Bahan yang digunakan dalam penelitian tahap I ini yaitu isolat bakteri asam laktat (BAL) yang telah diisolasi dari usus ayam kampung, bakteri indikator Escherichia coli yang diisolasi dari feses ayam, media yang digunakan adalah medium selektif MRSA (deMan Rogosa Sharp Agar), deMan Rogosa Sharp Broth (MRSB), Eosin Methylene Blue Agar
(EMBA), Nurient Broth (NB), Nutrient Agar (NA), Muller Hilton Agar (MHA), penicilin, PP 1%, NaOH 0,1N, aquades, NaCl fisiologis 0,85%, kristal violet, iodin, alkohol asam, safranin, HCl, etanol 70%, CaCO3 1%, reagen H2O2 3%, garam empedu sintetik (Ox bile) 1% dan 5%, kertas cakram, alkohol 70%, medium SIM (Sulfid Indol Motility), minyak emersi.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, laminar flow, jarum ose, inkubator, cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, inkubator shaker, sentrifuse, mikropipet, gelas objek, neraca analitik, desikator, pipet tetes, pH meter, holder milipore dan milipore 0,22 µm, pipet valumetrik, pipet 5 ml, kapas, aluminium foil, kertas saring, pemanas bunsen, jangka sorong, oven, lemari pendingin, water bath, termometer, gelas ukur, hot plate, preparat, mikroskop, kertas cakram, pipet pasteur, jangka sorong, scapel (pisau kecil), penjepit tabung, rak tabung reaksi, spoit, termos
Prosedur Penelitian Tahap I
1. Isolasi dan Karakteristik BAL Asal Ayam Kampung
BAL diisolasi dari berbagai segmen pada saluran pencernaan ayam kampung yaitu pada proventriculus, ventriculus, yeyenum, ileum, usus besar dan cecum. Isolasi dilakukan dengan mensuspensikan 1 gram dari masing-masing saluran pencernaan ayam kampung kedalam 100 ml larutan NaCl 0,85% secara aseptis. Kemudian dibuat pengenceran 10-2 –107. Sebanyak 1 mL hasil pengenceran tadi kemudian diinokulasikan pada medium MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar) yang mengandung CaCO3 1 % kemudian diinkubasikan pada suhu 370
Setiap koloni yang terbentuk diamati dan diidentifikasi berdasarkan morfologi, reaksi pengecatan gram, pembentukan gas, pengujian katalase kemudian penamaan taksonomi dilakukan menggunakan Bergey’s manual of Determinative Bacteriology (Buchanan and Gibbons, 1974). Masing-masing koloni yang teridentifikasi ditumbuhkan kembali dalam medium MRSB. Inkubasi pertumbuhan BAL dilakukan pada suhu 37
C selama 48 jam. Koloni yang menunjukkan zona bening disekitar koloni menunjukkan bahwa koloni tersebut adalah bakteri asam laktat (BAL).
o
Koloni yang terpisah dengan bentuk dan ukuran yang berbeda diambil menggunakan jarum ose steril dan digoreskan pada MRSA yang telah beku dan diinkubasi pada kondisi yang sama membentuk goresan kuadran. Penggoresan dilakukan sampai diperoleh koloni yang seragam. Koloni yang murni dipilih, lalu dilakukan pewarnaan gram dan uji katalase.
C selama 48 jam.
2. KarakteristikBAL Berdasarkan Morfologi
Tahap awal pemurnian dimulai dengan memilih koloni tunggal yang tumbuh pada medium MRSA setelah diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya mengambil koloni tunggal pada kultur, kemudian diinokulasikan secara goresan pada medium MRSA dan diinkubasi pada temperatur 370C selama 48 jam. Koloni dari kultur murni selanjutnya diamati morfologinya. Identifikasi isolat BAL berdasarkan bentuk (coccus, rod-shape,
coccobacillus) dan penataan bentuk (tunggal, berpasangan, rantai) dilakukan dengan pengamatan menggunakan mikroskop (Buchanan and Gibbons, 1974).
