BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate
Setelah didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan isolasi bakteri endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk mendapatkan biakan murni bakteri endofit. Satu ose mikrobia yang didapat diinokulasikan pada nutrient agar secara streak plate. Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Akan didapat koloni- koloni bakteri yang terpisah. Koloni bakteri dari goresan terakhir diinokulasikan secara goresan ke dalam medium NA miring untuk stok mikrobia.
7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit Terhadap E.coli dan S.aureus Secara Difusi Paper disc
a. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Diambil ± 1 ose dari stok bakteri uji dari biakan murni E.coli ATCC 35218 dan S.aureus ATCC 25923, kemudian diinokulasikan pada Nutrien Broth (NB) 9 ml sampai konsentrasi 6 x 108 CFU/ml (Larutan Standar Mac Farland II).
b. Skrining Bakteri Endofit yang Memiliki Potensi Antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus
Biakan murni bakteri endofit yang diperoleh dari tahap 6 diuji potensi antibakterinya terhadap E.coli dan S.aureus dengan metode Paper Disc
Agar Diffusion Technique. Biakan bakteri endofit tersebut kemudian
ditumbuhkan dalam medium Nutrient Broth dan digojog menggunakan
shaker inkubator pada suhu 37° C dengan kecepatan 170 rpm selama 3-4
mengandung metabolit sekunder bakteri endofit (supernatan) dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 1 jam, supernatan dipakai untuk skrining bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri. Sesudah supernatan disiapkan, paper disc steril diinokulasi 40 μl supernatan. Untuk mengurangi ekses air, paper disc dikeringanginkan di atas kaca arloji steril selama kurang lebih 1 jam. Mikrobia uji yaitu E.coli
dan S.aureus ditumbuhkan dalam NA secara pour platting pada petri yang
berbeda, yaitu dengan mengambil suspensi bakteri uji E.coli dan S.aureus
sebanyak 1 ml kemudian diinokulasikan ke dalam 20 ml Nutrient Agar yang sedang mencair pada temperatur 50oC lalu dituang ke dalam cawan petri dan digoyang perlahan- lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan agar. Setelah agar memadat, paper disc yang telah diinokulasi supernatan ditempatkan di permukaan medium. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 24 jam atau sampai terbentuknya zona jernih di sekitar
paper disc. Potensi penghambatan diukur dengan mengukur diameter zona
jernihnya menggunakan penggaris.
8. Identifikasi Bakteri Endofit a. Morfologi sel
1) Pengecatan Gram
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam, difiksasi di atas pembakar spiritus. Diteteskan cat kristal violet dan didiamkan selama 45 detik. Sisa cat dicuci dengan air mengalir lalu
ditetesi larutan iodine dan didiamkan selama 1,5 menit. Dicuci dengan air mengalir dan diberi larutan peluntur safranin, didiamkan selama 20 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan. Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan menggunakan minyak immersi. Jika sel bakteri berwarna ungu berarti isolat bakteri endofit yang diisolasi termasuk bakteri gram positif. Tetapi jika sel bakteri berwarna merah berarti isolat bakteri endofit termasuk bakteri gram negatif.
2) Pengecatan Spora
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dan difiksasi di atas pembakar spiritus. Ditetesi dengan malachite green dan dipanasi selama 1 menit. Dicuci dengan air mengalir lalu diberi cat safranin dan didiamkan selama 30 detik kemudian dicuci di bawah air mengalir lalu dikeringanginkan dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat 1000X dengan minyak immersi. Spora berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah.
3) Pengecatan Acid Fast
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam pada kaca obyek dan difiksasi di atas pembakar spiritus. Lalu ditutup dengan sepotong kertas filter, ditambah larutan carbolfuchsin dan dipanaskan di atas pembakar spiritus dengan nyala api kecil.
Didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Dicuci dengan larutan peluntur sambil digoyang- goyangkan sampai seluruh warna dari carbolfuchsin tidak tampak. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah itu ditambahkan dengan metylen biru selama 20-30 detik. Dicuci kembali dan diamati dengan perbesaran kuat 1000X. Bakteri yang tidak tahan terhadap pencucian asam akan berwarna biru sedangkan bakteri yang tahan asam akan berwarna merah.
