakuan toksin. Keberadaan arginase sering berhubungan dengan ketersediaan nitric oxide (NO) pada jaringan tanaman. NO dikenal sebagai salah satu sinyal molekul dalam mekanisme pertahanan tanaman.
Kata kunci: cDNA-AFLP, identifikasi transkrip, ekspresi diferensial, Hevea brasiliensis, C. cassiicola.
PENDAHULUAN
Resistensi tanaman berhubungan dengan kemampuan tanaman mencegah perkembangan patogen yang menyerang. Kemampuan tersebut diperoleh melalui berbagai strategi pertahanan pasif maupun aktif. Mekanisme pertahanan pasif merupakan pembatas struktural seperti lapisan lilin pada kutikula atau lapisan lignin yang tebal sehingga penetrasi patogen terhambat. Mekanisme pertahanan aktif me libatkan ekspresi gen yang diinduksi oleh adanya interaksi antara tanaman dengan patogen (Keen 1992). Respon pertahanan aktif dicirikan oleh interaksi inkompatibel antara tanaman dengan patogen dan keberhasilan respon per tahanan aktif terletak pada kemampuan tanaman mengenali adanya infeksi oleh patogen. Pengenalan melibatkan molekul reseptor berupa protein yang biasanya terletak pada membran plasma da n disandikan oleh suatu gen resisten (Gabriel dan Rolfe 1990). Reseptor berinteraksi dengan protein dari patogen dan interaksi tersebut berfungsi sebagai stimulus untuk mengaktifkan respon pertahanan tanaman.
Identifikasi dan isolasi gen dalam interaksi inang-patogen telah banyak dilaporkan (Heath 1998; Kombrink dan Somssic h 1997; Lin et al. 1997; Sugui dan Deising 2002). Respon ketahanan ada yang berhubungan dengan ekspresi gen penyandi enzim hidrolitik seperti kitinase dan β-1,3-glukanase, protein antifungal dan enzim dalam biosintesis senyawa antimikroba seperti fitoaleksin (Lin et al. 2003). Respon ketahanan juga dapat disebabkan oleh adanya gen resisten seperti gen Hm1 yang memberikan ketahanan tanaman jagung terhadap cendawan patogen Cochliobolus carbonum (Johal dan Briggs 1992). Hm1 adalah kelompok gen resisten penyandi enzim detoksifikasi. Penemuan berikutnya menunjukkan sebagian besar gen resisten menyandikan protein yang berperan dalam transduksi sinyal, dan dibedakan satu sama lain berdasarkan struktur proteinnya (Baker et al. 1997; Ellis dan Jones 1998; Richter dan Ronald 2000).
Pada umumnya gen resisten yang telah diidentifikasi menyerupai reseptor intraseluler dan mengandung situs pengikatan nukleotida (nucleotide binding site
= NBS) yang diikuti oleh domain leucine-rich repeat (LRR) pada ujung C- terminal (Martin et al. 1993; Baker et al. 1997; Ellis dan Jones 1998). Berdasarkan motif pada ujung N-terminal, kelompok gen resisten NBS-LRR
dapat dibedakan atas dua macam yakni yang mengandung motif leucine zipper
(LZ) seperti gen Rps2 dan Rpm1 (Bent et al. 1994; Grant et al. 1995; Mindrinos et al. 1994) dan mengandung motif yang homologi dengan domain sitoplasmik pada gen Toll Drosophila serta reseptor interleukin-1 (TIR) seperti gen N (Whitman et al. 1994), gen L6 (Lawrence et al. 1995) dan gen Rpp5 (Parker et al. 1997).
Beberapa gen resisten lainnya menyerupai reseptor ekstraseluler, seperti kelompok gen Cf (Parniske et al. 1997) dan gen Xa21 (Shalev dan Levy 1997). Kemiripan yang dimiliki oleh protein yang disandikan oleh gen resisten mengindikasikan bahwa tanaman berbeda menggunakan strategi yang hampir sama dalam mencegah timbulnya penyakit (Richter dan Ronald 2000).
