MENGGUNAKAN MAS
ABSTRAK
Marker assisted selection (MAS) atau seleksi dengan bantuan marka dapat
mempercepat pencapaian target seleksi. Pada ikan mas di Indonesia, telah dilaporkan bahwa marka Cca-08 terkait pertumbuhan cepat pada ikan mas dan marka Cyca-DAB1*05 terkait dengan daya tahan ikan mas terhadap infeksi KHV. Persilangan antara ikan mas yang membawa salah satu atau kedua marka tersebut diharapkan menghasilkan keturunan ikan mas tumbuh cepat dan tahan terhadap KHV. Penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi keberadaan marka Cca-08 dan Cyca-DAB1*05 pada keturunan 10 kombinasi persilangan ikan mas. Turunan setiap kombinasi persilangan dipelihara selama 30 hari dengan tiga ulangan. Sebanyak 10 mg sampel jaringan dari 30 ekor ikan secara acak pada setiap kombinasi persilangan diambil untuk dianalisis keberadaan Cca-08 dan Cyca- DAB1*05. Hasil analisis memperlihatkan bahwa marka Cca-08 terdeteksi dan diwariskan pada turunannya, namun tidak seluruh turunannya membawa Cca-08. Keberadaan marka ketahanan terhadap KHV diwariskan kepada turunannya dengan frekuensi yang berbeda. Pada hasil persilangan antara betina homosigot membawa Cyca-DAB1*05 dengan jantan heterosigot membawa Cyca-DAB1*05, keberadaan marka ketahanan terhadap KHV sebesar 5%, nilai ini sangat rendah mengingat kedua induknya memiliki marka Cyca-DAB1*05. Frekuensi keberadaan marka terkait ketahanan terhadap KHV terbesar terlihat pada hasil persilangan antara induk betina homosigot membawa Cyca-DAB1*05 dengan jantan yang tidak membawa Cca-08 dan Cyca-DAB1*05.
Kata kunci: Cca-08, Cyca-DAB1*05, MAS, pewarisan
ABSTRACT
Marker assisted selection (MAS) can accelerate achieving target of selection. Indonesian common carp has been reported to have DNA marker of Cca-08 which related to fast growth and Cyca-DAB1*05 associated with resistance to koi herpesvirus (KHV). Crossbred between parent stock have one or both of these markers are expected to produce fast grow and resistant to KHV common carp. This research was conducted to evaluate the existence of Cca-08 and Cyca-DAB1*05 markers on progenies of ten common carp crossbreds. Progenies were kept for 30 days with three replicates. Tissue samples from every combination of crossbred were analyzed to examine the existence of Cca-08 and Cyca-DAB1*05 markers. Results showed that Cca-08 marker were detected and inherited to offsprings, but not all of them bearing the marker. Cyca-DAB1*05 marker was detected on offsprings with different frequencies. Crossbred between
14
female bearing homozygote Cca-08 and Cyca-DAB1*05 with males bearing heterozygote Cca-08 and Cyca-DAB1*05 gave the lowest percentage of progeny having KHV- linked marker (5%), this value was very low considering both parent has Cyca-DAB1*05 marker. The highest percentage of progeny having the Cyca-DAB1*05 marker was found on crossbred between a female bearing homozygote Cca-08 and Cyca-DAB1*05 with males do not have both markers. Key words: Cca-08, Cyca-DAB1*05, inheritance, MAS.
Pendahuluan
Ikan mas relatif mudah untuk beradaptasi, sebagai konsekuensinya maka variasi karakter kualitatif dan kuantitatif serta keragaman genetiknya mengalami perubahan. Penurunan keragaman genetik akibat hilangnya alel-alel (genetic drift) dari hasil pembenihan dapat mengakibatkan terhambatnya laju pertumbuhan dan rendahnya ketahanan ikan terhadap serangan penyakit dan perubahan lingkungan (Thai et al. 2007). Ikan mas di Indonesia telah mengalami masa kritis dalam pengembangannya sebagai akibat dari menurunnya kualitas induk, serangan koi hervesvirus (KHV) serta tingginya harga pakan (Nugroho, 2007).