4) Uji pergerakan
Isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam diinokulasi dengan cara tusukan dalam agar tegak dengan kandungan agar 0,2% – 0,4%. Akan tampak pergerakan bakteri yang berupa serabut- serabut halus disekitar tusukan, pergerakan bakteri ini disebabkan karena bakteri memiliki flagela.
b. Morfologi Koloni
Diinokulasikan biakan bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 ke dalam medium cair ( Nutrient Broth), NA tegak dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan, dan NA miring secara goresan dengan jarum ose. Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Pada medium cair diamati pertumbuhan pada permukaan, endapan yang terjadi, bau, dan kekeruhan. Pada NA tegak diamati tingkat pertumbuhan dan bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan. Pada NA miring diamati tingkat pertumbuhan, bentuk pertumbuhan pada
bekas tusukan, kilat, topografi, warna, ciri- ciri optik, bau, konsistensi dan warna medium.
c. Uji biokimia
1) Uji pembentukan H2S
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dengan jarum inokulasi secara tusukan pada medium TSIA miring dan pada permukaan medium diinokulasi secara goresan dengan menggunakan ose. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37oC. Pengamatan uji H2S dilakukan dengan cara membandingkan medium yang diinokulasi isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan hitam yang berarti bakteri mampu menghasilkan senyawa desulfurase, selain itu dapat digunakan untuk mengamati fermentasi gula. Jika pada bagian bawah medium berwarna kuning sedang bagian atas berwarna merah berarti terjadi fermentasi glukosa. Jika baik pada bagian atas ataupun bawah medium berwarna kuning dan kadangkala disertai pembentukan gas berarti laktosa atau sukrosa atau keduanya difermentasikan. Dan jika seluruh medium berwarna merah berarti ketiga macam gula tidak difermentasikan.
2) Uji dekarboksilasi lisin
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam dengan cara tusukan dalam medium Lysin Iron Agar (LIA)
kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam dan 48 jam. Pengamatan uji dekarboksilasi lisin dilakukan dengan membandingkan medium LIA yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit) yang berwarna ungu. Hasil diamati, positif bila terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada umur 24 jam dan kemudian berwarna ungu kembali. Perubahan warna menjadi kuning menandakan bakteri dapat melakukan fermentasi dan kembali berwarna ungu yang berarti lisin mengalami dekarboksilasi.
3) Uji Indol
Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dalam masing- masing tabung reaksi yang berisi medium tripton water. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah itu ditambahkan reagen Kovac. Pengamatan uji Indol dilakukan dengan membandingkan medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Memberikan hasil positif apabila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan medium. Hal ini dikarenakan bakteri dapat menghasilkan enzim triptofanase.
4) Uji Methyl Red
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dengan jarum inokulasi pada masing- masing tabung yang berbeda berisi medium MR-VP. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Pengamatan uji Methyl Red dilakukan dengan membandingkan medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Pada uji MR ditambah reagen methyl red. Bakteri yang tidak dapat memfermentasikan gula akan merubah warna menjadi merah pada uji MR. Sedangkan apabila terjadi fermentasi gula, medium akan berubah menjadi kuning.
5) Uji sitrat
Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam pada medium simmon’s citrate secara miring. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan uji sitrat dilakukan dengan membandingkan medium simmon’s citrate yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon. 6) Uji katalase
Satu ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 diletakkan pada gelas benda.
Ditambahkan 1 tetes 30% H2O2. diamati dengan melihat terjadi atau tidaknya pembentukan gelembung udara di sekitar koloni bakteri endofit setelah diberi reagens 30% H2O2 dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). jika terjadi gelembung udara berarti bakteri memiliki enzim katalase.
7) Uji Oksidase
Pada kertas saring diteteskan reagens tetrametil paraphenildiamin. Pada kertas saring yang diberi reagens diletakkan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam. Diamati hasilnya dengan melihat apakah terjadi perubahan warna koloni bakteri menjadi ungu tua setelah diberi reagens dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Jika terjadi warna ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit berarti hasil positif bahwa bakteri uji memiliki enzim oksidase sitokrom. Sedangkan hasil negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna.
8) Uji hidrolisis gelatin
Diinokulasi kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam secara tusukan pada medium dengan komposisi gelatin 12% dan nutrient broth dengan takaran 13 gram/L kemudian diinkubasikan selama 72 jam. Setelah 72 jam, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit. Diamati apakah terjadi pencairan gelatin atau tidak dan
dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Apabila terjadi pencairan gelatin berarti bakteri mampu menghasilkan eksoenzim gelatinase.
