ABSTRAK
Uji tantang dilakukan untuk mengevaluasi korelasi keberadaan marka ketahanan terhadap KHV (Cyca-DAB1*05, MHC II) terhadap kelangsungan hidup keturunan ikan mas dari 10 kombinasi persilangan. Sebanyak 30 ekor ikan umur 90 hari dari setiap persilangan diinjeksi KHV secara intraperitonial, dan kemudian ikan dipelihara selama tiga minggu dalam akuarium yang berbeda dan diberi aerasi. Uji tantang dilakukan di dalam laboratorium dengan suhu air 18-22
˚C. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kelangsungan hidup (KH) pada persilangan yang salah satu induknya atau kedua induknya membawa Cyca- DAB1*05 pada umumnya memiliki nilai yang KH yang cukup tinggi, lebih dari 50%. Deteksi marka Cyca-DAB1*05 pada individu yang hidup setelah uji tantang terlihat bahwa turunan persilangan salah satu atau kedua induknya membawa marka Cyca-DAB1*05 adalah membawa marka tersebut dengan kisaran 70-100%. KH yang tinggi pada ikan mas hasil persilangan Tn x 0n dan Tn x Mn yang tidak memiliki marka Cyca-DAB1*05 diduga melibatkan jalur MHC I.
Kata kunci: Cyca-DAB1*05, kelangsungan hidup, uji tantang, virus KHV.
ABSTRACT
Challenge test was performed to evaluate correlation between the existence of Cyca-DAB1*05 MHC II marker and survival rate of common carp progenies from 10 crossbred combination. At amount of 30 fish of each crossbred at 90 days old were intraperitonially injected KHV, and fish were reared for three weeks in different aquarium. Challenge test was performed in indoor laboratory and water temperature was 18-22 ˚C. The results showed that the survival rate in a crossbred which have parent bearing the Cyca-DAB1*05 generally have survival rate more than 50%. The existence of Cyca-DAB1*05 marker on survived fish after challenge test were ranged between 70 to 100%. The highest survival rate in Tn x 0n and Tn x Mn crossbred maybe involving the MHC I immunity pathway.
27 Pendahuluan
Pada tahun 2002, wabah penyakit yang disebabkan oleh KHV telah menyerang ikan mas dan koi di Indonesia dan menyebabkan kematian massal pada ikan mas dan koi. Sejak munculnya wabah KHV, wabah ini tidak pernah hilang secara sempurna dan acap kali berulang, terlebih pada musim hujan dan menginfeksi semua umur/ukuran ikan. Kematian yang diakibatkan sekitar 80- 100% dari total populasi ikan dengan masa inkubasi 1-7 hari (Taukhid et al. 2010). Infeksi KHV dipicu oleh penurunan suhu lingkungan. Individu yang bertahan hidup pada saat terjadi wabah umumnya akan menjadi tahan terhadap serangan berikutnya. Namun demikian, daya tahan tersebut tidak menunjukkan adanya transfer kepada keturunannya (Taukhid et al. 2010). Keberadaan ikan mas yang tahan terhadap serangan KHV merupakan salah satu alternatif solusi untuk mengatasi permasalahan serangan KHV.
Seleksi berbasis teknologi marka molekuler dapat menjadi solusi awal untuk mengatasi hal tersebut. Seleksi dengan bantuan marka molekuler (MAS/
marker-assisted selection) adalah suatu proses seleksi yang dilakukan berdasarkan
pemilihan genotipe dengan menggunakan marka molekuler (Liu dan Cordes 2004). Marka yang berasosiasi dengan karakter yang diinginkan dapat digunakan sebagai petunjuk keberadaan lokus penentu karakter dimaksud pada ikan. Marka mikrosatelit sangat berguna sebagai langkah awal dalam menentukan individu ikan untuk kegiatan MAS. Salah satu keuntungan menggunakan marka DNA dalam program pemuliaan pada akuakultur adalah memungkinkan untuk mengidentifikasi calon induk, yang memiliki breeding value untuk dipijahkan, pada saat ikan masih berukuran kecil. Hal ini akan mengurangi kebutuhan memelihara ikan dalam jumlah besar untuk diuji progeny (Hayes dan Andersen 2005). Dengan menggunakan marka mikrosatelit pada persilangan ikan trout Rodriguez et al. (2004) berhasil mendapatkan beberapa marka yang berasosiasi dengan ketahanan terhadap virus IPN.