Program pemuliaan ikan yang efisien dan sistematik dapat mendukung peningkatan produksi, mengurangi biaya operasional, perbaikan resistensi terhadap penyakit, perbaikan pemanfaatan sumber daya pakan dan perbaikan kualitas produksi (Gjedrem 2005). Peningkatan produksi dan produktivitas ikan mas telah dilakukan dengan beberapa cara di antaranya dengan memperbaiki kualitas induk melalui kegiatan seleksi. Seleksi dilakukan terhadap ikan dengan memperhatikan beberapa parameter seperti mempunyai penampilan unggul, baik dalam pertumbuhan maupun ketahanan terhadap penyakit. Menurut Tave (1983) seleksi adalah program pemuliaan yang memanfaatkan keragaman fenotipe yang diteruskan dari tetua kepada keturunannya. Keragaman fenotipe adalah akumulasi interaksi antara keragaman genetik dengan keragaman lingkungan serta interaksi antara variasi lingkungan dan genetik. Harapan dari hasil seleksi adalah induk ikan yang dipilih akan mewariskan superioritasnya kepada turunannya (Tave 1995).
Dunham (2004) menyatakan bahwa marka DNA diperlukan untuk mempelajari genom, melakukan pemetaan keterkaitan gen, lokasi gen pada kromosom, isolasi gen, menentukan ekspresi gen, mempelajari mekanisme molekuler dan biokimia dari suatu performa/penampilan, melakukan analisis genetika populasi dan aplikasi seleksi berdasarkan bantuan marka (MAS/ marker-
assisted selection). Seleksi dengan bantuan marka molekuler adalah suatu proses
seleksi yang dilakukan berdasarkan pemilihan genotipe dengan menggunakan marka molekuler (Liu dan Cordes 2004). Marka yang berasosiasi dengan karakter yang diinginkan dapat digunakan sebagai petunjuk keberadaan marka penentu karakter dimaksud pada ikan. Marka DNA mikrosatelit sangat berguna sebagai langkah awal dalam menentukan individu ikan untuk kegiatan MAS. Salah satu keuntungan menggunakan marka DNA dalam program pemuliaan pada akuakultur adalah memungkinkan untuk mengidentifikasi calon induk, yang memiliki breeding value untuk dipijahkan, pada saat ikan masih berukuran kecil.
15 Hal ini akan mengurangi kebutuhan memelihara ikan dalam jumlah besar untuk diuji progeni (Hayes dan Andersen 2005).
Pengukuran pengaruh seleksi yang berdasarkan hanya kepada karakter morfologi atau fisiologi adalah hal yang sulit untuk dicapai karena hal ini tergantung pada penggunaan karakter fenotipe yang berhubungan erat dengan genotipe. Penanda molekuler dapat mengatasi hal tersebut, dan pada kondisi tertentu dapat memperlihatkan rekam jejak dari seleksi (Gjederm 2005). Chistiakov et al. (2006) menyatakan bahwa DNA mikrosatelit atau simple
sequence repeats (SSRs) adalah tipe unik dari sekuen genom berulang-ulang
secara berpasangan dan memperlihatkan tingkat polimorfisme yang tinggi. Mikrosatelit melambangkan kodominan marka tunggal DNA. Untuk setiap SSRs, progeni akan mewarisi satu alel dari induk jantan dan satu alel dari induk betina (Chistiakov et al. 2006). Mikrosatelit DNA pada dasarnya dimasukkan ke dalam kelompok DNA bukan gen, tetapi karena adanya keterpautan (linkage) antara mikrosatelit DNA dengan gen penyandi yang mengendalikan sifat-sifat ekonomis, maka mikrosatelit DNA menjadi efektif untuk diaplikasikan dalam menyeleksi sifat-sifat ekonomis ternak (Sumantri et al. 2008). MAS adalah proses seleksi yang dilakukan berdasarkan pemilihan genotipe dengan menggunakan marka DNA (Liu dan Cordes 2004). Rakus et al. (2008) menggunakan marka Cyca- DAB1*05 sebagai penanda ikan mas yang tahan terhadap serangan KHV. Keberadaan marka Cca-08 pada ikan mas dapat menjadi indikator ikan mas yang berpotensi menghasilkan benih dengan pertumbuhan dan kelangsungan hidup yang baik (Maskur 2010). Program seleksi dengan menggunakan MAS pada ikan mas untuk mendapatkan turunan yang memiliki keunggulan pertumbuhan dan tahan serangan KHV dapat dilakukan pada saat telah tersedia induk-induk yang memiliki marka dimaksud.