Takken dan Joosten (2000) mengemukakan, mekanisme resistensi melalui ekspresi protein yang disandikan oleh gen resisten, dapat terjadi melalui empat macam cara yaitu : (1) Produk gen resisten meng-inaktivasi toksin yang dilepas oleh patogen dengan cara menginduksi terjadinya nekrosis atau menghambat induksi respon pertahanan aktif. Mekanisme seperti ini dijumpai pada interaksi tanaman jagung yang memiliki gen resisten Hm1 penyandi NADPH-dependent reductase dengan Cochliobolus carbonum ras 1 penghasil HC-toksin (Johal dan Briggs 1992); (2) Produk gen resisten menyandikan target patogenisitas sehingga keberadaan gen menyebabkan tanaman rentan, seperti gen mitokondrial T-urf13
jagung memberikan kerentanan terhadap Bipolaris maydis ras T (Braun et al. 1989). Varietas jagung yang kehilangan gen T-urf13, resisten terhadap patogen serupa; (3) Produk gen resisten menghambat respon pertahanan tanaman seper ti pada interaksi barley dengan Erysiphe graminis f.sp. hordei. Kerentanan tanaman disebabkan oleh gen mlo. Mutagenesis pada gen mlo memberikan resistensi yang bersifat durable serta aktif melawan infeksi cendawan dalam spektrum luas; (4) Produk gen resisten memperantarai pengenalan patogen yang mengekspresikan gen avirulen (Avr) yang sesuai sehingga mengaktivasi aliran sinyal transduksi pada tanaman yang melibatkan fosforilasi protein, aliran ion, pembentukan spesies oksigen reaktif dan sinyal-sinyal lainnya. Sinyal segera memicu transkripsi gen-gen untuk pertahanan tanaman yang menyandikan berbagai protein seperti glutathion-S-transferase, peroksidase, protein-protein dinding sel, proteinase inhibitor, enzim-enzim hidrolitik seperti kitinase dan 1,3-β-glucanase,
serta berbagai PR protein (Zhu et al. 1996). Umumnya, sel-sel tanaman yang kontak langsung dengan patogen akan mati, disebut sebagai respon hipersensitif (HR), dan fenomena seperti ini merupakan ciri resistensi yang didasarkan pada konsep gene-for-gene (Hammond-Kosack dan Jones 1996).
Salah satu teknik yang dapat digunakan untuk identifikasi dan isolasi transkrip/ gen adalah cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA- AFLP) (Bachem et al. 1996). Kepekaan teknik tersebut telah dibuktikan sebanding dengan analisis Northern sehingga banyak diaplikasikan untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan dalam interaksi inang-patogen, baik gen yang berasal dari tanaman maupun dari patogen (Avrora et al. 2003; Biezen et al. 2000; Durrant et al. 2000; Petters et al. 2002; Santaella et al. 2004, Sugui dan Deising 2002; Zhang et al. 2003). Keistimewaan teknik cDNA-AFLP adalah kemampuannya untuk mengidentifikasi gen yang terinduksi maupun tertekan ekspresinya pada satu percobaan yang sama. Teknik cDNA-AFLP memiliki sensitivitas tinggi, dapat diulang dan didasarkan pada reaksi amplifikasi dengan PCR serta tidak memerlukan pengetahuan tentang sekuen DNA dari genom target.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi transkrip atau gen/bagiannya yang berhubungan dengan resistensi maupun kerentanan klon karet terhadap infeksi C. cassiicola, dengan mengaplikasikan teknik cDNA-AFLP. Dengan menggunakan RNA yang diisolasi dari klon resisten dan klon rentan dalam suatu rentang waktu selama terjadi interaks i antara tanaman dengan patogen, perubahan pola ekspresi transkrip tertentu dapat diamati. Untuk menampilkan profil transkrip dengan baik, diperlukan RNA dan cDNA dengan kualitas tinggi dan seragam. Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan juga pemantapan prosedur isolasi RNA dan sintesis cDNA untuk daun karet sehingga sesuai untuk digunakan dalam analisis cDNA-AFLP .