9) Uji fermentasi karbohidrat
Dua tabung berisi medium O-F diinokulasi dengan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam menggunakan jarum inokulasi secara tusukan dan dua tabung sebagai kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit), tabung pertama ditetesi parafin dan tabung kedua tanpa ditetesi parafin kemudian diinkubasikan pada suhu 37o selama 48 jam. Hasil diamati dengan melihat perubahan warna medium O-F. Warna awal medium O-F adalah hijau. Jika pada medium yang ditutup paraffin tetap berwarna hijau sedangkan yang tidak ditutup paraffin warna mediumnya berubah menjadi kuning berarti bakteri endofit mampu memetabolisme karbohidrat secara oksidasi. Tetapi jika pada tabung dengan medium O-F yang ditutup paraffin ataupun tidak ditutup paraffin, warna mediumnya berubah menjadi kuning berarti bakteri endofit mampu memetabolisme karbohidrat secara fermentasi.
E. Analisis Hasil
Medium yang digunakan untuk isolasi bakteri endofit dari batang Artemisia
annua L. adalah MS (Murashige-Shoog)medium. Isolat bakteri endofit kemudian
dilakukan reisolasi secara streak plate pada Nutrient Agar dalam petri supaya didapatkan kultur murni bakteri endofit. Potensi antibakteri isolat bakteri endofit
penghasil senyawa antibakteri diujikan pada S aureus dan E.coli menggunakan metode difusi dengan paper disk, potensi antibakteri diketahui dengan cara mengukur zona hambat yang terbentuk di sekitar paper disk dengan menggunakan penggaris. Identifikasi bakteri endofit dilakukan dengan melihat sifat morfologi sel, morfologi koloni dan pengujian sifat biokimia. Dari sifat- sifat tersebut dapat diidentifikasi bakteri endofit yang bersifat antibakteri terhadap S.aureus dan
E.coli dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al, 2000) sehingga dapat
ditentukan genus dari bakteri endofit tersebut. Seluruh data pengamatan dideskripsikan dengan dilengkapi foto dan gambar mikrofotografi.
Pengumpulan batang tanaman Artemisia annua L.
Pembersihan batang tanaman Artemisia annua L.
Penanaman batang tanaman Artemisia annua L pada MS medium untuk isolasi bakteri endofit
Isolasi dan Reisolasi bakteri endofit secara streak plate
Isolat murni bakteri endofit
Skrining bakteri endofit dengan metode paper disk
Identifikasi bakteri endofit
Morfologi sel : Morfologi koloni : Sifat biokimia : - sifat gram Medium cair (NB) - H2S
- rangkaian sel - tekstur permukaan - dekarboksilasi lisin - bentuk sel - kekeruhan - indol
- pergerakan - bau - MR - endapan - sitrat Medium padat (NA) - katalase - bentuk pertumbuhan - oksidase - konsistensi - gelatin - warna - fermentasi
Determinasi isolat bakteri endofit menggunakan panduan baku Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology (Holt et al, 2000)
Genus isolat bakteri endofit
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L.
Identifikasi tanaman (disebut juga dengan determinasi tanaman) adalah penentuan nama ilmiah suatu tanaman yang didasarkan pada acuan suatu sistem klasifikasi tanaman (Stace, 1989). Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan untuk penelitian. Tanaman yang akan digunakan dalam penelitian adalah Artemisia annua L. yang dideterminasi sampai tingkat spesies. Determinasi tanaman dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO), Tawangmangu, dengan menggunakan kunci determinasi menurut Backer (1968) (Lampiran 1).
Berdasarkan determinasi hingga kategori spesies tersebut, maka tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Artemisia annua L. (Lampiran 2).
Artemisia annua L. merupakan anggota familia Asteraceae (sinonim
Compositae) (Backer & Brink,1965).
2. Pengumpulan Batang Tanaman Artemisia annua L.
Batang tanaman yang akan digunakan untuk penelitian diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat ( BPTO ), Tawangmangu, dan dipilih tanaman
A.annua L. yang berumur dewasa dan sehat ( berumur ± 6 bulan ). Mikrobia
endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular (pembuluh) terdapat di seluruh tubuh tanaman, mengangkut zat-zat antara akar dan tunas. Kedua jenis jaringan vaskular
tersebut adalah xilem, yang mengirim air dan mineral yang terlarut ke atas dari akar ke tunas, dan floem, yang mengangkut makanan yang dibuat di daun yang sudah dewasa ke akar dan ke bagian-bagian sistem tunas (Campbell et al, 2002). Pada tanaman yang terlalu muda, jaringan vaskular yang terbentuk belum sempurna sehingga kemungkinan munculnya bakteri endofit kecil karena nutrien yang diperlukan untuk tumbuhnya bakteri endofit kurang. Apabila batang tanaman yang dipilih kurang sehat kemungkinan jaringan tanaman di dalam batang tersebut sudah ada yang rusak sehingga tidak dapat menghasilkan nutrien secara maksimal untuk tumbuhnya bakteri endofit. Jaringan tanaman yang sehat dapat menghasilkan nutrien yang cukup untuk tumbuhnya bakteri endofit (Pudaritadesantamaria, 2004). Nutrien adalah substansi yang digunakan untuk biosintesis dan sebagai sumber energi untuk mendukung pertumbuhan mikrobia (Prescott, Harley & Klein, 1999). Digunakan batang tanaman A.annua L. karena dalam batang A.annua L. terdapat jaringan vaskular sebagai tempat tumbuh bakteri endofit.