Untuk menangkap sebanyak mungkin peluang kombinasi keberadaan marka pada suatu turunan maka diperlukan berbagai kombinasi persilangan antara tetuanya. Berdasarkan hasil penelitian pertama, pada penelitian ini induk yang membawa marka Cca-08 dan atau Cyca-DAB1*05 disilangkan untuk menghasilkan turunan ikan mas yang diharapkan membawa marka Cca-08 dan atau marka Cyca-DAB1*05. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi pewarisan marka penanda pertumbuhan (Cca-08) dan marka penanda ketahanan terhadap KHV (Cyca-DAB1*05) pada turunan dari hasil berbagai kombinasi persilangan induk.
Bahan dan Metoda Waktu dan tempat
Penelitian dilaksanakan dari bulan September 2012 sampai dengan bulan Oktober 2013 di Balai Pengembangan Benih Ikan Air Tawar (BPBIAT) Wanayasa Purwakarta, Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Departemen BDP FKIP IPB, Balai Penelitian Pemuliaan Ikan (BPPI) Sukamandi, KKP serta Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) Sukabumi, KKP.
16
Pemilihan induk ikan mas dan kombinasi persilangan
Berdasarkan hasil analisis keberadaan marka Cca-08 dan Cyca-DAB1*05 pada 71 ekor induk, stok induk dapat dikelompokkan menjadi 5 (lima) kelompok yaitu; induk membawa Cca-08 homosigot dengan Cyca-DAB1*05 (Mp), induk membawa Cca-08 homosigot tanpa Cyca-DAB1*05 (Mn), induk membawa Cca- 08 heterosigot dengan Cyca-DAB1*05 (Tp), induk membawa Cca-08 heterosigot tanpa Cyca-DAB1*05 (Tn), dan induk yang tidak memiliki kedua marka tersebut (0n). Dari induk yang ada disusun kombinasi persilangan untuk mendapatkan kemungkinan kombinasi keberadaan kedua marka pada turunannya. Sepuluh kombinasi persilangan dibuat berdasarkan keberadaan marka pertumbuhan dan ketahanan terhadap KHV (Tabel 3).
Tabel 3. Kombinasi persilangan induk ikan mas pembawa marka pertumbuhan dan atau ketahanan terhadap KHV
Persilangan (betina x jantan)
Betina Jantan
Cca-08 Cyca-DAB1*05 Cca-08 Cyca-DAB1*05
Mp x Tp homosigot positif heterosigot positif
Mp x 0n homosigot positif tidak membawa negatif
Mp x Mn homosigot positif homosigot negatif
Mp x Tn homosigot positif heterosigot negatif
Mn x Tp homosigot negatif heterosigot positif
Mn x 0n homosigot negatif tidak membawa negatif
Mn x Mn homosigot negatif homosigot negatif
Tn x Tp heterosigot negatif heterosigot positif
Tn x 0n heterosigot negatif tidak membawa negatif
Tn x Mn heterosigot negatif homosigot negatif
Keterangan: M = induk membawa Cca-08 homosigot; T = induk membawa Cca-08 heterosigot; 0 = induk tidak membawa Cca-08; p = induk membawa Cyca-DAB1*05; n = induk tidak membawa Cyca-DAB1*05.
Pemijahan dan pemeliharaan ikan serta deteksi marka
Induk betina dan jantan terpilih dipelihara pada kolam running water
secara terpisah hingga matang gonad. Selama masa pematangan gonad, induk- induk diberi pakan komersial (kandungan protein 28%) sebanyak tiga kali sehari.
