Abstrak
Faktor transkripsi dari famili gen NAC (NAM, ATAF, CUC) merupakan salah satu faktor transkripsi yang terlibat erat dalam respon terhadap cekaman salinitas. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen SiNAC065 dari empat genotipe hotong, yaitu dua genotipe diduga toleran (ICERI-5 dan ICERI-6) dan
dua genotipe diduga peka (ICERI-4 dan ICERI-10). Fragmen berukuran ± 1300 pb, telah teramplifikasi dari DNA genom keempat genotipe hotong
menggunakan primer spesifik gen SiNAC065. Perunutan basa nukleotida menggunakan metode direct sequencing pada keempat fragmen yang teramplifikasi dan analisis kesejajaran menggunakan BLAST menunjukkan bahwa fragmen tersebut merupakan homolog gen SiNAC065. Metode direct sequencing
hanya dapat membaca sebagian dari fragmen. Oleh karena itu, sub-cloning ke dalam plasmid pMD20 dilakukan agar sekuen full length dari keempat fragmen tersebut dapat diperoleh. Hasil perunutan basa nukleotida pada fragmen yang diinsersikan ke dalam pMD20 menunjukkan bahwa gen SiNAC065 yang diisolasi dari DNA genom genotipe ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6, dan ICERI-10 berukuran 1265 pb. Gen tersebut memiliki satu intron dan dua ekson. Gabungan antara kedua ekson merupakan coding sequence yang menyandikan 325 asam amino. Pensejajaran asam amino hasil translasi fragmen gen SiNAC065 dari empat genotipe hotong menunjukkan bahwa daerah terkonservasi gen SiNAC065 berada pada asam amino ke 19-325 dan memiliki 8 motif terkonservasi. Berdasarkan motif terkonservasinya, SiNAC065 dari keempat genotipe termasuk ke dalam kelompok gen SNAC (stress responsive NACs) yang terlibat dalam respon terhadap cekaman abiotik.
Kata kunci: cekaman abiotik, famili gen NAC, hotong, faktor transkripsi Abstract
Transcription factor gene family of NAC (NAM, ATAF, CUC) is tightly involved in the response to salinity stress. The objective this study was to isolate and characterize the SiNAC065 genes from four foxtail millet genotypes. Fragments (+ 1300 bp) were successfully amplified from the genomic DNA of four foxtail millet genotypes (ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6 and ICERI-10) using gene specific primer. Direct sequencing of the four fragments and BLAST analysis confirmed that the four fragments were SiNAC065 gene homolog. Since direct sequence method could not read the full length sequence of the genes, the SiNAC065 fragments were sub-cloned into pMD20 plasmid and were further sequenced. Sequence analysis results showed that the SiNAC065 genes isolated from the four genotypes were 1265 bp in length with one intron and two exons. The two exons encode 325 amino acids with the conserved domain located between amino acid 19-325. The SiNAC065 protein identified in this study have 8 conserved motives in the conserved region which categorized them as SNAC (stress responsive NACs) orthologs that are involved in the abiotic stress responses.
Pendahuluan
Cekaman salinitas merupakan salah satu cekaman abiotik utama yang membatasi pertumbuhan dan produktivitas tanaman. Respon dinamis tanaman pada level fisiologis, biokimia, dan molekular diperlukan agar tanaman dapat beradaptasi terhadap kondisi lingkungan yang bervariasi. Gen-gen yang terinduksi oleh cekaman abiotik bukan hanya berfungsi untuk melindungi sel dari cekaman abiotik melalui produksi enzim-enzim penting (functional proteins), tetapi juga berfungsi dalam mengatur transduksi sinyal dan ekspresi gen sebagai respon terhadap cekaman (regulatory proteins). Faktor transkripsi (FT) merupakan salah satu kelompok protein regulator yang terinduksi sebagai respon terhadap cekaman abiotik.
Famili gen NAC (NAM, ATAF, CUC) merupakan gen faktor transkripsi yang dilaporkan terlibat erat dalam respon terhadap cekaman abiotik, termasuk salinitas (Olsen et al. 2005). Sejumlah penelitian menggunakan sekuen genomik yang tersedia pada sejumlah spesies telah mengidentifikasi 117 gen NAC pada Arabidopsis, 151 gen NAC pada padi, 79 gen NAC pada anggur (Vitis vinifera), 163 gen NAC pada poplar (Populus trichocarpa) dan masing-masing 152 gen NAC pada kedelai dan tembakau (Nicotiana tabacum) (Puranik et al. 2012) yang menjadikan famili gen NAC sebagai salah satu famili faktor transkripsi terbesar pada tanaman. Puranik et al. (2013) melaporkan bahwa terdapat 147 gen dengan domain NAC pada genom hotong (Setaria italica) yang terbagi ke dalam 11 sub famili. Anggota sub famili VII diduga memiliki fungsi regulatori yang serupa dengan gen ortolog pada spesies lain yang merupakan grup SNAC (stress responsive NAC).
Sejumlah anggota famili gen NAC dilaporkan berperan dalam respon tanaman terhadap cekaman abiotik. Anggota famili gen NAC dari A. thaliana,
AtNAC2, dilaporkan terlibat dalam respon terhadap cekaman salinitas dan pembentukan akar lateral melalui lintasan sinyal etilen dan auksin (He et al. 2005). Ekspresi gen BnNAC5 dari Brassica napus dilaporkan terinduksi oleh cekaman salinitas dan over-ekspresi gen tersebut meningkatkan toleransi Arabidopsis terhadap cekaman salinitas (Zhong et al. 2012). Over-ekspresi gen SNAC1 dari padi dilaporkan meningkatkan toleransi gandum transgenik terhadap cekaman salinitas (Saad et al. 2013). Gen SiNAC065 merupakan salah satu anggota sub famili VII yang ekspresinya dilaporkan terinduksi oleh cekaman kekeringan (20% PEG-6000), salinitas (250 mM NaCl) dan 100 M ethephon pada hotong (Puranik
et al. 2013). Hal tersebut mengindikasikan bahwa gen SiNAC065 mungkin terlibat dalam respon tanaman hotong terhadap cekaman salinitas. Percobaan ini bertujuan untuk mengisolasi gen SiNAC065 dari empat genotipe hotong, yaitu dua genotipe diduga toleran (ICERI-5 dan ICERI-6) dan dua genotipe diduga peka (ICERI-4 dan ICERI-10).