BAHAN DAN METODE
Bahan tanam dan isolat patogen
Klon karet resisten AVROS 2037 dan klon rentan PPN 2444 yang ditanam dalam polibeg digunakan dalam penelitian ini. Bahan tanam tersebut pada fase
pertumbuhan dua unit daun. Sebagai patogen adalah isolat C. cassiicola cGT1 SS virulen yang diperoleh dari Balai Penelitian Karet (BPK) Sembawa. Konidia isolat diproduksi berdasarkan metode Situmorang (2002).
Perlakuan tanaman
Daun umur sekitar 14 hari diinokulasi dengan menggunakan suspensi konidia yang disemprotkan secara merata ke permukaan bawah daun de ngan menggunakan botol semprot, kemudian daun disungkup dengan kantong plastik. Konsentrasi konidia di dalam suspensi adalah 4 x 104 konidia/ml. Sampel diambil dari daun yang tidak diinokulasi sebagai kontrol dan dari daun yang diinokulasi masing-masing 24, 36, 48 dan 72 jam setelah inokulasi. Sampel daun disimpan dalam nitrogen cair sebelum isolasi RNA dilaksanakan.
Preparasi sampel RNA dan cDNA untuk analisis cDNA-AFLP
Dalam penelitian ini diuji tiga cara preparasi sampel RNA untuk analisis cDNA-AFLP. Pertama, adalah preparasi sampel secara bertahap melalui isolasi RNA yang ke mudian digabung dengan pemurnian mRNA menggunakan Poly ATract mRNA Isolation System III (Promega) serta sintesis cDNA menggunakan
Universal Riboclone cDNA Synthesis System (Promega). Kedua, adalah preparasi sampel melalui isolasi RNA dengan kit Plant RNA Reagent (Invitrogen)
yang kemudian digabung dengan metode satu tabung (one-tube method) menggunakan mRNA Capture Kit (Roche). Sedangkan teknik preparasi sampel yang ketiga adalah menggunakan mRNA Capture Kit (Roche) tanpa melalui isolasi RNA.
Preparasi sampel secara bertahap
Isolasi RNA dari daun tanaman karet dilakukan dengan dua cara yaitu menggunakan metode Pawlowski et al. (1994) dan metode Taylor dan Powel (dalam Speirs dan Longhurst, 1993), dengan beberapa modifikasi. Prosedur isolasi RNA dengan metode Pawlowski et al. (1994) terdapat pada Bab 4, sedangkan prosedur isolasi RNA berdasarkan metode Taylor dan Powel dilaksanakan sebagai berikut.
Peralatan dan larutan yang akan digunakan untuk mengisolasi RNA direndam dalam larutan DEPC 0,1%. Daun karet dicuci dengan air mengalir, kemudian tulang daunnya dibuang dan dikeringkan dengan kertas tisu. Daun ditimbang 2 – 2,5 g, dimasukkan ke dalam lumpang porselen yang telah didinginkan, kemudian ditambahkan 0,2 g PVPP dan nitrogen cair, lalu digerus sampai terbentuk serbuk halus. Serbuk halus yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 15 ml yang telah diisi dengan 5 ml bufer ekstrak (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA pH 8,0, 2% CTAB) dan 2% β- merkaptoethanol, dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 0C selama 30 menit, dikocok setiap 5 menit sekali. Larutan bufer ekstrak didinginkan hingga suhu kamar, kemudian ditambahkan 5 ml fenol:kloroform (1:1) dan dikocok kuat.
