Awalnya percobaan ini menggunakan rancangan percobaan RAL 2 faktorial namun terdapat beberapa perlakuan yang hilang akibat kontaminasi kultur yang cukup besar disertai banyaknya eksplan yang mengering/mati. Maka pada percobaan I pengolahan data dilakukan menggunakan RAL 1 faktor yaitu kombinasi media perlakuan.
Tahap Inisiasi
Inisiasi dilakukan pada tanggal 27 April, 11 dan 14 Mei 2010. Respon awal yang muncul dalam tahap inisiasi yaitu eksplan mulai membengkak pada minggu pertama. Sebagian besar eksplan hanya mengalami pembengkakan, sebagian lagi mulai muncul kalus pada minggu kedua dan sebagian kecil tidak menunjukkan respon yang berarti sampai minggu keempat.
Tabel 4. Respon Berbagai Varietas Bahan Eksplan Tahap Inisiasi terhadap Berbagai Media Perlakuan pada 4 MST
Perlakuan Varietas
Media Picloram (ppm) Chanee Monthong Aksis Monthong Terminal
MS 0 bengkak - kalus coklat muda
MS 1 kalus putih bengkak Bengkak
MS 2 kalus putih kalus coklat muda Bengkak
MS 3 - bengkak Bengkak
MS 4 kalus putih bengkak Bengkak
MS 5 kalus coklat muda kalus coklat muda Bengkak
B5 0 kalus putih bengkak
-B5 1 - bengkak kalus putih
B5 2 - - Bengkak
B5 3 kalus putih bengkak Bengkak
B5 4 kalus putih bengkak Bengkak
B5 5 kalus putih bengkak kalus putih
WPM 0 bengkak bengkak Bengkak
WPM 1 kalus putih bengkak kalus putih
WPM 2 kalus putih bengkak
-WPM 3 kalus putih bengkak Bengkak
WPM 4 - bengkak Bengkak
WPM 5 kalus putih bengkak kalus putih
A B
Menurut George dan Sherrington (1984) kalus merupakan kumpulan sel yang tidak terorganisir, tidak berbentuk dan terjadi karena pembelahan yang sangat aktif. Dengan adanya rangsangan dari hormon endogen atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan (eksogen) menyebabkan metabolisme sel menjadi aktif. Dalam keadaan demikian jaringan dikatakan sedang mengalami dedifferensiasi. Keadaan ini terus berlangsung selama proliferasi kalus.
Jika melihat respon pada tahap inisiasi ini, embrio zigotik durian Chanee terlihat lebih responsif dibandingkan durian Monthong. Dari 18 jenis media perlakuan yang diujikan (Tabel 4), embrio zigotik durian Chanee memberikan respon bengkak pada 2 media perlakuan, berkalus pada 12 media perlakuan dan ada juga eksplan yang tidak memberikan respon. Sedangkan embrio zigotik durian Monthong memberikan respon berkalus hanya pada dua media perlakuan untuk embrio bagian aksis dan pada lima media perlakuan untuk embrio bagian terminal.
Gambar 7. Tipe Kalus: (A) Kalus Tipe 1, (B) Kalus Tipe 2
Terdapat dua tipe kalus yang terlihat pada tahap ini. Tipe yang pertama (Tipe 1) yaitu kalus putih yang memiliki ciri-ciri struktur kalusnya kompak dan tumbuh secara berkelompok di salah satu sisi eksplan (Gambar 7a). Sedangkan kalus Tipe 2 berwarna coklat muda, struktur kalusnya remah dan menyebar di seluruh permukaan eksplan (Gambar 7b). Kedua tipe kalus ini hampir mirip dengan kalus Kakao yang berhasil diinduksi oleh Maximova et al. dalam penelitian yang mereka lakukan pada tahun 2002. Menurut Maximova et al. (2005) kalus yang berasal dari eksplan staminodes kakao memiliki 2 tipe kalus, tipe pertama kalus putih yang jika dilihat di bawah mikroskop selnya terlihat
memanjang, dari kumpulan kalus tipe ini tidak pernah ada yang berkembang menjadi embrio somatik. Tipe kedua terdiri dari sel-sel bulat berwarna coklat terang hingga coklat gelap dan friable (remah). Kumpulan sel tipe ini seringkali ditemukan berasosiasi dengan embrio somatik. Kalus pada kakao dan durian memiliki penampakan yang hampir sama kemungkinan karena kedua tanaman ini berkerabat dekat (berasal dari satu Famili yaitu Malvaceae).