Bahan dan Metode
Percobaan dilaksanakan mulai bulan Maret-Agustus 2015 di Laboratorium
Plant Molecular Biology, Departemen Agronomi dan Hortikultura, IPB dan
Laboratory of Environmental Stress Tolerance Mechanisms, The University of Tokyo. Materi genetik yang digunakan adalah empat genotipe hotong koleksi Balai Penelitian Serealia (BALITSEREAL), yaitu 2 genotipe diduga toleran
(ICERI-5 dan ICERI-6) dan 2 genotipe diduga peka (ICERI-4 dan ICERI-10) terhadap cekaman salinitas.
Isolasi DNA Genom Tanaman
Benih hotong disemai pada tray semai dan dipelihara di dalam rumah kaca di Kebun Percobaan Cikabayan Bawah (240 m dpl). DNA genom diisolasi menggunakan metode cetyl-trimethyl-ammonium bromide (CTAB) (Murray dan Thompson 1980) dari daun muda pada saat bibit berumur 10 HSS. Daun dan 700 µL buffer lysis digerus menggunakan mortar dan pestle. Sampel yang telah halus dipindahkan ke dalam 1.5 mL minitube menggunakan pipet yang telah dipotong ujungnya. Minitube berisi larutan sampel kemudian diinkubasi pada suhu 65oC selama 30 menit, dilanjutkan inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Larutan CIA (chloroform:isoamyl alcohol, 24:1 v/v) ditambahkan ke dalam sampel dengan perbandingan sampel:CIA 1:1 (v/v) untuk purifikasi DNA. Setelah homogenasi, sampel disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Fase atas supernatan yang terbentuk dipindahkan ke minitube baru sebelum dilakukan presipitasi menggunakan isopropanol dingin, dan dibilas menggunakan alkohol 70%. DNA dilarutkan menggunakan 50 µL air (nuclease- free water). DNA hasil isolasi disimpan dalam lemari pendingin bersuhu -200C sampai siap untuk digunakan kembali.
Kuantifikasi dan Cek Kualitas DNA
Kuantifikasi konsentrasi DNA dilakukan menggunakan spektrofotometer (UV-1201) pada panjang gelombang 260 nm. Cek kualitas DNA dilakukan dengan elektroporasi DNA genom pada 1.5 % (b/v) gel agarose dengan 1x buffer TAE (Tris-acetate-EDTA) pada voltase 100 V selama ±30 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan pewarnaan menggunakan ethidium bromide (0.5 mg L-1) selama ±20 detik kemudian gel dipindahkan dan direndam dalam air selama 15 menit untuk selanjutnya divisualisasi menggunakan UV transilluminator (TFP- M/WL).
DNA genom kemudian diencerkan menggunakan ddH2O menjadi working DNA dengan konsentrasi 12 ng L-1. Working DNA kemudian diamplifikasi menggunakan random primer H5 (5‟-AGTCGTCCCG-„3 ; Tm = 36.2oC) untuk menguji kualitas DNA dan memastikan bahwa DNA genom dapat teramplifikasi dalam reaksi PCR. Tiap reaksi PCR dilakukan dengan volume 20 L yang terdiri atas 5 L working DNA (12 ng L-1
), 0.5 L KAPA taq Extra Hotstart, 4 L 5x KAPA taq Extra Buffer, 1.4 L 25 mM MgCl2, 0.6 L 10 mM dNTP, 1 L primer H5, dan 7.5 L ddH2O. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus: denaturasi pada suhu 94oC selama 15 detik, annealling pada suhu 31.2oC selama 15 detik, elongasi pada suhu 72oC selama 1 menit. Pre-denaturasi pada suhu 94oC dilakukan selama 3 menit dan tahap elongasi akhir pada suhu 72oC dilakukan selama 10 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan pewarnaan menggunakan
ethidium bromide (0.5mg L-1) selama ±20 detik kemudian gel dipindahkan dan direndam dalam air selama 15 menit untuk selanjutnya divisualisasi menggunakan UV transilluminator(TFP-M/WL).
Amplifikasi Gen SiNAC065 menggunakan Gene Specific Primer dan Purifikasi Hasil PCR
Amplifikasi gen SiNAC065 dilakukan dengan menggunakan pasangan
3‟) dan SiNAC065•Rv (5‟-CTAGAACATTTCGTCGGCCTCCG-3‟).Tiap reaksi PCR dilakukan dengan volume 30 L dan terdiri atas 15 L GoTaq®Green Master Mix (Promega, USA), 2.5 L primer SiNAC065•Fw (20 M), 2.5 L primer SiNAC065•Rv primer (20 M), 5 L DNA genom hotong (12 ng L-1) dan 5 L ddH2O. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus: denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealling pada suhu 58oC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72oC selama 30 detik. Pre-denaturasi pada suhu 94oC dilakukan selama 2 menit dan tahap elongasi akhir pada suhu 72oC dilakukan selama 7 menit. Visualisasi produk PCR dilakukan dengan elektroforesis pada 1.5% (b/v) gel agarosa yang mengandung 0.001 mg.mL-1 ethidium bromida dalam buffer 1x TAE pada voltase 100 V selama 25 menit untuk selanjutnya divisualisasi menggunakan UV transilluminator. Purifikasi pita DNA berukuran + 1300 pb dari gel agarosa dilakukan FastGeneGel/PCR Extraction Kit (Nippon Genetics Europe GmbH, Germany) mengikuti prosedur perusahaan.
Direct Sequencing, Sub-cloning, Sequencingdan Karakterisasi Gen SiNAC065 Fragmen DNA hasil purifikasi dikirimkan Eurofin (https://eurofinsgenomics.jp/), Jepang, untuk perunutan basa nukleotida (direct sequencing). Perunutan basa nukleotida dilakukan menggunakan primer SiNAC065•Fw dan primer SiNAC065•Rv. Hasil perunutan nukleotida dibandingkan dengan sekuen gen SiNAC065 dari GenBank NCBI menggunakan alogaritma BLASTn (http://blast.ncbi.nlm).