Untuk merangsang ovulasi secara terkontrol, dilakukan penyuntikan ovaprim dengan dosis 0,25 mL/kg induk. Telur dan sperma dikumpulkan dengan cara mengurut perut induk ikan mas, dan pembuahan dilakukan secara buatan. Telur-telur ikan mas ditetaskan pada bak fiber ukuran 150x80x50 cm3 secara
terpisah untuk setiap persilangan. Setelah berumur tiga hari larva diberi pakan berupa naupli Artemia. Pada hari kesepuluh larva dipindahkan ke dalam hapa berukuran 2x2x1 m3. Setiap kombinasi persilangan disimpan dalam hapa yang
berbeda dan untuk setiap persilangan dilakukan tiga kali ulangan. Hapa disimpan secara acak di dalam kolam seluas 27x18 x1.5 m3 dengan kepadatan 350 ekor per
hapa. Pada 30 hari pertama masa pemeliharaan, ikan diberi pakan komersial berbentuk tepung (Hi-provit; protein kasar 38%). Pemberian pakan diberikan secara at satiation sebanyak 2 kali sehari.
Pada hari ke-30 dilakukan sampling pengambilan jaringan pada setiap populasi hasil persilangan untuk melihat keberadaan markanya. DNA genom
17 diekstraksi sesuai dengan protokolnya, untuk keberadaan Cca-08 berdasarkan Maskur (2010), sedangkan marka Cyca-DAB1*05 dilakukan berdasarkan Alimuddin et al. (2011). Data keberadaan marka dan genotipe pada setiap populasi hasil persilangan digunakan untuk mengevaluasi pola pewarisan. Data nilai genotipe diolah dengan menggunakan program PowerMarker V3.0 untuk melihat availabilitas, diversitas gen, dan PIC setiap populasi
Hasil
Keberadaan Marka pada Ikan Hasil Persilangan
Analisis keberadaan marka Cca-08 dan Cyca-DAB1*05 pada setiap kombinasi persilangan memperlihatkan hasil seperti pada Tabel 4.
Tabel 4. Keberadaan marka Cca-08 dan Cyca-DAB1*05 pada setiap kombinasi persilangan
Persilangan (betina x jantan)
Keturunan yang mempunyai marka Cca-08 (%) Cyca-DAB 1*05 (%) Mp x Tp 65 5 Mp x 0n 75 70 Mp x Mn 100 35 Mp x Tn 100 45 Mn x Tp 100 40 Mn x 0n 100 Td Mn x Mn 95 Td Tn x Tp 95 65 Tn x 0n 90 Td Tn x Mn 75 Td
Keterangan: M = induk membawa Cca-08 homosigot; T = induk membawa Cca-08 heterosigot; 0 = induk tidak membawa Cca-08; p = induk membawa Cyca-DAB1*05; n = induk tidak membawa Cyca-DAB1*05; td= tidak ada.
Marka Cca-08 diwariskan dari tetua kepada turunannya dengan frekuensi yang berbeda. Keberadaan marka Cca-08 terdeteksi dan diwariskan pada turunannya, namun tidak seluruh turunannya membawa Cca-08. Keberadaan marka terkait ketahanan terhadap KHV diwariskan kepada turunannya dengan frekuensi yang berbeda. Pada persilangan Mp x Tp, terlihat bahwa keberadaan marka yang terkait dengan ketahanan terhadap KHV sebesar 5%, nilai ini sangat rendah mengingat kedua induknya memiliki marka Cyca-DAB1*05. Variasi genotipe pada turunan hasil sepuluh kombinasi persilangan tersaji pada Tabel 5. Persilangan antara induk heterosigot memberikan hasil variasi genotipe yang lebih banyak dibandingkan dengan persilangan lainnya. Selanjutnya, variasi genetik berdasarkan marka Cca-08 pada sepuluh populasi hasil persilangan tertera pada Tabel 6. Jumlah alel (4 alel) paling banyak, diveristas gen dan PIC tertinggi ditemukan pada persilangan Tn x Tp, diikuti oleh persilangan Mp x Tp, Mp x Tn, Tn x Mn dengan jumlah alel 3. Persilangan yang menggunakan jantan 0n menghasilkan alel monomorfik (Tabel 6).