Campuran disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit. Cairan bagian atas (supernatan) dipipet ke dalam tabung sentrifus lain dan ditambah dengan 5 ml fenol:kloroform (1:1). Fenol dihilangkan dengan cara mengekstrak supernatan dengan 5 ml kloroform, campuran dikocok kuat dan disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipipet ke dalam tabung sentrifus lain, ditambahkan 5 ml isopropanol dingin dan dihomogenkan perlahan-lahan, kemudian diinkubasi pada suhu – 20 0C selama 30 menit. Campuran disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 25 menit. Cairan dibuang, endapan dikering-anginkan dengan cara membalikkan tabung. Selanjutnya endapan dilarutkan dengan 500 µl akuades steril (yang telah diberi perlakuan dengan DEPC 0,1%), larutan dipipet ke dalam tabung 2 ml dan ditambahkan ¼ volume LiC l 10 M, kemudian diinkubasi pada suhu 40C selama 3 jam. Campuran disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit, cairan dibuang, endapan RNA dilarutkan dengan 500 µl akuades steril kemudian larutan dipipet ke dalam tabung 2 ml. Ke dalam tabung ditambahkan 1/10 volume natrium asetat 3 M pH 5,2 dan 2,5 volume alkohol absolut, diinkubasi pada suhu – 20 0C satu malam. Selanjutnya campuran disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. Cairan dibuang, endapan dicuci dengan 500 µl alkohol 70% kemudian dikering-anginkan. Endapan dilarutkan dengan 500 µl akuades steril.
Hasil isolasi RNA diamati melalui elektroforesis pada gel agarose 1% yang diwarnai dengan 0,5 mg/l etidium bromida, pada tegangan 50 Volt selama
sekitar 1 jam. RNA diamati dengan menggunakan UV transiluminator. Penetapan konsentrasi RNA dilakukan dengan spektrofotometer UV melalui nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm (Sambrook et al. 1989).
Pemurnian mRNA denganPoly ATract mRNA Isolation System III
Untuk memurnika n mRNA dari RNA digunakan kit Poly ATract mRNA Isolation System III (Promega) , prosedur pemurnian mRNA terdapat da lam Bab 4.
Sintesis cDNA menggunakanUniversal Riboclone cDNA Synthesis System
Sintesis cDNA menggunakan Universal Riboclone cDNA Synthesis System (Promega) dilaksanakan sesuai prosedur yang direkomendasikan. Tahapan sintesis tersebut secara rinci terdapat dalam Bab 5.
Pemotongan cDNA dengan enzim restriksi TaqI dan VspI
Untuk memotong cDNA dengan enzim restriksi Taq I, sebanyak 20 µl cDNA (250 ng) dicampur dengan 4 µl 1,4 All Buffer (10X), 1 µl enzim Taq I (10 unit/µl), dan ditambahkan H2O (MilliQ) hingga volume 40 µl. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 65 0C selama 2 jam, didinginkan sampai suhu ruang, kemudian diputar sesaat. Pemotongan cDNA dengan enzim VspI dilakukan dengan cara menambahkan 10 µl campuran yang mengandung 1 µl 1,4 All Buffer
(10X), 1 µl enzim VspI (10 unit/µl) dan 8 µl H2O (MilliQ), sehingga total volume
adalah 50 µl. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 2 jam.
Ligasi fragmen cDNA dengan sekuen adapter
Sekuen adapter yang digunakan adalah adapter utas atas Vsp I (5’- CTC GTA GAC TGC GTA CC- 3’), adapter utas bawah Vsp I (5’- TAG GTA CGC AGT C – 3’), adapter utas atas Taq I (5’- GAC GAT GAG TCCT GAC – 3’) dan adapter utas bawah Taq (5’- CGG TCA GGA CTC AT – 3’). Adapter Vsp I disiapkan dengan cara mencampurkan sebanyak 2,6 µl adapter utas atas Vsp I (1 µg/µl), 2 µl adapter utas bawah Vsp I (1 µg/µl), dan 95,4 µl H2O (MilliQ) sehingga konsentrasi akhir adalah 5 µM. Campuran diinkubasi pada suhu 37 0C selama 10 menit, dan didinginkan sampai mencapai suhu ruang. Untuk
menyiapkan adapter Taq I, dicampurkan sebanyak 25 µl adapter utas atas Taq I (1 µg/µl), 22 µl adapter utas bawah Taq I (1 µg/µl), dan 53 µl H2O (MilliQ) sehingga konsentrasi akhir adalah 50 µM. Campuran kemudian diinkubasi dengan suhu dan waktu yang sama seperti di atas.