Fragmen DNA SiNAC065 dari hotong genotipe ICERI-4, ICERI-5, ICERI- 6 dan ICERI-10 kemudian diinsersikan ke T-vector pMD20 (TaKaRa, Jepang). Komposisi reaksi ligasi fragmen SiNAC065 dengan T-vector pMD20 terdiri atas ± 80 ng L-1 fragmen DNA, 1 L plasmid pMD20 (50 ng L-1), dan 1x volume DNA Ligation Kit Mighty Mix (TaKaRa, Jepang). Reaksi ligasi dilakukan pada 16oC selama 45 menit. Produk ligasi kemudian ditransformasikan ke sel kompeten
E. coli strain DH5. Minitube berisi 100 L sel kompeten E.coli dari deep freezer
-80oC dicairkan dalam es selama + 2 menit. Produk ligasi ditambahkan ke dalam sel kompeten dan dicampurkan dengan cara menjentik-jentikkan tabung (tapping). Minitube berisi sel kompeten dan produk ligasi kemudian diinkubasi dalam es selama 30 menit. Heat shock dilakukan dengan cara merendam minitube dalam
water bath bersuhu 42oC selama + 35 detik. Minitube kemudian segera diletakkan kembali dalam es selama 1-2 menit sebelum ditambahi 300 L SOC dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam dengan goyangan periodik (shaking). Produk transformasi kemudian disebar secara merata ke cawan petri yang berisi media padat LB (1.5%, b/v) yang mengandung 0.05 mg mL-1 carbenicillin, 0.002% IPTG dan 0.02 mg mL-1 X-Gal (selection plate) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama satu malam (+ 16 jam).
Colony PCR dilakukan untuk mengkonfirmasi insersi produk PCR pada koloni bakteri berwarna putih yang tumbuh pada selection plate. Tiap reaksi PCR dilakukan dengan volume 10 L dan terdiri atas 5 L GoTaq®Green Master Mix (Promega, USA), 1 L primer SiNAC065•Fw (20 M), 1 L primer SiNAC065•Rv primer (20 M), dan 3 L ddH2O. Copy koloni disimpan dalam 200 L media LB cair pada suhu 4oC. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus: denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealling pada suhu 58oC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72oC selama 30 detik. Pre-denaturasi pada suhu 94oC
dilakukan selama 2 menit dan tahap elongasi akhir pada suhu 72oC dilakukan selama 7 menit. Visualisasi produk PCR dilakukan dengan elektroforesis pada 1.5% (b/v) gel agarosa yang mengandung 0.001 mg mL-1 ethidium bromida dalam buffer 1x TAE pada voltase 100 V selama 25 menit. Copy koloni positif kemudian dikulturkan dalam 3 mL media LB cair yang mengandung 0.05mg mL-1 carbenicillin dan diinkubasi pada suhu 37oC selama satu malam (+ 16 jam) dengan goyangan periodik (shaking). Purifikasi plasmid dilakukan FastGenePlasmid MiniKit (Nippon Genetics Europe GmbH, Germany) mengikuti prosedur perusahaan. Plasmid hasil purifikasi kemudian dikirimkan ke Macrogen (http://www.macrogen-japan.co.jp/) untuk perunutan basa nukleotida. Perunutan basa nukleotida dilakukan menggunakan primer M13•Fw•25 (5‟- CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3‟) dan primer M13•Rv•24 (5‟- GGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3‟).
Hasil perunutan nukelotida dibandingkan dengan sekuen gen SiNAC065
dari GenBank NCBI menggunakan alogaritma BLASTn (http://blast.ncbi.nlm). Translasi runutan basa nukleotida menjadi asam amino dilakukan menggunakan perangkat lunak Geneious versi percobaan 8.1.7. Perangkat lunak CLC Sequence Viewer 6 dan ClustalW2 (Larkin et al. 2007) digunakan untuk analisis pensejajaran runutan prediksi asam amino. Analisis filogenetik dilakukan menggunakan metode Neighbour-Joining dengan perangkat lunak MEGA5 (Tamura et al. 2011). Domain terkonservasi pada translasi asam amino gen
SiNAC065ditentukan dengan membandingkan sekuen asam amino SiNAC065 pada penelitian ini dengan sekuen asam amino yang dilaporkan oleh Puranik et al. (2013).
Hasil dan Pembahasan Isolasi DNA Total
DNA genom telah berhasil diisolasi dari daun 4 genotipe hotong. Analisis keutuhan DNA genom dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa. Hasil elektroforesis DNA genom menunjukkan adanya pita yang kontinu (Gambar 12) yang merupakan tipikal pita DNA genom yang baik. Kuantifikasi konsentrasi DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa konsentrasi DNA keempat genotipe hotong berkisar antara 750-1462.5 ng µL-1 (Tabel 15).
Gambar 12 Integritas pita DNA genom daun hotong genotipe ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6 dan ICERI-10
Tabel 15 Estimasi konsentrasi DNA genom 4 genotipe hotong berdasarkan spektrofotometer
Genotipe A260 Konsentrasi DNA (ng µL
-1 ) ICERI-4 0.105 787.5 ICERI-5 0.195 1462.5 ICERI-6 0.108 810 ICERI-10 0.100 750
Amplifikasi DNA menggunakan primer acak dilakukan menguji kualitas DNA dan memastikan bahwa DNA genom dapat teramplifikasi dalam reaksi PCR. DNA genom diencerkan menjadi konsentrasi 12 ng L-1 dan PCR dilakukan menggunakan primer acak H5. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa pita DNA berhasil teramplifikasi pada seluruh genotipe hotong (Gambar 13). Hasil elektroforesis DNA genom (Gambar 12) dan hasil elektroforesis PCR menggunakan primer acak (Gambar 13) menunjukkan bahwa DNA keempat genotipe hotong cukup baik kualitasnya dan dapat digunakan pada proses lanjutannya.
