SGOT SGPT
METODE PENELITIAN
3.7. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Soyghurt (Suriawiria, 2005)
Tahap awal isolasi ialah melakukan kultur yoghurt komersial merk Bio Kul, tujuannya untuk mengetahui dan meyakinkan bahwa Bio Kul mengandung bakteri Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus seperti yang tertera pada kemasan. Selanjutnya dilakukan isolasi terhadap soyghurt yang di fermentasi dengan waktu yang berbeda yaitu 4, 6, dan 8 jam. Isolasi, penghitungan jumlah koloni, dan identifikasi bakteri pada Bio Kul dan soyghurt dilakukan dengan cara yang sama.
3.7.1. Preparasi Alat dan Bahan
Semua alat dicuci bersih kemudian dikeringkan di dalam oven. Cawan Petri dan semua alat yang dibungkus dengan kertas sampul dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilkan dengan suhu 121 oC, tekanan 1 atm dan dibiarkan selama 15 menit.
3.7.2. Pembuatan Media
Pembuatan media diawali dengan menimbang semua bahan dan dimasukkan ke dalam labu Erlemeyer kemudian ditambahkan dengan akuades. Selanjutnya dipanaskan sambil diaduk dengan magnet stirer. Setelah semua bahan homogen kemudian dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 10-15 ml lalu ditutup dengan menggunakan kapas. Selanjutnya dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilisasi yang suhunya 121 oC, tekanan 1 atm dan dibiarkan selama 15 menit (Hadioetomo, 1985).
3.7.3. Pengenceran Sampel
Pengenceran dilakukan dengan menggunakan larutan pengencer NaCl fisiologis 0,85%. Dari masing-masing soyghurt diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml larutan NaCl fisiologis kemudian di homogenkan, larutan ini merupakan larutan pengenceran 10-1. Selanjutnya dipipet sebanyak 1 ml dari pengenceran 10-1 untuk di masukkan ke dalam tabung reaksi berikutnya sehingga menjadi pengenceran 10-2 kemudian di
homogenkan. Demikian selanjutnya dengan cara yang sama dibuat hingga pengenceran 10-10.
3.7.4. Isolasi Bakteri Asam Laktat
Pada isolasi bakteri asam laktat ini digunakan media isolasi yang spesifik yaitu media selektif, media MRS (de Man Rogosa Sharpe) agar (Oxoid, 2006). Media ini digunakan untuk menumbuhkan dan memelihara bakteri tertentu. Dengan sifat kekhususannya maka akan menyeleksi bakteri asam laktat secara langsung. Pada isolasi bakteri asam laktat, media yang digunakan ialah media MRS agar.
Sampel dalam tabung reaksi pada pengenceran 10-1 – 10-10 diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet, dituangkan ke dalam masing-masing cawan Petri, kemudian media MRSA dalam tabung reaksi dituangkan ke dalam cawan Petri (Gambar 3.1). Penuangan ke dalam cawan dilakukan secara duplo dari pengenceran 10-1 – 10-10. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa dalam masing-masing ulangan didapatkan hasil yang sama. Campuran tersebut kemudian dihomogenkan dengan cara, menggerakkan Petri dengan arah membentuk angka delapan. Setelah MRSA pada cawan Petri menjadi beku masing-masing cawan Petri dibungkus, kemudian diinkubasi dengan posisi cawan terbalik pada suhu 37 oC selama 48 jam. Koloni bakteri yang berkembang, selanjutnya dimurnikan dengan membuat biakan ke media MRSA miring dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasikan selama 48 jam. Media MRSA miring ini digunakan sebagai bahan untuk identifikasi bakteri (Hardiningsih, 2006).
Gambar 3.7.4. Cara Pengenceran Soyghurt untuk Isolasi Bakteri pada Media Biakan dalam Cawan Petri
3.7.5. Penghitungan Jumlah Koloni Bakteri Asam Laktat
Media MRSA pada cawan Petri yang telah diinkubasi pada inkubator selama dua hari kemudian dilakukan pengamatan untuk mengetahui bentuk dan warna koloni, selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah koloni bakteri, dilakukan terhadap cawan yang mempunyai 30 sampai 300 koloni bakteri (Hadioetomo, 1985; Cappuccino dan Sherman, 2002).
3.7.6. Identifikasi Bakteri Asam Laktat
Isolat yang diperoleh dari kultur dalam media MRSA kemudian dilakukan identifikasi untuk mengetahui sifat morfologi dan sifat fisiologisnya dengan berpedoman pada buku Bergey’s Determinative Bacteriology (Buchanan dan Gibbons, 1974). Sifat morfologi yang diamati terdiri dari: pewarnaan Gram dan motilitas bakteri. Sedangkan pengamatan sifat fisiologis bakteri dilakukan dengan berbagai uji, antara lain adalah: uji katalase, indol, H2S, pembentukan gas, fermentasi glukosa, penggunaan sitrat sebagai sumber energi, reduksi nitrat, hidrolisis pati, kemampuan tumbuh pada suhu tertentu, dan fermentasi karbohidrat (Safitri, 2010).