Ligasi antara fragmen cDNA dengan sekuen adapter dilaksanakan dengan menambahkan ke dalam 50 µl produk restriksi sebanyak 5,5 µl campuran yang mengandung 1 µl adapter Vsp I (5 µM), 1 µl adapter Taq I (50 µM), 0,5 µl ATP (10 mM), 0,5 µl 1,4 All Buffer (10X), 2,5 µl T4 DNA Ligase. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 22 0C selama 2 jam.
Preamplifikasi
Pramplifikasi dilaksanakan dengan primer standar Vsp dan Taq yang tidak mengandung nukleotida selektif. Sekuen primer standar untuk Vsp adalah 5’- CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT – 3’ dan sekuen primer standar untuk Taq
adalah 5’ - GAC GAT GAG TCC TGA CCG A – 3’. Setiap campuran preamplifikasi terdiri atas 5 µl produk ligasi, 1 µl Vsp primer (100 ng/µl), 1 µl
Taq primer (100 ng/µl), 5 µl PCR bufer (10X), 5 µl dNTPs (10X, 2,5 mM), 2 µl Taq DNA Polimerase, 5 µl MgCl2, dan ditambahkan H2O hingga volume 50 µl. Ke dalam setiap tabung ditambahkan 2 tetes minyak mineral. Reaksi amplifikasi dilaksanakan dengan kondisi 94 0C, 3 menit kemudian diikuti 25 siklus, setiap siklusnya terdiri atas 94 0C (45 detik), 55 0C (45 detik), dan 72 0C (60 detik).
Produk PCR kemudian dielektroforesis pada agarose 1% dengan tegangan 70 V selama kurang lebih 30 menit. Gel kemudian diwarnai dengan etidium bromida (0,5 mg/l ) dan produk amplifikasi diamati dengan UV transiluminator.
Amplifikasi selektif
Untuk pelaksanaan amplifikasi selektif, dilakukan pengenceran terhadap produk preamplifikasi sebanyak 10X. Di samping itu primer Vsp selektif dilabel dengan radioisotop 3 3P. Proses pelabelan dilaksanakan dengan mencampurkan 5 µl primer Vsp (100 ng/µl), 10 µl bufer kinase (bufer A) 5X, 10 µl γ 33 ATP, 2 µl T4 kinase dan ditambahkan H2O hingga volume 50 µl. Campuran diinkubasi pada suhu 37 0C selama 1 jam, dan kemudian dipanaskan pada suhu 70 0C selama 10
menit untuk menginaktifkan enzim. Primer yang telah dilabel disimpan pada suhu 4 0C dalam wadah khusus, sampai akan digunakan.
Primer untuk amplifikasi selektif mengandung 2 nukleotida tambahan dengan sekuen primer Vsp adalah 5’ - GAC TGC GTA CCT AAT NN – 3’ dan sekuen primer Taq I adalah 5’- GAT GAG TCC TGA CCG ANN – 3’. Preparasi sampel dilakukan dengan mencampurkan 5 µl produk preamplifikasi yang telah diencerkan, 0,2 µl Vsp primer (100 ng/µl) yang telah dilabel, 0,6 µl Taq primer (100 ng/µl), 3,2 µl dNTPs (10X, 2,5 mM), 2 µl PCR bufer, 2 µl MgCl2 10X, 1 µl
Taq DNA Polimerase dan H2O hingga volume 20 µl. Kemudian ditambahkan 1 tetes minyak mineral. Reaksi amplifikasi dilaksanakan sebanyak 13 siklus dengan kondisi 94 0C (30 detik), 65 0C [- 0,7 0C/siklus] (30 detik), 72 0C (60 detik) dan 23 siklus dengan kondisi 94 0C (30 detik), 56 0C (30 detik), 72 0C (60 detik).