Gambar 13 Visualisasi hasil elektroforesis amplifikasi random primer H5 pada 4 genotipe hotong. M = ladder 100 bp dengan konsentrasi gel agarose 1.5 % (b/v)
Isolasi Gen SiNAC065 dari Empat Genotipe Hotong
Perbedaan respon anatomi akar terhadap cekaman salinitas pada genotipe toleran (ICERI-5 dan ICERI-6) dan peka (ICERI-4 dan ICERI-10) menunjukkan bahwa respon akar terhadap cekaman salinitas menentukan toleransi hotong terhadap cekaman tersebut. Nibau et al. (2008) melaporkan bahwa anggota famili gen NAC terlibat dalam respon akar terhadap cekaman salinitas. Gen SiNAC065 merupakan salah satu anggota famili gen NAC yang ekspresinya diinduksi oleh cekaman salinitas (250 mM NaCl) (Puranik et al. 2013). Oleh karena itu, homolog gen SiNAC065 diisolasi dari DNA genom 4 genotipe hotong (ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6, dan ICERI-10). Amplifikasi fragmen SiNAC065 dari 4 genotipe hotong menggunakan pasangan primer spesifik menghasilkan pita berukuran +1300 pb (Gambar 14).
Gambar 14 Elektroforegram produk amplifikasi PCR yang berasal dari DNA genom 4 genotipe hotong, menggunakan pasangan primer SiNAC065; M=DNA ladder 100 pb.
Ukuran fragmen tersebut lebih besar dibandingkan sekuen SiNAC065 (975 pb) yang tersedia pada GenBank (Nomor aksesi: XM_004971405.1). Hal ini diduga karena fragmen SiNAC065 pada penelitian ini diamplifikasi dari DNA genom, sedangkan sekuen SiNAC065 yang tersedia pada GenBank diamplifikasi dari cDNA (Puranik et al. 2013). Perunutan basa nukleotida tanpa sub cloning ke dalam plasmid (direct sequencing) dilakukan untuk memastikan bahwa fragmen yang teramplifikasi adalah benar fragmen gen SiNAC065.
Analisis pensejajaran urutan basa nukleotida fragmen SiNAC065 dari keempat genotipe hotong dengan sekuen gen homolog yang tersedia pada GenBank NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) menggunakan alogaritma BLASTn menunjukkan bahwa fragmen SiNAC065 dari keempat genotipe hotong memiliki kesamaan yang tinggi dengan gen homolog pada S. italica (XM_004971405.1) yang dilaporkan oleh Puranik et al. (2013). Hal tersebut menunjukkan bahwa fragmen berukuran + 1300 pb yang teramplifikasi dari keempat genotipe hotong merupakan gen homolog SiNAC065.
Sekuen yang terbaca dengan perunutan basa nukleotida tanpa sub cloning (direct sequencing) hanya + 1200 pb dari total ukuran fragmen yang teramplifikasi + 1300 pb. Bagian ujung 5’ dan ujung 3’ dari fragmen SiNAC065 dari keempat genotipe hotong tidak dapat terbaca dengan jelas menggunakan metode direct sequencing. Oleh karena itu, fragmen SiNAC065 dari keempat genotipe hotong diinsersikan ke T-vector pMD20 dan perunutan basa nukleotida dilakukan kembali menggunakan primer yang berasal dari bagian plasmid.
Karakterisasi Gen SiNAC065 dari Empat Genotipe Hotong
Hasil perunutan basa nukleotida fragmen SiNAC065 yang diinsersikan pada plasmid pMD20 menunjukkan bahwa gen SiNAC065 dari hotong genotipe ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6 dan ICERI-10 berukuran 1 265 pb. Selain disimpan dalam GenBank, sekuen gen SiNAC yang diisolasi dari hotong genotipe ‘Yugu1’ pada penelitian Puranik et al. (2013) juga dideposit pada pangkalan data portal Joint Genome Institute (JGI) bernama Phytozome (https://phytozome.jgi.doe- .gov/pz/portal.html).
‘Yugu1’ ATGGGAGAAGCAGAAGCATCAGCAGGCGGGTCGTTGGTGTTCCGCGGGTGCCAGCTGCCT 60 ICERI-4 ATGGGAGAAGCAGAAGCATCAGCAGGCGGGTCGTTGGTGTTCCGCGGGTGCCAGCTGCCT 60 ICERI-5 ATGGGAGAAGCAGAAGCATCAGCAGGCGGGTCGTTGGAGTTCCGCGGGTGCCAGCTGCCT 60 ICERI-6 ATGGGAGAAGCAGAAGCATCAGCAGGCGGGTCGTTGGTGTTCCTCGGGTGCCAGCTGCCT 60 ICERI-10 ATGGGAGAAGCAGAAGCATCAGCAGGCGGGTCGTTGGTGTTCCGCGGGTGCCAGCTGCCT 60 ************************************* ***** **************** ‘Yugu1’ CCGGGGTTTCGCTTCCAGCCCACCGATCAGGAGATCATCGTCTGCTACCTCAAGAAGAAG 120 ICERI-4 CCGGGGTTTCGCTTCCAGCCCACCGATCAGGAGATCATCGTCTGCTACCTCAAGAAGAAG 120 ICERI-5 CCGGGGTTTCGCTTCCAGCCCACCGATCAGGAGATCATCGTCTGCTACCTCAAGAAGAAG 120 ICERI-6 CCGGGGTTTCGCTTCCAGCCCACCGATCAGGAGATCATCGTCTGCTACCTCAAGAAGAAG 120 ICERI-10 CCGGGGTTTCGCTTCCAGCCCACCGATCAGGAGATCATCGTCTGCTACCTCAAGAAGAAG 120 ************************************************************ ‘Yugu1’ ATCGACGCCGCCACCGCCGTCACCTCCATCATCGCCGACGTCGACATCTACAAGTTCGAC 