Berdasarkan hasil penelitian, Rakus et al. (2008) melaporkan bahwa ikan mas yang memiliki ketahanan tubuh yang kuat terhadap serangan KHV adalah ikan yang kebal secara genetik karena di badannya memiliki gen-gen major
histocompatibility complex (MHC) II. Hal lain yang telah dibuktikan oleh Rakus
et al. (2008) adalah pada ikan mas Polandia (European common carp) adanya alel
Cyca-DAB1*05 kelompok MHC II telah membuat ikan mas lebih tahan terhadap serangan KHV. Pada ikan mas di Indonesia, telah dilaporkan juga bahwa marka Cyca-DAB1*05 terkait dengan daya tahan ikan mas terhadap infeksi KHV (Alimuddin et al. 2011). Pada penelitian ini dilakukan persilangan antara individu ikan mas yang membawa marka terkait pertumbuhan (Cca-08) dan ketahanan terhadap KHV (Cyca-DAB1*05). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi korelasi keberadaan marka Cyca-DAB1*05 pada populasi hasil persilangan dengan kombinasi berbeda dengan daya tahan terhadap serangan KHV.
28
Bahan dan Metode Waktu dan tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada Februari 2013 sampai dengan Desember 2013. Identifikasi ikan mas yang membawa marka Cyca-DAB1*05 dilakukan di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Departemen Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Uji tantang virus KHV dilakukan di Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) Sukabumi Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya KKP.
Penyediaan ikan uji
Ikan mas yang diuji tantang adalah ikan mas hasil perkawinan antara induk yang memiliki marka Cca-08 dan atau marka Cyca-DAB1*05 sesuai kombinasi persilangan seperti Tabel 3 pada penelitian tahap kedua. Ikan uji telah dipelihara selama 90 hari dalam hapa yang dipasang di kolam.
Pengganasan virus KHV
Virus KHV berasal dari Laboratorium Kesehatan Ikan BBPBAT Sukabumi. Virus ini diperoleh dengan dengan cara mengambil 1 gram insang ikan yang positif terkena KHV dan dilarutkan dalam NaCl fisiologis, sehingga menghasilkan konsentrat virus 10% (w/v). Virus disuntikkan kepada 50 ekor ikan mas majalaya ukuran 5-8 cm masing-masing sebanyak 0.1 ml. Setelah hari kelima penyuntikan terjadi kematian massal. Ikan-ikan yang mati ini diperiksa untuk memastikan akibat infeksi KHV. Dari ikan yang mati dan positif KHV diambil insangnya kemudian dilarutkan dalam NaCl fisiologis, sehingga menghasilkan konsentrat virus 10% (w/v), selanjutnya ditumbuk halus, dan kemudian disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4 ˚C. Supernatan merupakan suspensi virus KHV. Sebelum dipakai untuk menginfeksi, bahan inokulan baku virus tersebut diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis untuk mendapatkan konsentrasi 10-5.
Uji tantang dan analisis gambaran darah
Uji tantang dilakukan terhadap seluruh kombinasi persilangan. Untuk setiap persilangan digunakan ikan sebanyak 30 ekor, yang telah diadaptasi selama 14 hari dalam akuarium (ukuran 60x40x40 cm3). Setelah itu, ikan mas diinjeksi
secara intraperitoneal dengan virus KHV sebanyak 0.1 ml per ekor ikan. Uji tantang dilakukan selama 30 hari, dan ikan diberi pakan komersial (PF 100) at
satiation. Air di akuarium selama masa pemeliharaan diaerasi dan diganti
sebanyak 50% setiap dua hari. Ikan dipelihara pada ruang dengan suhu air 18-22
˚C.
Parameter uji dan analisis statistik
Ikan yang mati diamati setiap hari untuk menghitung kelangsungan hidupnya. Data diolah secara statistik dengan menggunakan ANOVA. Pada akhir penelitian, sampel darah diambil sebanyak 5 ml untuk dianalisis kondisi indeks fagosit, hematokrit, limfosit dan total leukosit. Ikan-ikan yang masih hidup pada setiap persilangan dianalisis keberadaan marka Cyca-DAB1*05 dengan metode seperti dijelaskan Alimuddin et al. (2011).
