MATERI DAN METODE
HASIL DAN PEMBAHASAN Fraksinasi BIS
IV. ISOLASI PROTEIN BUNGKIL INTI SAWIT MENGGUNAKAN METODE EKSTRAKSI BERTINGKAT
(Sebagian data telah diseminarkan pada Seminar Internasional AINI tanggal 18-
IV. ISOLASI PROTEIN BUNGKIL INTI SAWIT
MENGGUNAKAN METODE EKSTRAKSI BERTINGKAT
PENDAHULUAN
Kandungan protein kasar bungkil inti sawit (BIS) 3 kali lebih rendah dibandingkan dengan bungkil kedelai (16.84 vs 48.00%). Selain itu protein yang ada pada BIS tidak mudah dimanfaatkan oleh ternak. Data sebelumnya menunjukkan bahwa nilai kelarutan protein BIS jauh lebih rendah dibandingkan bungkil kedelai (55.25 vs 75.21%). Nilai kelarutan yang rendah ini senada dengan retensi nitrogen BIS yang dilaporkan oleh Ramli et al. (2008) sebesar 45.2%.Sebaliknya produksi BIS di Indonesia setiap tahun mencapai 1.3 juta ton.
Isolasi protein sangat mungkin dilakukan dalam upaya menghasilkan konsentrat protein yang kandungan proteinnya setara dengan bungkil kedelai. Beberapa peneliti melaporkan bahwa isolasi protein dari daun Azolla africana
Desv dan duckweed (Spirodela polyrrhiza L. Schleiden) mampu meningkatkan protein 3 kali lebih tinggi dari bahan awal masing-masing sebesar 28.10 vs 71.30% dan 25.00 vs 64.60% (Fasakin 1999). Laporan lain menyebutkan bahwa isolasi protein dari pollard mampu meningkatkan kandungan protein dari 14.3% menjadi 35.10% (Haryati & Tangendjaja 1993).
Sebagaimana diketahui bahwa daun-daunan, biji-bijian maupun butir- butiran dapat diekstraksi dan diisolasi proteinnya dengan mudah hanya dengan satu kali ekstraksi, namun tidak demikian halnya dengan BIS. Penelitian pendahuluan menunjukkan bahwa ekstraksi BIS menggunakan NaOH 0.05N hanya menghasilkan rendemen <5% dengan kandungan protein sebesar 27.5%. Oleh karena itu dalam kajian ini dilakukan isolasi protein dengan menggunakan metode ekstraksi bertingkat. Ekstraksi bertingkat yang dimaksud dalam penelitian ini adalah melakukan ekstraksi dengan air panas (hot water extraction) kemudian diendapkan dan dilanjutkan dengan ekstraksi menggunakan NaOH pada produk padatan hasil sentrifugasi.
Tujuan dan Manfaat
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui; (1) proses isolasi terbaik dalam menghasilkan konsentrat protein BIS termasuk didalamnya mengkaji titik isoelektrik protein BIS, (2) profil protein ekstrak BIS dan supernatan sisa pengendapan pada kromatografi filtrasi gel Sephadex G-50 serta asam amino konsentrat protein BIS hasil ekstraksi bertingkat, dan (3) mengetahui kandungan protein kasar konsentrat protein BIS dan jumlah rendemen yang dihasilkan.
Penelitian ini diharapkan memberi informasi tentang metode ekstraksi terbaik dalam mengisolasi protein BIS.
MATERI DAN METODE
Bahan yang digunakan adalah bungkil inti sawit (BIS) yang diperoleh dari Lampung, sedangkan bahan untuk ekstraksi meliputi akuades, asam asetat 0.05N, NaOH 0.05 dan 1N serta pecahan kaca. Sebagai bahan pengendap protein digunakan 0.1N HCl dan etanol. Alat yang digunakan untuk mengekstrak adalah mortal grinder (Retsch KMI), sedangkan untuk separasi fraksi karbohidrat dengan protein dilakukan menggunakan kolom kromatografi filtrasi gel yang diisi Sephadex G-50 dan dilengkapi dengan fraction collector model 2110 Bio-Rad.
Spektrofotometer model Hitachi 0279-019 digunakan untuk mengukur total gula dan protein.
Persiapan BIS
Batok dari BIS terlebih dahulu dipisahkan dari bungkilnya dengan penyaringan pada saringan berdiameter 2 mm sehingga akan diperoleh BIS bebas batok. Jumlah batok dan BIS hasil penyaringan selanjutnya ditetapkan bobotnya.