180 ICERI-4 ATCGACGCCGCCACCGCCGTCACCTCCATCATCGCCGACGTCGACATCTACAAGTTCGAC 180 ICERI-5 ATCGACGCCGCCACCGCCGTCACCTCCATCATCGCCGACGTCGACATCTACAAGTTCGAC 180 ICERI-6 GTCGACGCCGCCACCGCCGTCACCTCCATCATCGCCGACGTCGACATCTACAAGTTCGAC 180 ICERI-10 ATCGACGCCGCCACCGCCGTCACCTCCATCATCGCCGACGTCGACATCTACAAGTTCGAC 180 *********************************************************** ‘Yugu1’ CCATGGGACCTCCCGGGTCAGTGCTCGATCATCTCTCCTCCATTTCATCATGCACTGCAT 240 ICERI-4 CCATGGGACCTCCCGGGTCAGTGCTCGATCATCTCTCCTCCATTTCATCATGCACTGCAT 240 ICERI-5 CCATGGGACCTCCCGGGTCAGTGCTCGATCATCTCTCCTCCATTTCATCATGCACTGCAT 240 ICERI-6 CCATGGGACCTCCCGGGTCAGTGCTCGATCATCTCTCCTCCATTTCATCATGCGCTGCAT 240 ICERI-10 CCATGGGACCTCCCGGGTCAGTGCTCGATCATCTCTCCTCCATATCATCATGCACTGCAT 240 ******************************************* ********* ****** ‘Yugu1’ GCATCGACCTAAGCTAGCAGATCGATCGCTTGCCATTCCAGTGATCAGCAGGCTCTGATC 300 ICERI-4 GCATCGACCTAAGCTAGCAGATCGATCGCTTGCCATTCCAGTGATCAGCAGGCTCTGATC 300 ICERI-5 GCATCGACCTAAGCTAGCAGATCGATCGCTTGCCATTCCAGTGATCAGCAGGCTCTGATC 300 ICERI-6 GCATCGACCTAAGCTAGCAGATCGATCGCTTGCCATTCCAGTGATCAGCAGGCTCTGATC 300 ICERI-10 GCATCGACCTAAGCTAGCAGATCGATCGCTTGCCATTCCAGTGATCAGCAGGCTCTGATC 300 ************************************************************ ‘Yugu1’ TAGTACCTATCCTTAATTTGATTTCTTTAATCTCCCGTACGTACGTCGTCGTTGAGAACA 360 ICERI-4 TAGTACCTATTCTTAATTTGATTTCTTTAATCTCCCGTACGTACGTCGTCGTTGAGAACA 360 ICERI-5 TAGTACCTATCCTTAATTTGATTTCTTTAATCTCCCGTACGTACGTCGTCGTTGAGAACA 360 ICERI-6 TAGTACCTATCCTTAATTTGACTTCTTTAATCTCCCGTACGTACGTCGTCGTTGAGAACA 360 ICERI-10 TAGTACCTATCCTTAATTTGATTTCTTTAATCTCCCGTACGTACGTCGTCGTTGAGAACA 360 ********** ********** ************************************** ‘Yugu1’ AGGTAGCAGCAGCTTCTCTTCTCTTTGTCCTGTCCGCTACAAACAAACCATGCACGACGA 420 ICERI-4 AGGTAGCAGCAGCTTCTCTTCTCTTTGTCCTGTCCGCTACAAACAAACCATGCACGACGA 420 ICERI-5 AGGTAGCAGCAGCTTCTCTTCTCTTTGTCCTGTCCGCTACAAACAAACCATGCACGACGA 420 ICERI-6 AGGTAGCAGCAGCTTCTCTTCTCTTTGTCCTGTCCGCTACAAACAAACCATGCACGACGA 420 ICERI-10 AGGTAGCAGCAGCTTCTCTTCTCTTTGTCCTGTCCGCTACAAACAAACCATGCACGACGA 420 ************************************************************ ‘Yugu1’ CGACGACCAAGCTGATGCTGATGCTGATCCATGGAGGCCATCCAATTATTTACTACATGC 480 ICERI-4 CGACGACCAAGCTGATGCTGATGCTGATCCATGGAGGCCATCCAATTATTTACTACATGC 480 ICERI-5 CGACGACCAAGCTGATGCTGATGCTGATCCATGGAGGCCATCCAATTATTTACTACATGC 480 ICERI-6 CGACGACCAAGCTGATGCTGATGCTGATCCATGGAGGCCATCCAATTATTTACTACATGC 480 ICERI-10 CGACGACCAAGCTGATGCTGATGCTGATCCATGGAGGCCATCCAATTATTTACTACATGC 480 ************************************************************ ‘Yugu1’ GTGCAGACAAGGCGGCCATGTTCGGCGACGGCGAGTGGTTCTTCTTCAGCCCTCGAGACC 540 ICERI-4 GTGCAGACAAGGCGGCCATGTTCGGCGACGGCGAGTGGTTCTTCTTCAGCCCTCGAGACC 540 ICERI-5 GTGCAGACAAGGCGGCCATGTTCGGCGACGGCGAGTGGTTCTTCTTCAGCCCTCGAGACC 540 ICERI-6 GTGCAGACAAGGCGGCCATGTTCGGCGACGGCGAGTGGTTCTTCTTCAGCCCTCGAGACC 540 ICERI-10 GTGCAGACAAGGCGGCCATGTTCGGCGACGGCGAGTGGTTCTTCTTCAGCCCTCGAGACC 540 ************************************************************ ‘Yugu1’ GCAAGTACCCCAACGGCGCCCGCCCCAACCGCAGGGCCGGCTCCGGCTACTGGAAGGCCA 600 ICERI-4 GCAAGTACCCCAACGGCGCCCGCCCCAACCGCAGGGCCGGCTCCGGCTACTGGAAGGCCA 600 ICERI-5 GCAAGTACCCCAACGGCGCCCGCCCCAACCGCAGGGCCGGCTCCGGCTACTGGAAGGCCA 600 ICERI-6 GCAAGTACCCCAACGGCGCCCGCCCCAACCGCAGGGCCGGCTCCGGCTACTGGAAGGCCA 600 ICERI-10 GCAAGTACCCCAACGGCGCCCGCCCCAACCGCAGGGCCGGCTCCGGCTACTGGAAGGCCA 600 ************************************************************ ‘Yugu1’ CCGGCACTGACAAGCCCATCCTGGCCTCCGGTCGCTGCCTCGGCGTCAAGAAGGCGCTCG 660 ICERI-4 CCGGCACTGACAAGCCCATCCTGGCCTCCGGTCGCTGCCTTGGCGTCAAGAAGGCGCTCG 660 ICERI-5 CCGGCACTGACAAGCCCATCCTGGCCTCCGGTCGCTGCCTCGGCGTCAAGAAGGCGCTCG 660 ICERI-6 CCGGCACTGACAAGCCCATCCTGGCCTCCGGTCGCTGCCTCGGCGTCAAGAAGGCGCTCG 660 ICERI-10 CCGGCACTGACAAGCCCATCCTGGCCTCCGGTCGCTGCCTCGGCGTCAAGAAGGCGCTCG 660 **************************************** *******************
Gambar 15 Hasil pensejajaran nukleotida SiNAC065 yang berasal dari genotipe hotong ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6, ICERI-10, dan SiNAC065 dari genotipe Yugu1 (nomor aksesi GenBank: XM_004971405.1) menggunakan CLUSTAL X (1.83). Basa-basa yang identik ditandai dengan tanda bintang (*), tanda panah menunjukkan basa yang tidak terkonservasi. Kotak menandai bagian ekson.