29
Hasil
Uji tantang terhadap ikan mas dari setiap persilangan seluruh perlakuan memberikan hasil kelangsungan hidup seperti Gambar 4. Kelangsungan hidup ikan pada setiap persilangan lebih dari 50%, kecuali pada persilangan Mn x 0n dan Mn x Mn. Kelangsungan hidup tertinggi terjadi pada persilangan Tn x 0n.
60.61 86.70 60.00 52.94 85.71 20.00 32.14 78.57 100.00 85.71 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 M+T+ M+0- M+M- M+T- M-T+ M-0- M-M- T-T+ T-0- T-M-
Gambar 5. Kelangsungan hidup ikan mas hasil uji tantang dengan virus KHV pada sepuluh kombinasi persilangan. M = induk membawa Cca-08 homosigot; T = induk membawa Cca-08 heterosigot; 0 = induk tidak membawa Cca-08; p = induk membawa Cyca-DAB1*05; n = induk tidak membawa Cyca-DAB1*05.
Hasil analisis keberadaan marka Cyca-DAB1*05 pada ikan hasil uji tantang yang hidup memperlihatkan data yang tersaji pada Tabel 8. Secara umum terlihat pada persilangan yang induknya membawa marka Cyca-DAB1*05, turunannya yang hidup setelah uji tantang juga membawa marka Cyca-DAB1*05, dan persilangan yang induknya tidak membawa Cyca-DAB1*05 turunannya yang hidup setelah uji tantang tidak membawa marka Cyca-DAB1*05. Pada persilangan Mn x 0n tidak diperoleh data dikarenakan analisis tidak berhasil.
30
Tabel 8. Hasil analisis keberadaan marka Cyca-DAB1*05 ikan hasil uji tantang yang hidup pascauji tantang dengan KHV
Persilangan
(betina x jantan) Jumlah ikan yang dianalisis
Keberadaan Cyca-DAB1*05 (%) Keterangan 300bp 1000bp Jumlah Mp x Tp 10 80 - 80 Mp x 0n 10 100 - 100 Mp x Mn 10 70 30 100 Mp x Tn 5 80 - 80 Mn x Tp 5 80 - 80
Mn x 0n - - - - Analisis tidak berhasil
Mn x Mn 5 0 0 0 Tidak memiliki Cyca-DAB1*05
Tn x Tp 10 80 - 80
Tn x 0n 5 0 0 0 Tidak memiliki Cyca-DAB1*05
Tn x Mn 5 0 0 0 Tidak memiliki Cyca-DAB1*05
Keterangan: M = induk membawa Cca-08 homosigot; T = induk membawa Cca-08 heterosigot; 0 = induk tidak membawa Cca-08; p = induk membawa Cyca-DAB1*05; n = induk tidak membawa Cyca-DAB1*05.
Gambaran darah ikan pada setiap kombinasi persilangan di akhir masa uji tantang tersaji pada Tabel 9. Nilai hematokrit seluruh persilangan berada pada kisaran 22- 34, aktivitas fagositas pada kisaran 63-90, limfosit 71-99 dan total leukosit di atas 5.79x105.
Table 9 Gambaran darah ikan yang hidup pada setiap kombinasi persilangan di akhir masa pemeliharaan uji tantang
Kombinasi
persilangan Hematokrit
Aktivitas
Fagositas Limfosit Total Leukosit
Mp x Tp 25.5 65.0 78.5 8,4x105 Mp x 0n 22.0 90.0 71.5 5.79x105 Mp x Mn 34.0 60.0 93.0 8.91x105 Mp x Tn 27.5 83.5 86.5 7.68x105 Mn x Tp 35.0 77.0 73.5 8.59x105 Mn x 0n 30.0 63.0 89.5 7.34x105 Mn x Mn 33.0 79.0 93.0 8.59x105 Tn x Tp 23.5 86.5 88.0 7.07x105 Tn x 0n 32.0 75.0 99.0 7,44x105 Tn x Mn 30.0 70.0 94.5 7,47x105
Keterangan: M = induk membawa Cca-08 homosigot; T = induk membawa Cca-08 heterosigot; 0 = induk tidak membawa Cca-08; p = induk membawa Cyca-DAB1*05; n = induk tidak membawa Cyca-DAB1*05.
