BAB III. METODE PENELITIAN
D. Jalannya Penelitian
Determinasi tanaman Macaranga tanarius L. bunga, daun, batang yang dilakukan secara benar sesuai dengan buku acuan (Backer dan Van Den Brink, 1963).Determinasi dilakukan oleh Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si.dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Pembuatan simplisia uji
a. Pengumpulan bahan. Daun M. tanarius diperoleh dari kebun obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang di panen pada bulan April 2011. Daun yang diambil adalah daun segar yang berwarna hijau dan tidak berlubang.
b. Pembuatan simplisia. Pembuatan simplisia daun M. tanarius yang telah dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir, kemudian ditiriskan dengan sinar matahari, untuk meniadakan air pada daun. Selanjutnya daun dikeringkan kembali menggunakan oven pada suhu 40-500C selama 24 jam dan diserbuk. Kemudian serbuk simplisia diayak menggunakan ayakan nomor 50.
c. Pembuatan ekstrak metanol-air daun M. tanarius.Seberat 10,0 gram serbuk kering daun M. tanarius dilarutkan dengan 100,0 ml metanol 50 % pada erlenmeyer bersumbat. Kemudian diekstraksi secara maserasi selama 72 jam dengan kecepatan 140 rpm pada suhu kamar. EMMT yang didapat kemudian dievaporasi hingga kering dan menghasilkan EMMT pekat.
3. Preparasi bahan
a. Pembuatan larutan CMC 1% b/v. CMC ditimbang sebanyak 0,25 gram dan dilarutkan dengan aquadest dalam labu takar 25 ml sampai tanda.
b. Pembuatan larutan stok glukosa p.a. 15% b/v. Glukosa monohidrat p.a. ditimbang sebanyak 15,0 gram dan dilarutkan dengan aquades dalam labu takar 100 ml sampai tanda.
c. Penentuan keseragaman bobot kaplet glibenklamida. Penentuan keseragaman bobot kaplet glibenklamida mengacu pada Depkes 1979. Timbang 20 tablet, hitung bobot tablet. Jika ditimbang satu-satu, tidak boleh lebih dari 2
tablet yang masing-masing bobotnya menyimpang dari bobot rata-ratanya lebih besar dari harga yang ditetapkan kolom A, dan tidak satu tabletpun menyimpang dari bobot rataratanya lebih dari harga yang ditetapkan kolom B. Nilai penyimpangan bobot rata-rata kolom A dan B dapat dilihat pada tabel III.
Tabel III. Keseragaman bobot tablet
Bobot rata-rata Penyimpangan bobot rata-rata dalam %
A B
25 mg atau kurang 15 % 30 % 26 mg sampai dengan 150 mg 10 % 20 % 151 mg sampai dengan 300 mg 7,5 % 15 % lebih dari 300 mg 5 % 10 %
d. Penentuan dosis glibenklamida. Dosis glibenklamida yaitu 5 mg pada manusia dengan berat badan 70,0 kg, dikonversikan ke tikus 200,0 gram dengan faktor konversi 0,018. 5 mg glibenklamida x 0,018 = 0,09 mg glibenklamida/200 gram = 0,45 mg glibenklamida/ kg BB. Berdasarkan perhitungan maka besarnya dosis glibenklamida pada hewan uji tikus yaitu 0,45 mg/ kg BB.
e. Pembuatan larutan glibenklamida 0,1125 mg/ml. Timbang serbuk glibenklamida setara dengan 25,0 mg glibenklamida murni, larutkan dengan CMC 1% dalam labu takar 10,0 ml sampai tanda sebagai larutan induk glibenklamida. Buat dengan konsentrasi 0,1125 mg/ml dalam labu ukur 10 ml dari larutan induk glibenklamida tersebut.
f. Validasi dan realiabilitas instrument penelitian.Hasil pengukuran yang baik dari suatu parameter kuantitas kimia, dapat dilihatberdasarkan tingkat presisi dan akurasi yang dihasilkan. Akurasi menunjukkan kedekatan nilaihasil pengukuran dengan nilai sebenarnya. Presisi menunjukkan tingkat reliabilitas dari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
data yang diperoleh, hal inidapat dilihat dari standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran( Tahir, 2008).