Visualisasi produk PCR
Produk PCR dicampur dengan pewarna formamid dengan volume yang sama dan didenaturasi pada 94 0C selama 3 menit, sebelum dielektroforesis pada 5% poliakrilamid gel. Gel kemudian ditransfer ke Gel Blotting Paper, dikeringkan dengan Gel Dryer dan diekspos dengan film sinar X (Life Ray XDA Plus UTL G) selama ± 7 hari.
Preparasi sampel melalui isolasi RNA dan metode satu tabung (one-tube method)
Isolasi RNA menggunakan Plant RNA Reagent (Invitrogen)
Daun yang telah diinokulasi dengan C. cassiicola dimasukkan ke dalam RNAlater (Ambion) yaitu reagen yang berfungsi untuk melindungi RNA dari kerusakan, terutama apabila isolasi RNA tidak bisa langsung dilaksanakan dan penyimpanan dalam nitrogen cair tidak memungkinkan. Sebelum dilaksanakan isolasi RNA, daun terlebih dulu di-liopilisasi untuk menghilangkan semua cairan dari jaringan daun sehingga daun menjadi kering. Liopilisasi dila ksanakan dengan menggunakan alat Lyophilisator, selama 48 jam.
Untuk mengisolasi RNA, daun yang telah kering digerus hingga berbentuk serbuk halus kemudian serbuk ditimbang sebanyak 100 mg dan ditambahkan 0,5
ml Plant RNA Reagent dingin (4 0C), dikocok menggunakan vortex sehingga serbuk tercampur sempurna dengan larutan. Campuran kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang, disentrifus dengan kecepatan 12.000 g selama 4 menit pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan ke tabung baru yang bebas RNase. Ke dalam supernatan ditambahkan 100 µl NaCl 5 M dan 300 µl kloroform, kemudian tabung di bolak-balik untuk mencampurkan semua larutan. Selanjutnya sampel disentrifus pada kecepatan 12.000 g selama 10 menit pada suhu 4 0C. Fase cair bagian atas dipindahkan ke tabung baru bebas RNase da n ditambahkan isopropil alkohol dengan volume yang sama, kemudian tabung dibolak-balik untuk mencampurkan larutan. Campuran diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang, kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 g selama 10 menit pada suhu 4 0C. Supernata n dibuang dan ke dalam tabung yang berisi endapan ditambahkan 1 ml etanol 75%, tabung diketuk pelan untuk melepaskan endapan dari dinding tabung, disentrifus pada kecepatan 12.000 g selama 1 menit pada suhu ruang. Cairan dibuang dan endapan dikeringkan de ngan menggunakan vakum (Univapo Concentrator Centrifuge, tipe MC2L - UniEquip).
RNA kemudian dilarutkan dalam 20 µl air yang diberi perlakuan DEPC dan disimpan pada – 20 0C. Untuk mengetahui kualitas RNA, sebanyak 1 µl RNA dicampur dengan 5 µl H2O dan 1 µl bromofenol biru kemudian dielektroforesis. Kuantitas RNA diukur dengan spektrofotometer UV (UV/Vis
Spectrophotometer - Beckman) dengan menggunakan 1 µl RNA.
Pemurnian mRNA dan sintesis cDNA dengan mRNA Capture Kit
Sebanyak 5 µg total RNA dicampur dengan 40 µl lisis bufer dan 1 µl oligo(dT)20 terlabel biotin, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0Cselama 5 menit. Larutan dipindahkan ke streptavidin-coated PCR tube dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama 5 menit, kemudian dibiarkan dingin sampai suhu ruang dan diletakkan pada kotak berisi es. Cairan dibuang dari tabung dan tabung dicuci tiga kali, masing-masing menggunakan 250 µl washing buffer.