3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)
Medium tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Macam-macam medium kultur telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama medium tumbuh untuk eksplan ini biasanya sama dengan nama penemunya, antara lain adalah: Medium Murashige dan Skoog (MS), Medium Gamborg, Medium Vacin Went (VW), Medium Woody Plant Medium (WPM), dan lainnya. Medium tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir
sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan. Jaringan tanaman yang dikultur memerlukan unsur hara makro dan unsur hara mikro dari dalam medium tumbuh, dari dalam medium kultur juga harus ada bahan-bahan lain yang berguna untuk merangsang pertumbuhan serta perkembangan sel jaringan yang dikulturkan (Hendaryono,1994). Agar supaya batang tanaman A.annua L. tetap tumbuh, berkembang dan menyokong pertumbuhan dari bakteri endofit pada saat proses isolasi bakteri endofit diperlukan lingkungan yang cocok untuk batang tanaman A.annua L. tersebut, karena itu diperlukan proses kultur jaringan untuk batang tanaman A.annua L. Batang tanaman A.annua L ini dapat disebut juga eksplan, yaitu bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan (Katuuk,1989). Pemisahan batang tanaman A.annua L. dari tanaman induk menyebabkan perubahan biosintesa dalam batang tanaman A.annua L. tersebut, sehingga pemberian unsur hara ke dalam medium kultur untuk membantu batang tanaman A.annua L. supaya dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu adalah bahan organik yang meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta zat yang mengatur pertumbuhan. MS medium merupakan medium yang paling banyak digunakan untuk induksi kalus (Katuuk, 1989). Medium yang digunakan untuk kultur batang tanaman A.annua L adalah MS medium. MS Medium dipilih sebagai medium kultur batang tanaman A.annua L karena MS Medium mengandung garam-garam mineral yang cukup lengkap untuk mendukung pertumbuhan eksplan dan mengandung senyawa nitrogen yang
berguna dalam regenerasi sel eksplan. Bakteri endofit dalam batang tanaman
A.annua L. dapat tumbuh karena mendapat nutrien dalam jaringan vaskular
batang tanaman A.annua L. (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular berfungsi untuk transportasi nutrien tanaman A.annua L., jadi nutrien yang digunakan tanaman A.annua L. untuk tumbuh digunakan juga oleh bakteri endofit tersebut untuk tumbuh, sehingga diharapkan bakteri endofit tersebut juga dapat tumbuh dalam MS medium.
4. Desinfeksi Batang Tanaman Artemisia annua L.
Pembersihan batang tanaman A.annua L. dilakukan untuk menghilangkan menghilangkan kotoran dan mikrobia kontaminan dari permukaan batang tanaman A.annua L., sehingga pada tahap isolasi bakteri endofit dari batang
A.annua L. akan diperoleh isolat murni bakteri endofit. Cara pembersihannya
yaitu batang dicuci dengan air mengalir selama ± 5-10 menit kemudian batang dicuci dalam 10 ml bayclin® (commercial bleaching yang mengandung 5,3% sodium hypokhlorit) dan 20 tetes Tween 80, kemudian dibilas dengan aquadest steril sampai bersih. Bayclin® berfungsi sebagai desinfektan untuk menghilangkan kotoran, bakteri dan fungi yang ada pada batang sehingga ketika batang ditanam pada medium tidak tumbuh fungi atau bakteri kontaminan di sekitarnya. Tween 80 merupakan suatu surfaktan yang berfungsi untuk menaikkan kontak desinfektan (Bayclin® ) dengan batang tanaman A.annua L., sehingga dapat membersihkan batang A.annua L. dari kotoran dan mencegah adanya kontaminasi fungi dan bakteri. Tujuan pembilasan dengan aquadest steril adalah untuk menghilangkan busa Tween
80 yang masih menempel pada batang yang dapat mengganggu pertumbuhan bakteri endofit.