18
Tabel 5. Variasi genotipe berdasarkan marka Cca-08 pada turunan sepuluh kombinasi persilangan
Genotipe induk betina
Genotipe induk jantan T: 243/276 0: -/- M :270/270 T :238/270 T: 254/269 0: -/- M: 234/234 T:254/269 0: -/- M: 240/245 M: 247/247 243/247, (25) 247/276 (40) M: 244/244 244/244 (75) M: 234/234 234/270 (100) M: 245/245 238/245 (75) 245/270 (25) M: 238/238 238/254 (40) 238/269 (60) M: 238/238 238/238 (100) M: 238/238 234/238 (95) T: 245/251 245/254 (20) 245/269 (25) 251/254 (15) 251/269 (35) T: 245/251 245/245 (90) T: 245/251 240/245 (30) 240/251 (45)
Keterangan: M = Induk membawa Cca-08 homosigot. T = Induk membawa Cca-08 heterosigot. 0 = Induk tidak membawa Cca-08. ( ): frekuensi keberadaan marka.
Tabel 6. Variasi genetik berdasarkan marka Cca-08 pada turunan sepuluh kombinasi persilangan
Kombinasi Persilangan Jumlah alel Diversitas Gen PIC
Mp x Tp 3 0.61 0.529 Mp x 0n 1 0.00 0.000 Mp x Mn 2 0.50 0.375 Mp x Tn 3 0.63 0.550 Mn x Tp 3 0.62 0.548 Mn x 0n 1 0.00 0.000 Mn x Mn 2 0.50 0.374 Tn x Tp 4 0.70 0.645 Tn x 0n 1 0.00 0.000 Tn x Mn 3 0.37 0.323
Keterangan: M = induk membawa Cca-08 homosigot; T = induk membawa Cca-08 heterosigot; 0 = induk tidak membawa Cca-08; p = induk membawa Cyca-DAB1*05; n = induk tidak membawa Cyca-DAB1*05.
19 Pembahasan
Pada penelitian ini, marka Cca-08 terdeteksi dan diwariskan pada turunannya, namun tidak seluruh turunannya membawa marka Cca-08. Okumuş dan Çiftci (2003) dan Bustamante (2009) menyatakan juga bahwa mikrosatelit adalah kodominan, dan diturunkan sesuai hukum Mendel. Pada penelitian ini tidak cukup data untuk menjelaskan tentang pola penurunan Mendel, hal ini disebabkan tidak semua individu dalam populasi dianalisis keberadaan marka Cca-08. Selain itu dapat juga disebabkan karena tidak diamatinya keberadaan Cca-08 pada ikan yang mati selama pemeliharaan.
Analisis dengan PowerMarker V3.0 memberikan gambaran tentang kondisi populasi setiap persilangan seperti pada Tabel 6. Bartfai et al. (2003) menyatakan bahwa mikrosatelit merupakan metode yang lebih informatif untuk menduga keragaman genetik. Variasi genetik dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan keragaman genetik. Heterosigositas harapan (expected
heterozygosity/HE) sering pula disebut sebagai diversitas gen (Nei 1987). Jumlah
lokus yang teramati mencerminkan jumlah alel yang ada di dalam sampel populasi. Jumlah alel pada persilangan ini berkisar dari 1-4. Untuk melihat keragaman populasi maka penilaian yang sangat erat adalah dengan menggunakan nilai PIC. Nilai ini menginformasikan jumlah keberadaan polimorfisme (Botstein
et al. 1980). Diversitas gen tidak terlihat pada persilangan antara betina yang
memiliki Cca-08 dengan jantan yang tidak membawa marka (Mp x 0n, Mn x 0n, danTn x 0n). Berdasarkan hasil PIC terlihat bahwa nilai polimorfisme populasi ikan mas lebih kecil dari 0.375 untuk 6 (enam) kombinasi persilangan yaitu persilangan betina yang memiliki Cca-08 dengan jantan yang tidak memiliki Cyca-DAB1*05. Keadaan ini mengindikasikan tingkat heterosigositas dan variasi genetik yang relatif rendah. Hal ini juga menggambarkan tingkat keseragaman yang relatif tinggi di dalam populasi. Sementara persilangan antara induk