Azotobacter-like dan Azospirillum-like diisolasi dari empat sampel pupuk hayati komersial dan satu sampel tanah Sawah Baru. Azotobacter-like diisolasi menggunakan metode cawan hitung pada medium spesifik, yaitu nitrogen free mannitol (NFM). Hasil pemurnian Azotobacter-like diperoleh 10 isolat, yaitu 6 isolat berasal dari pupuk hayati dan 4 isolat berasal dari tanah.
Azospirillum-like diisolasi menggunakan metode enrichment pada media nitrogen free bromthymol blue (NFB). Media NFB adalah media semi padat bebas nitrogen dengan asam malat sebagai sumber karbon, karena Azospirillum-like tumbuh baik pada garam-garam asam organik seperti asam malat, asam suksinat, asam laktat atau piruvat. Pertumbuhan diawali oleh terbentuknya pelikel atau semacam “cincin” yang samar-samar, beberapa mm atau beberapa cm di bawah permukaan media. Pelikel ini merupakan batas antara difusi oksigen ke dalam media dengan respirasi mikroorganisme, sehingga tidak ada kelebihan oksigen di dalam media. Warna biru yang terbentuk pada media menunjukkan terjadinya proses alkalinisasi akibat oksidasi malat (Krieg dan Dobereiner 1986). Sampel yang membentuk pelikel kemudian dipindahkan ke media baru untuk selanjutnya dimurnikan. Hasil pemurnian juga diperoleh 10 isolat Azospirillum-like, yaitu 6 isolat berasal dari pupuk hayati dan 4 isolat berasal dari tanah. Isolat-isolat yang diperoleh disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil isolasi Azotobacter-like dan Azospirillum-like
Sumber Azotobacter-like Azospirillum-like
Isolat Jumlah Isolat Jumlah
Pupuk hayati 1 At113, At114,
At123, At124, At134 5
Ap134, Ap135
2
Pupuk hayati 2 - - - -
Pupuk hayati 3 - - Ap313, Ap333,
Ap334 3
Pupuk hayati 4 At414 1 Ap414 1
Tanah sawah baru At513, At514, At523, At524 4 Ap514, Ap515, Ap533, Ap534 4 Total 10 10
Seleksi kemampuan penambatan N2Azotobacter-like dan Azospirillum-like Isolat Azotobacter-like dan Azospirillum-like hasil pemurnian yang masing-masing berjumlah 10 isolat, selanjutnya dilakukan seleksi kemampuan penambatan N2 menggunakan pengukuran kelarutan amonium berdasarkan metode destilasi dan titrasi. Kemampuan setiap isolat diukur berdasarkan banyaknya amonium yang dihasilkan. Hasil pengukuran kelarutan amonium setiap isolat disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Kandungan amonium dari isolat Azotobacter-like dan Azospirillum-like
Azotobacter-like Azospirillum-like
Isolat Kandungan amonium (ppm) Isolat Kandungan amonium (ppm) Kontrol At113 0.90 ± 0.00 3.00 ± 1.04 Kontrol Ap134 0.90 ± 0.00 3.00 ± 1.04 At114 3.60 ± 1.80 Ap135 3.60 ± 1.80 At123 3.00 ± 1.04 Ap313 3.60 ± 0.00 At124 1.80 ± 0.00 Ap333 4.20 ± 1.04 At134 3.00 ± 1.04 Ap334 4.20 ± 2.08 At414 2.40 ± 1.04 Ap414 2.40 ± 1.04 At513 2.40 ± 1.04 Ap514 4.20 ± 2.08 At514 1.80 ± 0.00 Ap515 4.20 ± 2.08 At523 3.00 ± 1.04 Ap533 4.80 ± 1.04 At524 3.00 ± 2.08 Ap534 3.60 ± 0.00 BNJ 3.30 BNJ 3.99
Keterangan: angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji BNJ taraf kesalahan 5%, angka di belakang tanda (±) menunjukkan standar deviasi
Tabel 3 menunjukkan bahwa kandungan amonium yang dihasilkan oleh Azotobacter-like dan Azospirillum-like tidak berbeda nyata, sehingga dipilih masing-masing 3 isolat berdasarkan kemampuannya dalam menghasilkan amonium yang tertinggi, mewakili setiap sampel, dan memiliki kemampuan tumbuh yang lebih cepat. Tiga isolat Azotobacter-like tersebut, yaitu At114, At523, dan At524, sedangkan tiga isolat Azospirillum-like, yaitu Ap135, Ap333, dan Ap533. Isolat hasil seleksi amonium kemudian diseleksi berdasarkan uji antagonistik.