Optimasi Metode Ekstraksi BIS
Untuk menentukan metode ekstraksi terbaik, pada penelitian ini dilakukan dua metode ekstraksi sebagai berikut :
Ekstraksi tunggal
BIS yang terbebas dari batok diekstraksi dengan menggunakan air panas (hot water extraction). Perlakuan yang diterapkan sebagai berikut; ET1 (200 gr BIS+100 gr pecahan kaca+ 800 ml akuades)+0.1N HCl diatur pada pH 3, ET2
(200 gr BIS+100 gr pecahan kaca+ 800 ml akuades)+ 0.1N HCl diatur pada pH 4, ET3 (200 gr BIS+100 gr pecahan kaca+ 800 ml akuades)+80% etanol (1:1) dan ET4 (200 gr BIS+100 gr pecahan kaca+ 800 ml akuades)+90% etanol (1:1). Penambahan HCl dan etanol dilakukan untuk mengendapkan protein. Pemisahan padatan dari supernatan dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit (Gambar 14).
Ekstraksi Bertingkat
a. Pengekstrak akuades dan NaOH 0.05 N
Pada ekstraksi bertingkat ini digunakan aquades dan NaOH 0.05N serta bahan pengendap HCl dan etanol. Perlakuan yang diterapkan sebagai berikut; EB1 (200 gr BIS+800 ml aquades+100 gr pecahan kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH 0.05N)+ 0.1N HCl diatur pada pH 3, EB2 (200 gr BIS+800 ml aquades +100 gr pecahan kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH 0.05N)+ 0.1N HCl diatur pada pH 4, EB3 (200 gr BIS+800 ml aquades +100 gr pecahan kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH 0.05N) + 80% etanol (1:1) dan EB4 (200 gr BIS+800 ml aquades +100 gr pecahan kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH 0.05N) + 90% etanol (1:1). Untuk memisahkan padatan dengan supernatan dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit(Gambar 15)
b. Pengekstrak akuades, asetat 0.05N dan NaOH 1 N
Pada tahap ini dilakukan ekstraksi menggunakan metode kombinasi fisik dan kimiawi dengan pelarut akuades, asam asetat 0.05N dan NaOH 1 N serta 0.1N HCl sebagai satu-satunya bahan pengendap. Perlakuan yang diterapkan sebagai berikut; E1 (200 gr BIS + 800 ml akuades + 100 gr kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH teknis 1N); E2 (200 gr BIS + 800 ml akuades + 100 gr kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH pa 1N); E3 (200 gr BIS + 800 ml asam asetat 0.05 N + 100 gr kaca , padatan ditambah 800 ml NaOH teknis 1N) dan E4 (200 gr BIS + 800 ml asam asetat 0.05 N + 100 gr kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH pa 1N). Untuk memisahkan padatan dengan supernatan dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit (Gambar 16).
Produk endapan setelah dikeringkan dari kedua metode ekstraksi tersebut selanjutnya dinamakan ”Konsentrat Protein Bungkil Inti Sawit (KPBIS)”.
Sebagai indikator untuk menentukan metode yang terbaik adalah dengan cara; manganalisis kandungan protein kasar produk, menghitung jumlah rendemen dengan cara menimbang produk yang dihasilkan dibagi dengan jumlah BIS awal yang diekstraksi (200 gr) dikali 100%, sedangkan protein recovery dihitung dengan cara membagi jumlah protein yang terekstrak (kandungan protein kasar x jumlah rendemen) dibagi jumlah protein pada BIS (kandungan protein kasar BIS x jumlah BIS yang diekstraksi) kali 100%.
Sebagai pembanding pada penelitian ini juga dilakukan ekstraksi untuk mengisolasi protein dari bungkil kedelai (modifikasi perlakuan E3) dengan cara menimbang 200 gr bungkil kedelai + 800 ml asam asetat 0.05 N + 100 gr kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH teknis 1N. Prosedur kerja bertikutnya untuk memperoleh produk, mengikuti proses ekstraksi sebelumnya. Data yang diamati antara lain titik isoelektrik, jumlah rendemen dan protein recovery.
Penentuan Titik Isoelektrik Protein BIS
Penentuan titik isoelektrik (pI) dilakukan dengan cara mengambil 100 ml ekstrak BIS dan dimasukkan ke dalam 7 buah erlemeyer. Larutan ekstrak diatur pH-nya mulai 3 sampai dengan pH 9 dengan cara menambahkan NaOH 0.1 N atau HCl 0.1 N sedikit demi sedikit hingga pH mencapai ( 9, 8, 7, 6, 5, 4 dan 3). Selanjutnya diinkubasi selama satu malam pada suhu dingin. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Endapan yang diperoleh dipisahkan dari supernatan dan dikeringkan pada oven 60oC serta ditimbang. Jumlah endapan yang paling tinggi merupakan indikator titik isoelektrik pada protein BIS dan dipakai sebagai acuan untuk tahap produksi konsentrat protein BIS.