‘Yugu1’ TCTTCTACCAGGGGCGCTCCCCAAAGGGCACCAAGACCCACTGGGTCATGCACGAGTACC 720 ICERI-4 TCTTCTACCAGGGGCGCTCCCCAAAGGGCACCAAGACCCACTGGGTCATGCACGAGTACC 720 ICERI-5 TCTTCTACCAGGGGCGCTCCCCAAAGGGCACCAAGACCCACTGGGTCATGCACGAGTACC 720 ICERI-6 TCTTCTACCAGGGGCGCTCCCCAAAGGGCACCAAGACCCACTGGGTCATGCACGAGTACC 720 ICERI-10 TCTTCTACCTGGGGCGCTCCCCAAAGGGCACCAAGACCCACTGGGTCATGCACGAGTACC 720 ********* ************************************************** ‘Yugu1’ GCCTCCTCGACGCCGCACCCCCAATGAGCAGCAACTCCATGAGGCTCGACGACTGGGTCC 780 ICERI-4 GCCTCCTCGACGCCGCACCCCCAATGAGCAGCAACTCCATGAGGCTCGACGACTGGGTCC 780 ICERI-5 GCCTCCTCGATGCCGCACCCCCAATGAGCAGCAACTCCATGAGGCTCGACGACTGGGTCC 780 ICERI-6 GCCTCCTCGACGCCGCACCCCCAATGAGCAGCAACTCCATGAGGCTCGACGACTGGGTCC 780 ICERI-10 GCCTCCTCGACGCCGCACCCCCAATGAGCAGCAACTCCATGAGGCTCGACGACTGGGTCC 780 ********** ************************************************* ‘Yugu1’ TCTGCCGCGTCCGCAACAAGCAGCAGCTTCTTGTTCCCGATCATGGCTACTCATCATCAT 840 ICERI-4 TCTGCCGCGTCCGCAACAAGCAGCAGCTTCTTGTTCCCGATCATGGCTACTCATCATCAT 840 ICERI-5 TCTGCCGCGTCCGCAACAAGCAGCAGCTTCTTGTTCCCGATCATGGCTACTCATCATCAT 840 ICERI-6 TCTGCCGCGTCCGCAACAAGCAGCAGCTTCTTGTTCCCGATCATGGCTACTCATCATCAT 840 ICERI-10 TCTGCCGCGTCCGCAACAAGCAGCAGCTTCTTGTTCCCGATCATGGCTACTCATCATCAT 840 ************************************************************ ‘Yugu1’ CATCCGAGCCGACCACCCGCGCCGCCGCCGACATCGTCAGCAGCAGCAGCAGCGAGGTTG 900 ICERI-4 CATCCGAGCCGACCACCCGCGCCGCCGCCGACATCGTCAGCAGCAGCAGCAGCGAGGTTG 900 ICERI-5 CATCCGAGCCGACCACCCGCGCCGCCGCCGACATCGTCAGCAGCAGCAGCAGCGAGGTTG 900 ICERI-6 CATCCGAGCCGACCACCCGCGCCGCCGCCGACATCGTCAGCAGCAGCAGCAGCGAGGTTG 900 ICERI-10 CATCCGAGCCGACCACCCGCGCCGCCGCCGACATCGTCAGCAGCAGCAGCAGCGAGGTTG 900 ************************************************************ ‘Yugu1’ TTCTTCCCGACTCCTCCTCCGCCGCCTTCGCCGACATCCACTGGAACAGCGACGACCACC 960 ICERI-4 TTCTTCCCGACTCCTCCTCCGCCGCCTTCGCCGACATCCACTGGAACAGCGACGACCACC 960 ICERI-5 TTCTTCCCGACTCCTCCTCCGCCGCCTTCGCCGACATCCACTGGAACAGCGACGACCACC 960 ICERI-6 TTCTTCCCGACTCCTCCTCCGCCGCCTTCGCCGACATCCACTGGAACAGCGACGACCACC 960 ICERI-10 TTCTTCCCGACTCCTCCTCCGCCGCCTTCGCCGACATCCACTGGAACAGCGACGACCACC 960 ************************************************************ ‘Yugu1’ TGCTGCGCTACCTAATAGGCGGCGGCGGCAGCGGCAACCCTTCCACCGCCAGCGCGTCTG 1020 ICERI-4 TGCTGCGCTACCTAATAGGCGGCGGCGGCAGCGGCAACCCTTCCACCGCCAGCGCGTCTG 1020 ICERI-5 TGCTGCGCTACCTAATAGGCGGCGGCGGCAGCGGCAACCCTTCCACCGCCAGCGCGTCTG 1020 ICERI-6 TGCTGCGCTACCTAATAGGCGGCGGCGGCAGCGGCAACCCTTCCACCGCCAGCGCGTCTG 1020 ICERI-10 TGCTGCGCTACCTAATAGGCGGCGGCGGCAGCGGCAACCCTTCCACCGCCAGCGCGTCTG 1020 ************************************************************ ‘Yugu1’ CAGTGGCCGCGGGCCATCACGACAACTACAGCGCGCCGCCGCCCCACCCCCACGCCCTGG 1080 ICERI-4 CAGTGGCCGCGGGCCATCACGACAACTACAGCGCGCCGCCGCCCCACCCCCACGCCCTGG 1080 ICERI-5 CAGTGGCCGCGGGCCATCACGACAACTACAGCGCGCCGCCGCCCCACCCCCACGCCCTGG 1080 ICERI-6 CAGTGGCCGCGGGCCGTCACGACAACTACAGCGCGCCGCCGCCCCACCCCCACGCCCTGG 1080 ICERI-10 CAGTGGCCGCGGGCCATCACGACAACTACAGCGCGCCGCCGCCCCACCCCCACGCCCTGG 1080 *************** ******************************************** ‘Yugu1’ TCTCCGTCCTCGAGTCCATCAAGAGGAACCTGTCCTTCCAGGCCATCGACGAGCTCTACC 