Untuk sintesis cDNA utas pertama, ke dalam tabung dimasukkan 50 µl campuran yang mengandung 10 µl bufer ligasi 5X, 0,5 µl RNase inhibitor, 5 µl DTT 100 mM, 10 µl dNTP 10X (2,5 mM), 1 µl Reverse Transcriptase Expand
dan 22,5 µl H2O. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 42 0C selama 2 jam. Sebanyak 10 µl campuran di atas dibuang, dan ke dalam 40 µl campuran yang terdapat dalam streptavidin-coated PCR tube ditambahkan 120 µl larutan yang mengandung 16 µl bufer ligasi, 12 µl dNTP 10X (2,5 mM), 6 µl DTT 100 mM, 1,5 µl enzim ligase, 4,3 µl DNA Polimerase I (E. coli), 1,6 µl RNase H dan 78,6 µl H2O, untuk sintesis cDNA utas kedua. Campuran diinkubasi 15 0
C selama 45 menit dan kemudian 22 0C selama 50 menit. Larutan dibuang dari tabung dan tabung dicuci tiga kali, masing-masing menggunakan 200 µl bufer pencuci.
Pemotongan cDNA tahap satu dengan enzim restriksi Taq I
Ke dalam tabung yang telah dicuci ditambahkan 50 µl campuran yang mengandung 5 µl 1,4 All Buffer 10X, 2 µl enzim restriksi Taq I dan 43 µl H2O, kemudian ditambahkan 2 tetes minyak mineral dan diinkubasi pada suhu 65 0C selama 2 jam. Selanjutnya larutan dibuang dari tabung dan tabung dicuci tiga kali, masing-masing menggunakan 100 µl bufer pencuci.
Pemotongan cDNA tahap dua dengan enzim restriksi Vsp I
Ke dalam tabung yang telah dicuci ditambahkan 50 µl campuran yang mengandung 5 µl 1,4 All Buffer 10X, 1 µl enzim restriksi Vsp I dan 44 µl H2O, kemudian campuran diinkubasi pada suhu 37 0C selama 2 jam. Larutan kemudian dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml.
Ligasi fragmen cDNA, Preamplifikasi, Amplifikasi selektif dan Visualisasi fragmen
Proses ligasi fragmen cDNA dengan adapter, preamplifikasi, amplifikasi selektif dan visualisasi produk cDNA-AFLP sama seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.
Preparasi sampel dengan metode satu tabung (one-tube method) menggunakan mRNA Capture Kit (Roche)
Daun yang telah berbentuk serbuk (hasil liopilisasi) ditimbang sebanyak 20 mg di dalam tabung mikro 1,5 ml, kemudian ditambahkan 200 µl lysis buffer,
di-vortek agar tercampur sempurna dan disimpan dalam kotak berisi es selama 5 menit. Sela njutnya campuran tersebut disentrifus dengan kecepatan 11.000 g selama 1 menit pada suhu 4 0C. Semua supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru, kemudian disentrifus kembali dengan kondisi sama seperti di atas dan dipindahkan ke tabung mikro yang ba ru.
Sementara itu campuran oligo(dT)20 terlabel biotin disiapkan dengan cara mencampurkan 2 µl oligo (dT)20 yang telah terlabel biotin (mRNA Capture Kit) dengan 38 µl H2O (mRNA Capture Kit). Sebanyak 4 µl campuran tersebut ditambahkan ke dalam setiap sampel, dihomogenkan dan disimpan dalam kotak berisi es selama 5 menit. Sebanyak 50 µl campuran dipindahkan ke tabung PCR yang dilapisi streptavidin (streptavidin-coated PCR tube) (mRNA Capture Kit) dan diinkubasi selama 5 menit pada 37 0C. Selanjutnya larutan dibuang, tabung dicuci 3X, masing-masing dengan 250 µl washing buffer (mRNA Capture Kit).
Sintesis cDNA utas satu dan dua serta pemotongan cDNA dengan enzim restriksi Taq I dan Vsp I dilakukan langsung di dalam streptavidin-coated PCR tube dengan cara sama seperti yang telah dijelaskan dalam metode di atas. Demikian juga proses preamplifikasi dan amplifikasi selektif serta visualisasi produk PCR, dilakukan sama seperti yang telah dijelaskan di atas.
Isolasi fragmen dari gel poliakrilamid dan amplifikasinya
Fragmen target ditandai pada film kemudian bagian film sebesar ukuran fragmen dipotong dengan menggunakan pisau bedah (scalpel) sehingga terbentuk