METODOLOGI PENELITIAN
G. Analisis hasil
2. Independent sample One Way Anova dengan taraf kepercayaan 95% Analisis statistik Independent sample One Way Anova dengan taraf
kepercayaan 95% digunakan untuk menguji apakah ada perbedaan yang bermakna antar kadar kurumin dalam ketiga nomor batch yang berbeda. Pada penelitian ini rumusan hipotesis sementara yang digunakan adalah tidak terdapat perbedaan kadar kurkumin antara batch 1, batch 2, dan batch 3.
BAB IV PEMBAHASAN
Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk Kiranti dapat digunakan dalam analisis kadar kurkimin dalam sampel dengan baik karena telah dilakukan optimasi dan validasi metode pada awal penelitian.
Pada tahap optimasi telah diperoleh komposisi fase gerak yang baik untuk pemisahan kurkumin yaitu klorofom p.a. : asam asetat glasial p.a. (95:5) dan kondisi kurkumin yang paling stabil yaitu pada pH 4. Selain itu telah dilakukan validasi metode analisis, validasi metode analisis dilakukan untuk membuktikan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi persyaratan validitas sehingga memberikan hasil analisis yang dapat dipercaya. Berdasarkan tahap validasi yang telah dilakukan pada awal penelitian disimpulkan bahwa Metode KLT-densitometri dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak kloroform p.a. :asam asetat glasial p.a. (9,5:0,5), memiliki akurasi yang baik pada konsentrasi 50-100 ppm, presisi yang baik pada konsentrasi 50-175 ppm, linearitas dan spesifisitas yang baik, serta range antara 50-100 ppm. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode KLT-densitometri ini memiliki validitas yang baik untuk menetapkan kadar kurkumin dalam sampel.
A. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini dibuat berdasarkan hasil optimasi, yaitu dengan perbandingan kloroform p.a : asam asetat glasial p.a (9,5 : 0,5). Pembuatan fase gerak dengan jenis dan komposisi tersebut bertujuan agar didapatkan polaritas fase gerak yang sesuai sehingga dapat memisahkan kurkumin dengan senyawa lain dalam sampel secara optimal. Penggunaan asam asetat glasial, sebagai salah satu komposisi fase gerak, bertujuan untuk memberikan suasana asam agar kestabilan kurkumin terjaga. Sedangkan Pembuatan fase gerak dengan menggunakan bahan-bahan pro analisis (p.a) bertujuan agar diperoleh fase gerak yang dapat berinteraksi secara baik dengan senyawa atau analit di dalam sampel, dengan tingkat kemurnian yang tinggi maka fase gerak dapat berinteraksi sempurna dengan analit sehinnga diperoleh puncak yang maksimal pada kromatogram. Kurkumin memiliki kestabilan pada pH asam, oleh karena itu dengan penambahan asam asetat glasial pada fase gerak dapat memberikan suasana asam yang bertujuan untuk menjaga kurkumin agar tidak mudah mengalami degradasi. Sistem kromatografi pada penelitian ini merupakan kromatografi fase normal, karena fase gerak pada penelitian ini bersifat non polar, sedangkan fase geraknya, yaitu silika gel bersifat polar.
B. Pembuatan pelarut (metanol pH 4)
Metanol p.a. ditambah dengan asam asetat glasial p.a. dengan perbandingan yaitu metanol p.a: asam asetat glasial p.a (9,0 : 1,0). Metanol sendiri memiliki pH 5, sehingga untuk menurunkan pHnya hingga 4, dilakukan penambahan asam asetat glasial sebanyak 1 bagian pada setiap 9 bagian metanol.pH 4 dapat diukur dengan indikator kertas pH. Pelarut dibuat dalam pH 4 (asam) karena kurkumin merupakan senyawa yang tidak stabil dalam pH basa, dapat terdegradasi pada gugus metilen aktifnya, gugus metilen pada kurkumin ini aktif karena memiliki H alfa yang sangat mudah lepas sehingga memiliki sifat cenderung asam, H alfa ini bersifat asam karena diapit oleh dua gugus karbonil yang memiliki sifat sebagai gugus penarik elektron. Ketika ada basa maka gugus metilen aktif terputus sehingga kurkumin terdegradasi.
Gambar 10. Gugus metilen aktif kurkumin = gugus metilen aktif
Apabila kurkumin terdegradasi, maka kadar yang diperoleh akan berkurang sehingga tidak dapat merepresentasikan kadar yang sebenarnya. Oleh karena itu dilakukan penetapan pH optimum kurkumin, agar diketahui pH larutan yang paling dapat menjaga stabilitas kurkumin, sehingga tidak terdegradasi selama pengerjaan.
Penggunaan metanol p.a. sebagai pelarut karena dapat melarutkan dengan baik kurkumin dan berbagai senyawanya dalam OHT cair merk Kiranti. Selain itu, metanol p.a. akan menguap setelah penotolan serta memiliki panjang gelombang 205 nm yang berbeda dengan panjang gelombang kurkumin 425 nm sehingga tidak ikut terdeteksi pada alat densitometer.