1140 ICERI-4 TCTCCGTCCTCGAGTCCATCAAGAGGAACCTGTCCTTCCAGGCCATCGACGAGCTCTACC 1140 ICERI-5 TCTCCGTCCTCGAGTCCATCAAGAGGAACCTGTCCTTCCAGGCCATCGACGAGCTCTACC 1140 ICERI-6 TCTCCGTCCTCGAGTCCATCAAGAGGAACCTGTCCTTCCAGGCCATCGACGAGCTCTACC 1140 ICERI-10 TCTCCGTCCTCGAGTCCATCAAGAGGAACCTGTCCTTCCAGGCCATCGACGGGCTCTACC 1140 *************************************************** ******** ‘Yugu1’ TCCTCCAGCCGCCCAGCAAGCGAGCCAACTGCATCGCCGCCGCCGGAGACGATGACGACG 1200 ICERI-4 TCCTCCAGCCGCCCAGCAAGCGAGCCAACTGCATCGCCGCCGCCGGAGACGATGACGACG 1200 ICERI-5 TCCTCCAGCCGCCCAGCAAGCGAGCCAACTGCATCGCCGCCGCCGGAGACGATGACGACG 1200 ICERI-6 TCCTCCAGCCGCCCAGCAAGCGAGCCAACTGCATCGCCGCCGCCGGAGACGATGACGACG 1200 ICERI-10 TCCTCCAGCCGCCCAGCAAGCGAGCCAACTGCATCGCCGCCGCCGGAGACGATGACGACG 1200 ************************************************************ ‘Yugu1’ ACCACATCCAACAGATATTGTCGCCCACCTCCTTCTCCATATCGGAGGCCGACGAAATGT 1260 ICERI-4 ACCACATCCAACAGATATTGTCGCCCACCTCCTTCTCCATATCGGAGGCCGACGAAATGT 1260 ICERI-5 ACCACATCCAACAGATATTGTCGCCCACCTCCTTCTCCATATCGGAGGCCGACGAAATGT 1260 ICERI-6 ACCACATCCAACAGATATTGTCGCCCACCTCCTTCTCCATATCGGAGGCCGACGAAATGT 1260 ICERI-10 ACCACATCCAACAGATATTGTCGCCCACCTCCTTCTCCATATCGGAGGCCGACGAAATGT 1260 ************************************************************ ‘Yugu1’ TCTAG 1265 ICERI-4 TCTAG 1265 ICERI-5 TCTAG 1265 ICERI-6 TCTAG 1265 ICERI-10 TCTAG 1265 *****
Gambar 15 Hasil pensejajaran nukleotida SiNAC065 yang berasal dari genotipe hotong ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6, ICERI-10, dan SiNAC065 dari genotipe Yugu1. Basa-basa yang identik ditandai dengan tanda bintang (*), tanda panah menunjukkan basa yang tidak terkonservasi. Kotak menandai bagian ekson (Lanjutan).
Sama seperti sekuen genomik SiNAC065 dari genotipe ‘Yugu1’, SiNAC065 yang diisolasi dari genotipe ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6 dan ICERI-10 memiliki satu intron dan dua ekson (Gambar 15). Basa 1-196 merupakan ekson, basa 197-486 merupakan intron, dan basa 487-1265 merupakan ekson. Sekuen SiNAC065 dari keempat genotipe hotong memiliki kesamaan yang sangat tinggi, yaitu > 99% identity.Sejumlah perbedaan basa yang teridentifikasi adalah sebagai berikut: SiNAC065-ICERI4 memiliki basa timin (T) pada basa ke-311 dan basa ke-641, sedangkan gen SiNAC065 pada ketiga genotipe lainnya memiliki basa sitosin (C); SiNAC065-ICERI5 memiliki basa adenin (A) pada basa ke-38 dan basa timin (T) pada basa ke-731, sedangkan gen SiNAC065 pada ketiga genotipe lainnya memiliki basa timin (T) dan sitosin (C); SiNAC065-ICERI6 memiliki basa timin (T) pada basa ke-44, basa guanin (G) pada basa ke-121 dan ke-234, basa sitosin (C) pada basa ke-322, dan basa guanin (G) pada basa ke-1036, sedangkan gen SiNAC065 pada ketiga genotipe lainnya memiliki basa guanin (G), adenin (A), adenin (A), timin (T) dan guanin (G) pada posisi yang sama secara berurutan; SiNAC065-ICERI10 memiliki basa adenin (A) pada basa ke-224, basa timin (T) pada basa ke-670 dan basa guanin (G) pada basa ke-1132, sedangkan gen SiNAC065 pada ketiga genotipe lainnya memiliki basa timin (T), adenin (A) dan adenin (A).