Seleksi Uji Antagonistik
Azotobacter-like dan Azospirillum-like diseleksi berdasarkan uji antagonistik dengan menumbuhkan bersama dalam satu cawan menggunakan media nutrient agar (NA). Menurut Dwidjoseputro (1998) suatu hubungan yang asosial dimana bakteri tidak dapat hidup berdampingan dengan bakteri lain disebut hubungan antagonisme. Spesies yang satu menghasilkan sesuatu yang meracuni spesies yang lain, sehingga pertumbuhan spesies yang terakhir itu sangat terganggu karenanya. Zat yang dihasilkan oleh spesies yang antagonis mungkin berupa ekskret, mungkin juga zat tersebut merupakan zat sisa makanan yang dapat menghambat kehidupan mikroorganisme yang lain. Semangun (1996), menyatakan bahwa antagonis adalah peristiwa yang menyebabkan tertekannya aktivitas suatu
mikroorganisme jika dua mikroorganisme atau lebih berada pada tempat yang berdekatan.
Hasil uji antagonistik menunjukkan terdapat bakteri yang dapat tumbuh bersama atau tidak saling hambat/menekan aktivitas bakteri lain yang ditandai dengan kode (-), tetapi juga ada bakteri yang dapat menekan aktivitas bakteri lain yang ditandai dengan kode (+) seperti yang disajikan pada Tabel 4. Mikroorganisme antagonis adalah mikroorganisme yang mempunyai pengaruh merugikan terhadap mikroorganisme lain yang tumbuh dan berasosiasi dengannya (Ismail dan Tenrirawe 2000). Menurut Gultom (2008), mekanisme antagonis meliputi kompetisi nutrisi, antibiosis sebagai hasil pelepasan antibiotika atau senyawa kimia, dan predasi.
Tabel 4 Hasil uji antagonistik antar isolat bakteri Isolat Uji Antagonistik
At114 x Ap135 - At114 x Ap333 - At114 x Ap533 - At523 x Ap135 + At523 x Ap333 + At523 x Ap533 - At524 x Ap135 + At524 x Ap333 - At524 x Ap533 +
Keterangan: (+) terjadi saling hambat; (-) tidak terjadi saling hambat
(a) (b)
Keterangan: (a) terjadi saling hambat; (b) tidak terjadi saling hambat
Gambar 2 Hasil uji antagonistik
Berdasarkan uji yang telah dilakukan dipilih 1 Azotobacter-like dan 1 Azospirillum-like, yaitu At523 dan Ap533. Bakteri tunggal dan kombinasi dua bakteri tersebut dipilih untuk diaplikasikan di lapangan, karena keduanya tidak saling antagonis dan memiliki kemampuan tumbuh yang lebih cepat. Bakteri tersebut diaplikasikan dengan cara larutan bakteri diencerkan dengan 25 ml larutan fisiologis, kemudian disiramkan ke tanah di sekitar akar tanaman dengan maksud dapat menyumbangkan nitrogen ke dalam tanah, sehingga dapat dimanfaatkan tanaman. Sampel tanah juga diambil sebelum aplikasi bakteri untuk mengetahui populasi awal Azotobacter-like dan Azospirillum-like. Populasi awal untuk Azotobacter-like adalah 1.83x105 satuan pembentuk koloni (SPK) g-1 bobot
kering mutlak (BKM) dan untuk Azospirillum-like adalah 6.64x105 SPK g-1 BKM. Azotobacter-like dan Azospirillum-like diaplikasikan 3 kali, yaitu saat tanam, 2 dan 4 minggu setelah tanam (MST) dengan total populasi untuk Azotobacter-like adalah 7.88x109 cfu ml-1 per petak (m-2) dan Azospirillum-like adalah 7.95x109 cfu ml-1 per petak (m-2). Total populasi konsorsium adalah 7.88 x109 cfu ml-1 per petak (m-2) yang terdiri dari setengah populasi Azotobacter-like dan setengah populasi Azospirillum-like.
PERCOBAAN II