Pembahasan
Berdasarkan hasil uji tantang terhadap serangan KHV, terlihat bahwa kelangsungan hidup ikan mas dari persilangan yang salah satu induknya atau kedua induknya membawa Cyca-DAB1*05 pada umumnya memiliki nilai yang kelangsungan hidup yang cukup tinggi, di atas 50 %. Hal tersebut selaras dengan keberadaan marka Cyca-DAB1*05 (berukuran 300 bp) pada individu yang hidup setelah uji tantang yang menunjukkan individu yang hidup membawa Cyca-
31 DAB1*05 dengan kisaran 70-100%. Selain itu terdeteksi juga keberadaan Cyca- DAB1*05 yang berukuran 1000 pasang basa. Persilangan antara Tn x 0n dan Tn x Mn di mana tidak ada induknya yang membawa Cyca-DAB1*05 memberikan kelangsungan hidup yang tinggi pada turunannya. Hal ini diduga melibatkan jalur imunitas lain dalam respons kekebalan tubuh ikan mas terhadap KHV, yaitu melalui jalur MHC I. MHC kelas I secara spesifik terlibat dalam mengeliminir infeksi virus melalui mekanisme sitotoksik, sedangkan MHC kelas II akan mengaktifkan sel-sel fagosit untuk memproduksi antibodi dan mengaktifkan karakter imunologi yang terlibat dalam mengeliminasi parasit dan bakteri serta menetralkan virus. Hal lain juga yang dapat diduga adalah berdasarkan penelitian Taukhid et al. (2010) yaitu individu yang bertahan hidup pada saat terjadi wabah umumnya akan menjadi tahan terhadap serangan berikutnya, tetapi ketahanan tersebut tidak menunjukkan adanya transfer kepada keturunannya. Ketiadaan daya tahan terhadap KHV pada keturunan ikan tersebut diduga karena persilangan yang dilakukan tidak terarah dengan baik. Selain itu, sebagian ikan yang hidup tersebut kemungkinan bukan karena secara genetik.
Berdasarkan perhitungan dengan menggunakan ANOVA terlihat bahwa kelangsungan hidup pada persilangan Tn x Tp tergolong cukup tinggi yaitu berkisar 78,57% dengan standar deviasi 20,02% yang artinya kelangsungan hidup tertinggi pada persilangan Tn x Tp bisa mencapai 98,59%. Selain itu persilangan Mn x 0n, Mn x Tp, Tn x Tp dan Tn x Mn tidak berbeda nyata dan memiliki nilai kelangsungan hidup yang tinggi. Kelangsungan hidup yang tinggi pada persilangan Mp x 0n, Mn x Tp, Tn x Tp sejalan dengan keberadaan Cyca- DAB1*05 yang diturunkan dari tetuanya.
Gambaran darah ikan penting artinya untuk menjelaskan kondisi kesehatan ikan. Penyimpangan fisiologis ikan akan menyebabkan komponen darah juga mengalami perubahan. Perubahan gambaran darah dan kimia darah baik secara kualitatif maupun kuantitatif dapat menentukan kondisi ikan atau status kesehatannya. Beberapa parameter imunitas seperti kadar leukosit, hematokrit dan aktivitas fagositosis, dapat dijadikan parameter evaluasi untuk melihat respons ikan terhadap infeksi bakteri, virus maupun pemberian imunostimulan (Zhang et al. 2012).
Limfosit berperan penting dalam pembentukan antibodi (Bratawidjaja, 2006). Kadar limfosit pasca uji tantang relatif tidak berbeda nyata antar perlakuan kecuali untuk perlakuan Mn x Tp dan perlakuan Mp x 0n memiliki kandungan limfosit berturut-turut 76.5% dan 71.5% (Tabel 9). Hal ini dapat memberikan gambaran bahwa sel sel dalam tubuh ikan membentuk antibodi agar ikan lebih tahan terhadap infeksi KHV.