3.7.6.1. Pewarnaan Gram (Suriawiria, 2005)
Preparat ulas dibuat pada gelas objek, difiksasi di atas api bunsen. Preparat ditetesi dengan larutan kristal violet dan biarkan selama 1 menit, dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian preparat ditetesi dengan larutan iodin biarkan selama 1 menit, bilas dengan air mengalir kemudian ditetesi dengan alkohol 96% sampai warna ungu hilang, setelah dibilas lagi dengan air, kemudian preparat ditetesi safranin dan didiamkan selama 1 menit, dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat ditetesi dengan minyak imersi, kemudian diamati dengan mikroskop. Bakteri dinyatakan bersifat Gram positif jika warna selnya ungu dan Gram negatif jika warna selnya merah.
3.7.6.2. Uji Motilitas (Lay, 1994)
Isolat diambil dari agar miring dan ditusukkan pada agar tegak semi solid SIM (Sulfur Indol Motility), kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam.
Bila pertumbuhan menyebar maka bakteri tersebut motil dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut non motil.
3.7.6.3. Uji Katalase (Lay, 1994)
Isolat dari agar miring diambil satu ose, kemudian dioleskan pada gelas benda yang telah diberi alkohol. Gelas benda ditetesi dengan larutan H2O2 3%. Diamati terbentuknya gelembung gas pada preparat. Jika terdapat gelembung gas berarti uji katalase tersebut positif.
3.7.6.4. Uji Indol (Lay, 1994)
Uji indol digunakan untuk melihat pembentukan indol oleh bakteri. Cara pengujian: satu ose bakteri ditanam dalam media SIM, diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 48 jam. Lalu diteteskan reagen Kovacks (terdiri dari dimetil aminobenzaldehid, n-amyl alkohol dan HClp), jika terbentuk cincin merah berarti positif dan jika terbentuk cincin kuning berarti negatif. Terbentuknya cincin merah karena bakteri membentuk indol dari triptopan sebagai sumber karbon.
3.7.6.5. Uji H2S, Fermentasi Glukosa dan Pembentukan Gas (Cappucino dan Sherman, 2002)
Pada uji ini digunakan medium Triple Sugar Iron agar (TSIA). Uji tersebut bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa, laktosa atau sukrosa, pembentukan gas dari glukosa dan produksi H2S. Prosedur uji ini adalah isolat yang akan diuji diinokulasi pada agar miring TSIA dengan cara membuat goresan pada media agar miring dan menusukannya pada bagian bawah agar. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 oC selama 48 jam. Diamati perubahan terhadap media agar, reaksi yang terjadi basa/merah, asam/kuning. Terdapat 5 interprestasi dari TSIA yaitu: -jika media pada bagian atas dan bawah berwarna merah tidak terjadi fermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa; -jika media bagian atas berwarna merah dan bagian bawah berwarna kuning terjadi fermentasi glukosa saja; -jika media bagian atas dan bagian bawah berwarna kuning terjadi fermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa; -jika bagian bawah media agar
pecah/terangkat ke atas artinya ada memproduksi gas; -jika bagian bawah agar berwarna hitam artinya ada memproduksi H2S.
3.7.6.6. Uji Sitrat (Cappucino dan Sherman, 2002)
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Satu ose bakteri diinokulasikan ke dalam media Simmons Citrate agar, inkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 48 jam, warna biru pada media menunjukkan reaksi positif, warna hijau menunjukkan reaksi negatif.
3.7.6.7. Uji Reduksi Nitrat (Hadioetomo, 1985)
Dalam uji reduksi nitrat, bakteri diinokulasi ke dalam Nitrate Broth. Setelah inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam, tetesi tiga tetes larutan asam
sulfanilat dan tiga tetes larutan dimetil alpa-naphtylamin. Bila bakteri yang diuji dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit, maka akan segera terbentuk warna merah, dan negatif jika tidak terjadi perubahan warna.
3.7.6.8. Uji Hidrolisis Pati (Cappucino dan Sherman, 2002)
Bakteri yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium Starch agar. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 oC selama 48 jam. Setelah inkubasi, koloni yang tumbuh ditetesi larutan garam iodium sehingga semua bagian agar terendam. Uji hidrolisis pati positif ditandai dengan terbentuknya bagian yang transparan (bening) di sekeliling koloni yang tumbuh.
3.7.6.9. Uji Ketahanan Suhu (Cappucino dan Sherman, 2002)
Isolat di larutkan ke dalam media MRS broth, inkubasi pada suhu 10 oC dan 45 oC selama 48 jam. Jika media keruh terjadi pertumbuhan bakteri.
3.7.6.10. Fermentasi Karbohidrat (Lay, 1994)
Lima tabung yang berisi media karbohidrat (manitol, mannosa, galaktosa, laktosa, fruktosa) diinokulasikan dengan biakan isolat. Ditambahkan media BCP (Brom Cresol Purple) sebagai indikator asam. Inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Diamati perubahan warnanya, positif jika medium berubah menjadi
kuning artinya isolat tersebut mampu memfermentasi karbohidrat, negatif jika medium tetap berwarna ungu.