C. Penetapan λ maksimum
Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang dimana suatu larutan mempunyai serapan maksimum. Dalam penelitian ini, panjang gelombang yang diperoleh dari tahap optimasi serapan maksimum larutan baku kurkumin 425 nm. Untuk menentukan panjang gelombang maksimum digunakan tiga konsentrasi baku yaitu, 0,25mg/ml; 1,00 mg/ml; dan 1,75 mg/ml yang bertujuan untuk memastikan bahwa panjang gelombang yang diperoleh adalah senyawa kurkumin dibuktikan dengan panjang gelombang yang diperoleh pada ketiga konsentrasi reprodusibel. Penentuan panjang gelombang maksimum dengan cara mengukur pada daerah panjang gelombang 400-500 nm dengan detektor sinar visibel. Hasil pengukuran dibandingkan dengan panjang gelombang maksimum literatur yaitu 425 nm (Mohammad, dkk., 2007). Berikut ini adalah pola spektra seri larutan baku pada pengukuran panjang gelombang maksimum (425 nm).
Gambar 11. Pola spektra seri larutan baku pada pengukuran panjang gelombang maksimum
Tabel III. Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum pada seri larutan baku
Dari tabel III dapat disimpulkan serapan maksimum larutan baku kurkumin pada ketiga konsentrasi adalah 425 nm. Pengukuran panjang gelombang maksimum dalam Farmakope Indonesia edisi IV (1995) dimaknai memenuhi syarat jika tepat atau dalam batas 2 nm dari panjang gelombang yang ditentukan. Dengan demikian panjang gelombang maksimum kurkumin sesuai dengan panjang gelombang teoritis. Sehingga dapat dipastikan senyawa tersebut adalah
kurkumin. Jadi pengukuran kadar kurkumin selanjutnya akan dilakukan pada panjang gelombang 425 nm.
Pengukuran kadar kurkumin dengan metode KLT-Densitometri dilakukan pada panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang maksimum, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar, sehingga kepekaan analisis adalah maksimal.
D. Pembuatan kurva baku kurkumin
Pembuatan kurva baku ditujukan untuk melihat korelasi antar seri kadar larutan baku dengan absorbansi yang dihasilkan sehingga didapatkan persamaan kurva baku. Persamaan kurva baku yang didapat selanjutnya akan digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin yang terdapat dalam sampel. Seri larutan baku kurkumin yang digunakan adalah 0,50; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50; dan 1,75 mg/ml.
Berikut ini adalah kromatogram salah satu seri larutan baku yang diukur pada panjang gelombang 425nm.
Gambar 12. Kromatogram baku
Gambar kromatogram baku (gambar 12) menunjukkan 1 peak tunggal yang runcing. Pada kromatogram tidak terdapat peak lain dengan demikian dapat
disimpulkan bahwa peak yang dihasilkan berupa peak dari kurkumin yang memiliki nilai Rf 0,55.
Tabel IV. Data replikasi kurva baku kurkumin
Baku kurkumin
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Seri baku (ppm) AUC/100 Seri baku (ppm) AUC/100 Seri baku (ppm) AUC/100 51,5 70,099 49,5 65,286 50 66 77,25 94,033 74,25 87,858 75 88,641 103 111,592 99 111,082 100 112,986 128,75 135,354 123,75 135,778 125 134,555 154,5 154,615 148,5 156,98 150 157,746 180,25 184,44 173,25 178,188 175 182,011 A 25,0948 A 20,1123 A 19,6500 B 0,8624 B 0,9196 B 0,9245 r 0,9976 r 0,9997 r 0,9999
Kurva baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah kurva baku yang memiliki linearitas yang baik. Linearitas menyatakan adanya hubungan respon pengukuran yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi (jumlah) analit. Suatu kurva baku memiliki linearitas yang baik apabila memiliki nilai r > 0,999. Dari tabel IV dapat dilihat bahwa ketiga replikasi kurva baku telah memenuhi persyaratan linearitas yang baik, namun yang dipilih untuk digunakan pada perhitungan kadar selanjutnya adalah kurva baku replikasi III, karena memiliki nilai r yang lebih besar bila dibandingkan nilai r dari replikasi I dan II . Kurva hubungan konsentrasi kurkumin dengan AUC dapat dilihat pada gambar 11. Dengan demikian persamaan kurva baku yang digunakan adalah y=0,9245x+19,6500, dengan r = 0,9999.
Gambar 13. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/100 (replikasi III)
Korelasi yang baik antara konsentrasi dengan absorbansi dapat dilihat dari kurva tersebut dimana dengan bertambahnya konsentrasi absorbansinya juga meningkat dan membentuk garis yang linier sehingga persamaan garis yang diperoleh dapat digunakan untuk menghitung kadar kurkumin.