Asam amino hasil translasi fragmen gen SiNAC065 dari empat genotipe hotong (ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6, dan ICERI-10) disejajarkan. Hasil pensejajaran menunjukkan bahwa daerah terkonservasi gen SiNAC065 berada pada asam amino ke 19-325 (Gambar 16). Sejumlah motif terkonservasi pada famili gen NAC diidentifikasi berdasarkan Puranik et al. (2013). Protein SiNAC065 yang disandikan oleh gen SiNAC065 yang diisolasi dari genotipe ‘Yugu1’ (Puranik et al. 2013) memiliki 8 motif terkonservasi, hal yang sama ditemukan pada protein SiNAC065 yang disandikan oleh gen SiNAC065 dari genotipe ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6 dan ICERI-10. Fragmen basa nukleotida SiNAC065 terbaca jelas dari ujung 5’ dan ujung 3’, sehingga menyandikan asam amino yang lengkap. Tingkat kemiripan yang tinggi antara empat genotipe yang digunakan saat penelitian ini dengan penelitian Puranik et al. (2013). Berdasarkan motif terkonservasinya, SiNAC065 dari genotipe ‘Yugu1’ termasuk dalam sub- famili VII dari 11 sub-famili yang ada. Anggota sub-famili VII merupakan gen ortholog dari kelompok gen SNAC (stress responsive NACs) (Puranik et al. 2013) yang terlibat dalam respon terhadap cekaman abiotik, termasuk salinitas (Lindemose et al. 2013).
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5 15 25 35 45 55 ‘Yugu1’ MGEAEASAGG SLVFRGCQLP PGFRFQPTDQ EIIVCYLKKK IDAATAVTSI IADVDIYKFD
ICERI-4 MGEAEASAGG SLVFRGCQLP PGFRFQPTDQ EIIVCYLKKK IDAATAVTSI IADVDIYKFD ICERI-5 MGEAEASAGG SLEFRGCQLP PGFRFQPTDQ EIIVCYLKKK IDAATAVTSI IADVDIYKFD ICERI-6 MGEAEASAGG SLVFLGCQLP PGFRFQPTDQ EIIVCYLKKK VDAATAVTSI IADVDIYKFD ICERI-10 MGEAEASAGG SLVFRGCQLP PGFRFQPTDQ EIIVCYLKKK IDAATAVTSI IADVDIYKFD CONSENSUS ********** ** * ***** ********** ********** :********* ********** MOTIF 2 MOTIF 8 MOTIF 4 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
65 75 85 95 105 115 ‘Yugu1’ PWDLPDKAAM FGDGEWFFFS PRDRKYPNGA RPNRRAGSGY WKATGTDKPI LASGRCLGVK
ICERI-4 PWDLPDKAAM FGDGEWFFFS PRDRKYPNGA RPNRRAGSGY WKATGTDKPI LASGRCLGVK ICERI-5 PWDLPDKAAM FGDGEWFFFS PRDRKYPNGA RPNRRAGSGY WKATGTDKPI LASGRCLGVK ICERI-6 PWDLPDKAAM FGDGEWFFFS PRDRKYPNGA RPNRRAGSGY WKATGTDKPI LASGRCLGVK ICERI-10 PWDLPDKAAM FGDGEWFFFS PRDRKYPNGA RPNRRAGSGY WKATGTDKPI LASGRCLGVK CONSENSUS ********** ********** ********** ********** ********** **********
MOTIF 1 MOTIF 7
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
125 135 145 155 165 175 ‘Yugu1’ KALVFYQGRS PKGTKTHWVM HEYRLLDAAP PMSSNSMRLD DWVLCRVRNK QQLLVPDHGY
ICERI-4 KALVFYQGRS PKGTKTHWVM HEYRLLDAAP PMSSNSMRLD DWVLCRVRNK QQLLVPDHGY ICERI-5 KALVFYQGRS PKGTKTHWVM HEYRLLDAAP PMSSNSMRLD DWVLCRVRNK QQLLVPDHGY ICERI-6 KALVFYQGRS PKGTKTHWVM HEYRLLDAAP PMSSNSMRLD DWVLCRVRNK QQLLVPDHGY ICERI-10 KALVFYLGRS PKGTKTHWVM HEYRLLDAAP PMSSNSMRLD DWVLCRVRNK QQLLVPDHGY CONSENSUS ****** *** ********** ********** ********** ********** **********
MOTIF 5 MOTIF 3 MOTIF 6
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
185 195 205 215 225 235 ‘Yugu1’ SSSSSEPTTR AAADIVSSSS SEVVLPDSSS AAFADIHWNS DDHLLRYLIG GGGSGNPSTA
ICERI-4 SSSSSEPTTR AAADIVSSSS SEVVLPDSSS AAFADIHWNS DDHLLRYLIG GGGSGNPSTA ICERI-5 SSSSSEPTTR AAADIVSSSS SEVVLPDSSS AAFADIHWNS DDHLLRYLIG GGGSGNPSTA ICERI-6 SSSSSEPTTR AAADIVSSSS SEVVLPDSSS AAFADIHWNS DDHLLRYLIG GGGSGNPSTA ICERI-10 SSSSSEPTTR AAADIVSSSS SEVVLPDSSS AAFADIHWNS DDHLLRYLIG GGGSGNPSTA CONSENSUS ********** ********** ********** ********** ********** **********
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
245 255 265 275 285 295 ‘Yugu1’ SASAVAAGHH DNYSAPPPHP HALVSVLESI KRNLSFQAID ELYLLQPPSK RANCIAAAGD
ICERI-4 SASAVAAGHH DNYSAPPPHP HALVSVLESI KRNLSFQAID ELYLLQPPSK RANCIAAAGD ICERI-5 SASAVAAGHH DNYSAPPPHP HALVSVLESI KRNLSFQAID ELYLLQPPSK RANCIAAAGD ICERI-6 SASAVAAGRH DNYSAPPPHP HALVSVLESI KRNLSFQAID ELYLLQPPSK RANCIAAAGD ICERI-10 SASAVAAGHH DNYSAPPPHP HALVSVLESI KRNLSFQAID GLYLLQPPSK RANCIAAAGD CONSENSUS ********:* ********** ********** ********** ********* **********
....|....| ....|....| .... 305 315 ‘Yugu1’ DDDDHIQQIL SPTSFSISEA DEMF ICERI-4 DDDDHIQQIL SPTSFSISEA DEMF ICERI-5 DDDDHIQQIL SPTSFSISEA DEMF ICERI-6 DDDDHIQQIL SPTSFSISEA DEMF ICERI-10 DDDDHIQQIL SPTSFSISEA DEMF CONSENSUS ********** ********** ****