Tahap Subkultur I (SK I)
Parameter yang diamati pada tahap subkultur I ini adalah persentase eksplan berkalus. Pada tiap varietas terdapat beberapa perlakuan yang tidak terisi data, hal ini terjadi karena kultur mengalami kontaminasi sehingga tidak memenuhi ulangan. Jika dibandingkan dengan respon kultur pada saat inisiasi, pada subkultur I ini varietas Monthong mengalami perkembangan respon kalus yang cukup pesat, terlihat dari banyaknya eksplan yang mulai berkalus pada berbagai perlakuan media dan persentase eksplan berkalus yang cukup tinggi jika dibandingkan dengan varietas Chanee.
Eksplan dari embrio zigotik durian Chanee memiliki kalus yang sedikit dan kalusnya cepat berubah warna. Sehingga pada subkultur berikutnya, kalus durian Chanee mengalami perubahan warna yang cukup drastis, sebagian besar kalusnya mencoklat lalu kering dan mati, dan sebagian lagi terkontaminasi oleh cendawan dan bakteri (7 perlakuan), sehingga hanya sedikit yang mampu bertahan sampai akhir penelitian.
Sementara untuk eksplan yang berasal dari embrio zigotik dewasa durian varietas Monthong, meskipun responnya terhadap media perlakuan agak lambat, yaitu sebagian besar kalus baru muncul pada subkultur I (eksplan berumur 5-8 MST), namun kalus yang dihasilkan lebih banyak, proliferasi kalusnya lebih cepat sementara pola perubahan warnanya lebih lambat, sehingga kalus dari varietas Monthong inilah yang dominan dipakai dalam percobaan berikutnya (percobaan II dan percobaan III).
Perlakuan media berpengaruh nyata terhadap rata-rata persentase eksplan berkalus yang berbeda sangat nyata pada semua jenis eksplan (Tabel 5). Persentase eksplan berkalus untuk eksplan varietas Monthong cukup tinggi pada
media MS hampir semua taraf konsentrasi picloram. Pada eksplan embrio zigotik Monthong bagian aksis, kalus berhasil diinisiasi pada eksplan sebesar 100% pada media MS dengan tambahan Picloram 2, 3 dan 5 ppm, sedangkan untuk eksplan bagian terminal pada media MS yang dilengkapi dengan Picloram 1, 3 dan 5 ppm. Untuk varietas Chanee, media yang menunjukkan rata-rata persentase eksplan berkalus tertinggi adalah media B5 + picloram 4 ppm, yaitu mencapai 100%.
Tabel 5. Pengaruh Jenis Media dan ZPT terhadap Rata-rata Persentase Eksplan Berkalus Tahap Sub Kultur I pada 4 MST
Perlakuan Embrio
Chanee
Monthong
Media Picloram (ppm) Embrio Aksis Embrio Terminal
MS 0 - - 66.67 ab MS 1 - 74.7 abc 100.0 a MS 2 12.5 e 100.0 a 90.0 a MS 3 - 100.0 a 100.0 a MS 4 64.2 a-d - - MS 5 80.0 ab 100.0 a 100.0 a B5 0 36.3 cde 36.1 cde 0.0 d B5 1 - 13.0 e 26.7 bcd B5 2 - 47.6 b-e 20.0 cd B5 3 25.0 e 23.3 de 62.5 abc B5 4 100.0 a 66.7 a-d 83.3 a B5 5 70.7 abc 74.7 ab - WPM 0 - 6.7 e 58.7 abc WPM 1 46.0 b-e 33.3 cde 13.3 d WPM 2 26.1 e 29.0 cde - WPM 3 70.8 abc 0.0 e 21.7 bcd WPM 4 - 0.0 e 80.0 a WPM 5 28.3 de 0.0 e 22.5 bcd Pr > F 0.0018 0.0001 0.0001 KK (%) 28.35 (34.50) 42.49 (57.24) 30.37 (40.66) Keterangan : Tanda – menunjukkan bahwa data tidak diperoleh karena eksplan mati atau
kontaminasi kultur. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji DMRT dengan α=5%. Angka didalam kurung menunjukkan nilai KK sebelum ditransformasi, data ditransformasi dengan rumus �+ 0.5
Data hasil penelitian menunjukkan bahwa media MS mampu menginduksi kalus pada eksplan embrio zigotik durian Monthong dengan persentase tinggi. Sejalan dengan penelitian yang dilakukan Helmi (2009) mengenai embriogenesis
somatik manggis yang memperoleh hasil bahwa media MS sangat nyata menginduksi lebih banyak eksplan untuk membentuk kalus yang diduga embriogenik dibandingkan dengan media B5 dan WPM. Namun sampai disini belum dapat dipastikan apakah kalus yang terbentuk dari embrio zigotik durian Monthong ini adalah kalus embriogenik.