5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium
Batang yang telah dibersihkan kemudian dipotong menggunakan pisau steril sepanjang ± 0,5-0,8 cm dan ditanam menggunakan pinset steril secara aseptis ke permukaan medium MS. Penanaman batang dalam posisi horisontal
dengan bekas potongan tertanam di permukaan MS medium, kemudian
diinkubasikan selama 2-3 hari. Setelah inkubasi, tampak pertumbuhan bakteri endofit di sekitar batang A.annua L. (Lampiran 3).
Bakteri endofit ini hanya akan tumbuh di sekitar batang A.annua L. karena bakteri endofit ini pada awalnya memperoleh nutrien dari batang
A.annua L.. Pertumbuhan bakteri endofit di MS Medium akan tampak berbeda
dengan mikrobia kontaminan. Mikrobia kontaminan akan memenuhi seluruh permukaan MS Medium setelah inkubasi.
Munculnya bakteri endofit tersebut karena terdapat hubungan simbiosis antara bakteri endofit dan tanaman A.annua L., di mana bakteri endofit memperoleh nutrien dan pelindungan dari tanaman A.annua L.. Peran nutrien yang diperoleh dari tanaman A.annua L. bagi bakteri endofit adalah sebagai sumber energi sesuai kebutuhan sel bakteri endofit, dan sebagai bahan pembangun sel bakteri endofit. Sebagai timbal baliknya, tanaman A.annua L. memperoleh substansi dari bakteri endofit yang berguna untuk mendukung pertumbuhan tanaman A.annua L.. Bakteri endofit memproduksi
lainnya yang mendukung pertumbuhan tanaman (Tan & Zou, 2001). Bakteri endofit juga memberikan perlindungan kepada tanaman inang dari berbagai mikrobia patogen dengan cara kompetisi, menghasilkan senyawa antibiotik, atau menginduksi ketahanan tanaman. Bakteri endofit yang diisolasi dari akar pisang telah diketahui dapat menghambat pertumbuhan Fusarium oxysporum
penyebab penyakit layu Fusarium pada tanaman pisang (Pudaritadesantamaria, 2004).
Bakteri endofit mengkoloni jaringan vaskular dari tanaman A.annua L., sehingga bakteri endofit tersebut hidup di lingkungan yang kaya akan nutrien, oleh karena itu transpor nutrien dari tanaman A.annua L. ke dalam bakteri endofit dapat terjadi dengan mekanisme difusi pasif dan difusi terfasilitasi. Difusi pasif adalah proses berpindahnya molekul dari konsentrasi yang tinggi menuju konsentrasi rendah, kecepatan dari difusi pasif dipengaruhi oleh besarnya gradien kadar dari molekul. Kecepatan dari difusi nutrien menembus membran sel dapat ditingkatkan dengan menggunakan protein carrier yang terdapat dalam plasma membran sel, mekanisme ini disebut difusi terfasilitasi. Protein carrier menyerupai enzim yang spesifik untuk setiap nutrien yang akan ditransportkan (Prescott, 1999).
Bakteri endofit dalam batang A.annua L dapat memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya, metabolit sekunder yang berpotensi sebagai antibiotik ini diduga sebagai hasil transfer genetik (genetic
recombination) dari A.annua L. ke dalam bakteri endofit. Mekanisme transfer
secara pasti. Bioteknologi dapat dijadikan pendekatan untuk mengetahui bagaimana proses transfer genetik ini berlangsung. Praktek-praktek dalam bioteknologi selalu mengandalkan proses genetik alami, seperti mutasi dan rekombinasi genetik (Campbell et al, 2002). Proses transfer genetik antara bakteri endofit dengan tanaman A.annua L diduga berlangsung dengan melibatkan plasmid dari bakteri endofit. Plasmid adalah molekul DNA kecil, sirkular, dan dapat bereplikasi sendiri di dalam sitoplasma sel bakteri (Campbell et al, 2002).
6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate
Isolasi adalah memisahkan suatu mikrobia dari lingkungan di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium biakan (Jutono, dkk, 1980). Setelah didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan isolasi bakteri endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk mendapatkan biakan murni bakteri endofit. Diinokulasikan 1 ose bakteri endofit yang tumbuh di sekitar batang A.annua L. Pada MS Medium secara
streak plate ke permukaan Nutrient Agar dalam cawan petri. Diinkubasikan
pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian didapat koloni- koloni bakteri yang