3. KarakteristikBAL BerdasarkanReaksi Pewarnaan Gram
Prosedur pewarnaan mengikuti metode (Djide dan Sartini, 2008), dalam Trisna (2012), biakan bakteri diambil dari stok dan diratakan diatas preparat yang telah dibersihkan menggunakan etanol 70%. Kemudian difiksasi diatas api bunsen lalu ditetesi dengan zat warna kristal violet selama 1 menit agar zat warna meresap pada bakteri. Preparat kemudian dibilas dengan aquades mengalir dan ditetesi dengan larutan iodine kompleks. Kemudian ditunggu selama 1 menit lalu dibilas dengan aquades mengalir. Preparat dicuci dengan alkohol asam. Kemudian ditetesi dengan zat warna safranin, lalu ditunggu 30 detik. Setelah itu dikeringkan dan diperiksa dibawah mikroskop dengan menggunakan minyak imersi.
4. Karakteristik BAL Berdasarkan Uji Motilitas
Sebanyak 1 ose isolat diambil dari stok kemudian diinokulasikan dengan cara ditusuk pada medium SIM tegak. Selanjutnya diinkubasi pada temperatur 370C selama 48 jam. Hasil positif (motil) jika terdapat rambatan – rambatan disekitar bekas tusukan jarum pada medium dan hasil negatif (non motil) bila tidak terdapat rambatan-rambatan disekitar bekas tusukan jarum ose pada medium.
5. Karakteristik BAL Berdasarkan Uji Katalase
Sebanyak 2 tetes larutan hidrogen peroksida (H2O2) 3% diteteskan pada gelas obyek bersih, kemudian ditambahkan inokulum BAL. Uji positif ditandai denganterbentuknya gelembung oksigen dan uji negatif tidak adanya gelembung gas (isolat tidak tumbuh) (Madigan et al., 2003).
6. Uji Ketahanan BAL terhadap Keasaman Lambung (pH), Garam Empedu dan Suhu a. Uji Ketahanan terhadap Keasaman Lambung (pH)
Menurut Djide dan Wahyuddin (2008), uji ketahanan terhadap asam dilakukan dengan menggunakan medium MRSB yang ditambahkan dengan HCl 0,1 N untuk mendapatkan pH 2,5 dan 3 (sesuai dengan pH lambung). Sebanyak 1 ose (ose bulat) masing-masing isolat bakteri yang diambil dari stok kultur kemudian diinokulasikan pada medium MRSB-HCl. Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370
b. Uji Ketahanan terhadap Garam Empedu
C. Hasil positif apabila terjadi pertumbuhan bakteri pada medium dan hasil negatif apabila tidak terjadi pertumbuhan bakteri pada medium.
Ketahanan isolat mikroba terhadap garam empedu digunakan untuk mengkaji kemampuan isolat bertahan pada saluran pencernaan yang terdapat garam empedu pada permukaan atas usus. Pengujian dilakukan menurut metode Djide dan Wahyuddin (2008). Metode ini dilakukan dengan menambahkan garam empedu sintetik (oxbile) dengan konsentrasi 1 % dan 5 % pada medium MRSB. Selanjutnya isolat bakteri diambil dari stok sebanyak 1 ose kemudian diinokulasikan pada medium MRSB – garam empedu. Diinkubasi selama 48 jam dengan temperatur 370
c. Uji Ketahanan terhadap Suhu
C. Ketahanan terhadap garam empedu ditentukan berdasarkan ada tidaknya pertumbuhan bakteri pada medium. Hasil positif jika ditandai dengan adanya endapan pada dasar tabung dan adanya perubahan media menjadi lebih keruh dibandingkan sebelum diinkubasi.
Isolat bakteri diambil dari stok sebanyak 1 ose kemudian diinokulasikan pada medium MRSB. Selanjutnya medium yang telah berisi isolat diinkubasi pada temperatur 150C, 370C, dan 450C selama 48 jam. Kemudian diamati apakah terjadi petumbuhan bakteri pada medium. Hasil positif apabila terjadi pertumbuhan bakteri pada medium dan hasil negatif apabila tidak terjadi pertumbuhan bakteri pada medium.