Tahap Subkultur II (SK II)
Eksplan yang digunakan pada subkultur II merupakan eksplan berkalus pada tahap sub kultur I, sehingga paket perlakuan pada subkultur II tidak selengkap pada subkultur I, hanya tersisa 9 perlakuan saja, seperti terlihat pada Tabel 6 dan Tabel 7. Hasil yang berbeda nyata antar perlakuan dapat terlihat pada parameter rata-rata diameter eksplan berkalus (2-4 MST) (Tabel 6), rata-rata persentase kalus remah dan rata-rata skor kalus (Tabel 7). Pada parameter rata-rata persentase eksplan berkalus hasil yang ditunjukkan antar perlakuan sangat berbeda nyata.
Tabel 6. Pengaruh Jenis Media dan ZPT terhadap Bobot dan Diameter Eksplan Berkalus Tahap Sub Kultur II
Perlakuan Bobot 4 MST (g) Diameter (cm) Media Picloram (ppm) 1 MST 2 MST 3 MST 4 MST MS 1 0.02 b 0.04 b 0.34 b 0.50 b 0.59 b WPM 0 0.04 b 0.09 b 0.22 b 0.41 b 0.66 b WPM 3 0.02 b 0.00 b 0.36 b 0.39 b 0.44 b WPM 4 0.09 b 0.10 b 0.55 b 0.96 b 1.28 b WPM 5 0.00 b 0.00 b 0.25 b 0.25 b 0.25 b B5 0 0.11 b 0.22 ab 1.03 ab 1.29 b 1.53 b B5 3 0.39 a 0.50 a 1.92 a 2.79 a 3.63 a B5 4 0.02 b 0.00 b 0.10 b 0.17 b 0.53 b B5 5 0.04 b 0.00 b 0.13 b 0.25 b 0.49 b Pr > F 0.0004 0.1179 0.0413 0.0373 0.0401 KK (%) 7.67 (133.87) 15.93 (217.62) 31.88 (137.95) 36.54 (134.89) 37.19 (124.48) Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata
pada uji DMRT dengan α=5%. Angka didalam kurung menunjukkan nilai KK sebelum ditransformasi, data ditransformasi dengan rumus �+ 0.5
Pada parameter pertambahan bobot, diameter, persentase eksplan berkalus dan skor kalus, kombinasi media B5 dengan tambahan picloram 3 ppm merupakan media yang menunjukkan hasil tertinggi. Eksplan pada media tersebut mengalami rata-rata penambahan bobot sebesar 0.39 gram dan diameter 3.63 cm setelah dikultur selama 4 MST, dengan 100% eksplan berkalus dan mampu membentuk kalus yang baru dengan skor kalus 3.5 yang artinya rata-rata persentase penutupan eksplan oleh kalus mencapai 87.5% (Tabel 5 dan Tabel 6).
Tabel 7. Pengaruh Jenis Media dan ZPT terhadap % Eksplan Berkalus, % Kalus Berstruktur Remah, Skor, dan Warna Kalus Tahap Sub Kultur II pada 4 MST Perlakuan % Eksplan Berkalus % Kalus Remah Skor Kalus Warna Kalus Media Picloram (ppm) MS 1 50.00 b 50.00 ab 0.50 c coklat WPM 0 96.43 a 71.43 a 2.76 ab kc, cm WPM 3 95.00 a 40.00 ab 2.15 abc pk, cm, c WPM 4 65.00 ab 00.00 b 1.93 abc putih WPM 5 50.00 b 25.00 ab 1.13 bc p,c B5 0 86.90 a 00.00 b 2.05 abc p, pk, pc B5 3 100.0 a 33.33 ab 3.50 a pk, c B5 4 65.00 ab 60.00 ab 1.05 bc p, cm, c B5 5 49.43 b 00.00 b 0.98 c p, cm Pr > F 0.0042 0.0357 0.0108 KK (%) 28.43 22.72 (113.93) 22.56 (55.12)
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji DMRT dengan α=5%. Warna kalus : p = putih, pk = putih kekuningan, pc = putih kecoklatan, kc = kuning kecoklatan, cm = coklat muda, c = coklat. Angka didalam kurung menunjukkan nilai KK sebelum ditransformasi, data ditransformasi dengan rumus �+ 0.5
Kombinasi 9 perlakuan yang tersisa menunjukkan persentase kalus berstruktur remah tertinggi terdapat pada media WPM tanpa tambahan ZPT yaitu sebesar 71.43 %. Kalus yang berstruktur remah tersebut teramati memiliki warna kalus putih kekuningan, kuning kecoklatan, coklat muda atau coklat dan agak bening (Gambar 8). Menurut Bhojwani dan Razdan (1989) kalus embriogenik dicirikan tidak kompak, mudah memisah (friabel) dan berwarna agak bening.
Namun sampai disini belum dapat dipastikan apakah kalus durian yang dihasilkan pada tahap ini embriogenik atau tidak.
Gambar 8. Kalus Berstruktur Remah