Profil Protein Terekstrak dan Asam Amino Konsentrat Protein BIS Sampel yang digunakan untuk melihat profil protein dan asam amino konsentrat protein BIS adalah mengacu pada perlakuan ekstraksi terbaik (E3). Pemisahan fraksi protein dengan fraksi karbohidrat pada kromatografi filtrasi gel dilakukan dengan cara mengambil supernatan hasil sentrifugasi produk ekstraksi. Sebelum dimasukkan kedalam kromatografi filtrasi gel terlebih dahulu sampel didialisis menggunakan tabung dialisis (dialisis tube) dengan ukuran pori-
pori 12 000 um serta direndam dalam akuades selama 4 malam pada suhu 4oC. Produk dialisis (dialisat) dipekatkan menggunakan evaporator dan disentrifugasi sebelum diinjeksikan ke dalam kromatografi filtrasi gel Sephadex G-50 (135 x 630 mm) yang dilengkapi fraction collector. Laju alir yang digunakan adalah 0.5 ml/menit. Fraksi yang diperoleh dihitung total gula dan proteinnya.
Kandungan total gula diukur menggunakan pereaksi asam sulfat pekat dan fenol 5% kemudian diukur menggunakan spektrofotometer (Hitachi 0279-019) pada panjang gelombang 490 nm dengan D-glukosa sebagai standar menurut Dubois et al. (1956), sedangkan protein diukur menggunakan spektro pada panjang gelombang UV 280 nm. Profil asam amino konsentrat protein BIS dilakukan dengan menganalisis asam amino pada endapan protein hasil ekstraksi bertingkat.
Bungkil Inti Sawit
digiling 20 mnt autoclaf t 121oC, 15 mnt Supernatan Padatan direaksikan dengan HCl 0.1N atau etanol (inkubasi semalam) Supernatan Padatan Sentrifugasi 3500 rpm, 15 mnt Dikeringkan Konsentrat Protein BIS BIS+kaca+air
Gambar 14 Alur proses ekstraksi BIS tunggal (ET1 s/d ET4)
Sentrifugasi 3500 rpm, 15 mnt
ET1 (200 gr BIS+100 gr pecahan kaca+ 800 ml akuades) +0.1N HCl-pH 3,
ET2 (200 gr BIS+100 gr pecahan kaca+ 800 ml akuades) + 0.1N HCl- pH 4,
ET3 (200 gr BIS+100 gr pecahan kaca+ 800 ml akuades) +80% etanol (1:1)
ET4 (200 gr BIS+100 gr pecahan kaca+ 800 ml akuades) +90% etanol (1:1).
Bungkil Inti Sawit Digiling 20 mnt autoclaf t 121oC, 15 mnt Supernatan Padatan Digiling 20 mnt Padatan Direndam dengan NaOH 0.05N (semalam) direaksikan dengan HCl 0.1N atau etanol (inkubasi semalam) Supernatan Padatan Sentrifugasi 3500 rpm, 15 mnt Dikeringkan Konsentrat Protein BIS BIS+kaca+air
Gambar 15 Alur proses ekstraksi BIS bertingkat (EB1 s/d EB4)
Supernatan
Sentrifugasi 3500 rpm, 15 mnt Sentrifugasi 3500 rpm, 15 mnt
EB1 (200 gr BIS+800 ml aquades+100 gr pecahan kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH 0.05N)+ 0.1N HCl - pH 3,
EB2 (200 gr BIS+800 ml aquades +100 gr pecahan kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH 0.05N)+ 0.1N HCl - pH 4,
EB3 (200 gr BIS+800 ml aquades +100 gr pecahan kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH 0.05N) + 80% etanol (1:1)
EB4 (200 gr BIS+800 ml aquades +100 gr pecahan kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH 0.05N) + 90% etanol (1:1).
Analisis Data
Data yang diperoleh pada penelitian dilakukan analisis deskriptif berdasarkan penjumlahan dan rataan.
Bungkil Inti Sawit
Digiling 20 mnt autoclaf t 121oC, 15 mnt Supernatan Padatan Digiling 20 mnt Padatan Rendam dengan NaOH 1N (semalam) direaksikan dengan HCl 0.1N (inkubasi semalam) Supernatan Padatan Sentrifugasi 3500 rpm, 15 mnt Dikeringkan Konsentrat Protein BIS
BIS+kaca+air atau asetat 0.05N
Gambar 16 Alur proses ekstraksi BIS bertingkat (E1 s/d E4)
Supernatan
Sentrifugasi 3500 rpm, 15 mnt Sentrifugasi 3500 rpm, 15 mnt
E1 (200 gr BIS + 800 ml akuades + 100 gr kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH teknis 1N) E2 (200 gr BIS + 800 ml akuades + 100 gr kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH pa 1N)
E3 (200 gr BIS + 800 ml asam asetat 0.05 N + 100 gr kaca padatan ditambah 800 ml NaOH teknis 1N)
E4 (200 gr BIS + 800 ml asam asetat 0.05 N + 100 gr kaca, padatan ditambah 800 ml NaOH pa 1N).
HASIL DAN PEMBAHASAN