7. Penentuan Jumlah Koloni BAL
Jumlah koloni BAL dari isolat diukur menggunakan metode Total Plate Count (TPC) (Fardiaz, 1992). Sebanyak 1 g isolat hasil sentrifugassi dimasukkan ke petri dalam 9 ml NaCl fisiologis 0.85%, lalu diencerkan sampai pengenceran 7 kali secara serial. Sebanyak 0,1 ml dari pengenceran 6 dan 7 kali ditanam pada cawan petri berisi media MRS agar. Media agar yang ditanam kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Koloni yang tumbuh berbentuk bulat miring berwarna agak kekuningan. Kemudian dihitung sebagai beirikut:
Populasi BAL (cfu/g) = Jumlah koloni X Pengenceran
8. Uji Daya Hambat BAL terhadap Bakteri E.coli
a. Isolasi Bakteri Uji E.coli
Sampel feses segar dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi NaCl fisiologis 10 ml. Diambil 1 tetes feses yang sudah dihomogenkan dengan larutan NaCl fisiologis. Sebanyak 15 ml media Eosin Methylene Blue (EMB) dimasukkan ke dalam cawan petri untuk disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah sterilisasi media diambil dari strerilisator untuk selanjutnya didiamkan pada suhu kamar agar media menjadi padat. Dari pengenceran sampel yang dikehendaki, sebanyak 0,1 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam cawan petri dengan metode sebar menggunakan gelas bengkok. Inkubasi dilakukan pada suhu 370C selama 18-24 jam. Setelah akhir inkubasi, koloni yang tumbuh dan berwarna hijau metalik dengan titik hitam pada bagian tengahnya dihitung sebagai koloni E. coli. Koloni yang tumbuh dikoleksi dengan cara diinokulasikan pada media nutrien agar (NA) miring untuk pemeriksaan selanjutnya.
b. Uji Daya Hambat BAL terhadap E.coli
Untuk mengetahui bahwa isolat bakteri mempunyai potensi yang bagus sebagai bakteri BAL maka perlu dilakukan uji daya hambat terhadap bakteri patogen. Bakteri patogen yang digunakan adalah E.coli (bakteri gram negatif).Untuk perlakuan kontrol positif digunakan kertas cakram yang telah berisi antibiotika amoksilin, karena kloramfenikol memiliki sensitivitas yang sangat tinggi, dimana pada dosis 30 μg/kertas cakram mampu menghasilkan diameter zona hambat sebesar 25-31 mm (Fardiaz, 1992).
Langkah awal yang dilakukan adalah menginokulasi 1 ose (ose bulat) isolat dari stok kultur pada medium MRSA miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Hal yang sama dilakukan terhadap bakteri uji (E. coli) yang diinokulasikan pada medium NAmiring dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C. Sebanyak 1 ml isolat E. coli
diinokulasikan pada medium NA dengan metode tuang sebanyak 20 ml dan dibiarkan memadat membentuk ketebalan agar. Campuran dihomogenkan dengan cara cawan petri digerakkan membentuk angka delapan diatas bidang datar. Sementara itu disiapkan kertas cakram steril lalu direndam sebanyak 10 μl dalam masing-masing suspensi isolat BAL selama 10 menit. Kemudian kertas cakram diletakkan di permukaan medium NA yang telah memadat, lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C untuk memberikan kesempatan supernatan beraktivitas terhadap bakteri uji. Zona bening yang terbentuk menunjukkan adanya hambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji oleh supernatan. Diameter zona bening (mm) diukur dengan jangka sorong sebanyak tiga kali pada posisi yang berbeda dan dirata-ratakan.
Diameter Zona Bening (mm2
V /ml) = LZ –LS Keterangan:
LZ : Luas zona bening (mm2 LS : Luas sumur (mm
) 2
V : Volume contoh (ml) )
9. Pengukuran Total Asam Tertitrasi
Pengukuran total asam tertitrasi dilakukan dengan prinsip titrasi asam basa. Sebanyak 10 ml filtrat dari sampel dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer lalu ditambahkan 3 tetes larutan indikator fenolftalein 1%, selanjutnya dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N hingga terbentuk warna merah muda. Tepat saat warna merah muda terbentuk, titrasi dihentikan. Total asam tertitrasi dinyatakan sebagai persen asam laktat. Total asam dapat diperoleh melalui perhitungan berikut.
% Asam laktat = V NaOH X V NaOH X FP X BM Asam Laktat X 100% Bobot Sampel X 1000
Keterangan: BM asam laktat = 90.08