betina yang memiliki Cca-08 dengan jantan heterosigot Cca-08 mempunyai nilai PIC antara 0.529-0.645. Keseragaman adalah salah satu hal yang diperlukan dalam budidaya, namun merupakan hal yang dihindari dalam kegiatan yang bertujuan untuk konservasi di alam (Nugroho et al. 2001). Berdasarkan jumlah alel, nilai diversitas gen serta PIC, maka persilangan induk betina yang membawa Cca-08 heterosigot tanpa Cyca-DAB1*05 dengan jantan membawa Cca-08 heterosigot dan Cyca-DAB1*05 (Tn x Tp) adalah populasi yang mempunyai nilai terbesar dibandingkan dengan sembilan persilangan lainnya
Keberadaan marka terkait ketahanan terhadap KHV diwariskan kepada turunannya dengan frekuensi yang berbeda. Hal ini sesuai dengan pernyataan Rakus et al. (2008a) bahwa pada gen Cyca-DAB segregasinya diturunkan secara independen. Namun pola penurunannya tampaknya tidak seperti penurunan Mendel, hal ini disebabkan karena hal yang sama dengan pola penurunan Cca-08 yaitu tidak cukup data untuk menjelaskan tentang pola penurunan Mendel. Hal tersebut disebabkan tidak semua individu dalam populasi dianalisis keberadaan marka Cyca-DAB1*05. Selain itu dapat juga disebabkan karena tidak diamatinya keberadaan Cyca-DAB1*05 pada ikan yang mati selama pemeliharaan.
Pada populasi persilangan Mpx Tp, terlihat bahwa keberadaan marka yang terkait dengan ketahanan terhadap KHV sebesar 5%, nilai ini sangat rendah mengingat kedua induknya memiliki marka Cyca-DAB1*05. Persilangan antara induk ikan mas yang membawa marka Cca-08, Cyca-DAB1*05 tidak berpotensi
20
tinggi untuk menghasilkan keturunan ikan mas yang memiliki kedua marka dimaksud. Deteksi marka Cyca-DAB1*05 dilakukan menggunakan PCR dengan primer spesifik, sedangkan alelnya relatif banyak. Frekuensi keberadaan marka terkait ketahanan terhadap KHV terbesar terlihat pada populasi Mpx 0n (70%), di mana induk betina memiliki marka potensi tumbuh cepat dan ketahanan terhadap KHV sementara induk jantannya tidak memiliki kedua marka tersebut. Persilangan antara induk ikan mas membawa marka Cca-08 dengan salah induknya membawa marka Cyca-DAB1*05 berpotensi tinggi untuk menghasilkan keturunan ikan mas yang membawa marka tumbuh cepat dan tahan terhadap serangan KHV.
Berdasarkan data di atas terlihat bahwa pada persilangan antara induk betina membawa marka Cca-08 dan Cyca-DAB1*05 dengan jantan yang tidak membawa kedua marka tersebut memberikan nilai keberadaan marka terkait ketahanan terhadap KHV paling tinggi pada turunannya (persilangan Mp x 0n). Selanjutnya diikuti dengan persilangan betina dan jantan dengan kondisi heterosigot dengan induk jantan yang membawa marka terkait ketahanan terhadap KHV (persilangan Tn x Tp) dengan nilai 65%
Kesimpulan
Pewarisan alel penanda pertumbuhan yang dicirikan dengan keberadaan marka Cca-08 dalam kondisi homosigot dan heterosigot dapat dideteksi pada seluruh kombinasi persilangan. Keberadaan marka yang terkait dengan ketahanan terhadap KHV yaitu marka Cyca-DAB1*05 dapat diwariskan pada keturunannya dengan frekuensi yang berbeda. Persilangan antara induk betina membawa Cca- 08 heterosigot dengan jantan membawa Cca-08 heterosigot dan Cyca-DAB1*05 (Tn x Tp) merupakan populasi yang paling tinggi polimorfismenya.
21