Hematokrit merupakan persentase volume eritrosit dalam darah ikan, bila hematokrit 30 (30%) berarti darah terdiri dari 30% eritrosit dan 70% plasma dan leukosit. Kandungan hematokrit ikan uji tertinggi sebesar 34%, sedangkan terendah sebesar 22%. Semakin besar jumlah sel darah merah, maka kadar hematokrit semakin meningkat. Apabila ikan terserang penyakit, infeksi/luka atau kehilangan nafsu makan karena sebab-sebab yang tidak jelas nilai hematokrit akan menjadi lebih rendah. Hasil pemeriksaan terhadap hematokrit dapat dijadikan sebagai salah satu patokan untuk menentukan keadaan kesehatan ikan, nilai hematokrit kurang dari 22% menunjukkan terjadinya anemia. Kadar hematokrit ini bervariasi tergantung pada faktor nutrisi, umur ikan, jenis kelamin, ukuran
32
tubuh dan masa pemijahan (Kuswardani, 2006). Pada penelitian ini seluruh perlakuan memperlihatkan nilai hematokrit dalam kisaran baik yaitu lebih dari 22%.
Kandungan leukosit berbanding lurus dengan kemampuan fagositosis karena fungsi leukosit yang utama adalah untuk menelan seluruh benda/ protein yang dianggap asing oleh tubuh. Nilai leukosit tertinggi sebesar 8.59x105/mm3, sedangkan yang terendah sebesar 5.79x105/mm3. Jika nilai pada masing-masing perlakuan dibandingkan dengan jumlah leukosit pada ikan normal yaitu sebesar 2.742x104 sel/mm3, maka semua jumlah leukosit pada perlakuan berada di atas
kondisi normal. Tingginya jumlah leukosit pada masing-masing perlakuan disebabkan oleh tingkat stres pada ikan dan juga akibat infeksi.
Nilai kelangsungan hidup, dan indeks fagositik cukup beragam antar persilangan. Nilai kelangsungan hidup tertinggi sebesar 100%, sedangkan yang terendah 20,00. Nilai indeks fagositik berbanding lurus dengan kandungan leukosit dalam darah. Nilai fagositik tertinggi diperoleh pada perlakuan Mp x 0n (90,00%) dan terendah diperoleh pada perlakuan Mn x 0p (63,00%).
Ikan memiliki mekanisme pertahanan sendiri terhadap antigen yang masuk ke dalam tubuh. Kemampuan ikan dalam menangani penyakit akibat masuknya bibit penyakit/organisme patogen sangat bergantung pada sistem imun yang dimiliki oleh ikan yang bersangkutan. Secara umum pada tubuh ikan terdapat dua sistem imun, yaitu sistem imun yang bersifat spesifik dan sistem imun bersifat humoral. Suatu sistem imun spesifik dirancang untuk mengeliminasi antigen tunggal misalnya hanya efektif pada satu jenis patogen tertentu saja. Apabila ada bakteri atau virus masuk ke dalam aliran darah diduga akan dikenali sebagai antigen dan merangsang tubuh untuk membentuk antibodi. Jika terpapar dalam waktu yang lebih lama maka tubuh ikan memiliki mekanisme memori yang akan mengingat setiap benda atau protein asing yang sama untuk waktu tertentu.
Pada ikan mas yang memiliki marka Cyca-DAB1*05 diharapkan memiliki kemampuan untuk mengenali dan membentuk sistem imun terutama terhadap virus KHV. Sistem imun yang ada merupakan serangkaian proses yang kompleks yang diawali dengan masuknya protein asing (bakteri/virus), proses pengenalan, pengingatan, dan penghancuran (Sugiani, 2013). Tanggap kebal alami terjadi seketika apabila ada patogen masuk ke dalam inang, faktor humoral bawaan yang terdapat di serum dan mukus ikan akan melakukan perlawanan pasif dengan menghancurkan patogen.
Data hasil penelitian menunjukkan pola yang beragam pada gambaran darah ikan mas yang diamati. Dari keseluruhan rangkaian diketahui bahwa tidak semua persilangan ikan mas memiliki sistem imunitas yang cukup dalam menghadapi infeksi virus KHV.
Kesimpulan
Keturunan hasil persilangan yang membawa marka Cyca-DAB1*05 memperlihatkan kelangsungan hidup di atas 50%, dengan nilai tertinggi diperoleh pada persilangan Tn x Tp. Kelangsungan hidup tinggi pada ikan persilangan Tn x 0n dan Tn x Mn diduga melibatkan jalur imunitas lain dalam respons infeksi KHV. Keberadaan marka Cyca-DAB1*05 memberikan kelangsungan hidup yang
33 cukup tinggi pada hasil uji tantang. Keberadaan marka Cyca-DAB1*05 pada ikan yang hidup setelah uji tantang berkisar 70-100%.
34