Menurut Direktorat Bina Pelayanan Penunjang Medik Departemen Kesehatan Republik Indonesia (2008), alat dikatakan memiliki presisi yang baik apabila coefisien variasi (CV) ≤ 5% CV yang diperoleh hasil uji presisi Micro
vitalab adalah 2,07 % sehingga dapat dikatakan instrument penelitian memiliki
presisi yang baik. Dapat dilihat dari hasil pengukuran kadar secara berulang menunjukkan kedekatan nilaihasil pengukuran dengan nilai sebenarnya. Hal ini menunjukkan bahwa alat memenuhi akurasi yang baik.
4. Percobaan pendahuluan
a. Penetapan waktu pemberian glibenklamida. Tujuan dari penetapan pemberian glibenklamida adalah untuk melihat pengaruh waktu pemberian terhadap efek hipoglikemik glibenklamida, agar pada saat uji toleransi glikosa oral (UTGO) glibenklamida sudah memberikan efek penurunan kadar glukosa darah. Orientasi ini menggunakan 9 ekor tikus yang terbagi dalam 3 kelompok dimana masing-masing kelompok diberi perlakuan pada menit ke-15 sebelum UTGO untuk kelompok I, menit 30 sebelum UTGO untuk kelompok II, dan menit ke-45 sebelum UTGO untuk kelompok III. Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 1,75 g/kg BB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 180, dan 240. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP dan dilakukan perhitungan harga LDKK0-240.
b. Penetapan waktu pemberian EMMT. Tujuannya untuk melihat pengaruh waktu pemberian terhadap efek penurunan kadar glukosa darah, agar pada saat dilakukan UTGO EMMT sudah memberikan efek dalam menurunkan kadar glukosa darah. Orientasi ini menggunakan 5 ekor tikus yang masing-masing diberi ekstrak daun M. tanarius pada menit ke-0, dan 15 sebelum UTGO. Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15% b/v; 1,75 g/kg BB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 180, dan 240. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya dibuat perhitungan harga LDKK0-240. Penentuan waktu pemberian EMMT didasarkan pada harga LDKK0-240 terendah.
c. Pengelompokan hewan uji.Hewan percobaan yang digunakan sebanyak 30 ekor tikus yang dibagi secara acak dalam 5 kelompok sama banyak. Kelompok I (kontrol positif) diberi glibenklamida 0,45 mg/kg BB. Kelompok II (kontrol negatif) diberi CMC 1 % 5 ml/ kg BB. Kelompok III-V (perlakuan) diberi EMMT sebesar 0,43; 1,28; dan 3,84 g/kg BB secara per oral
5. Penetapan kadar glukosa darah
Kadar glukosa darah ditetapkan dengan metode GOD-PAP. Pada tiap kelompok dilakukan pengambilan cuplikan darah sebanyak 0,5 ml melalui vena
lateralis ekor dan ditampung dalam eppendrof sesaat sebelum perlakuan sebagai
menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 180, dan 240. Setelah UTGO kemudian darah dipusingkan 3000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya diambil 0,01 ml, kemudian dilakukan pengukuran seperti dalam tabel berikut:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel IV. Volume pengukuran kadar glukosa darah
Bahan Sampel (ml) Standar (ml) Blanko (ml) Supernatant 0,01 - - Larutan baku glukosa - 0,01 - Pereaksi GOD-PAP 1,0 1,0 1,0
Alat yang digunakan untuk menganalisis kadar glukosa serum adalah
micro vitalab. Kadar glukosa dinyatakan dalam mg/dL. Pengukuran kadar glukosa
serum dilakukan di laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.
Setelah kadar glukosa serum didapatkan, dibuat kurva dengan mem-plot-kan nilai kadar glukosa darah lawan waktu ke-0 sampai menit ke-240 dengan metode trapezoid (LDDK0-240) dan rumus yang digunakan adalah sebagai berikut:
LDDKt0−tn =t1−t0 2 x C0+ C1 +t2−t1 2 x C1+ C2 + tn−tn −1 2 x Cn−1 + Cn Keterangan: t = waktu (jam/menit)
C = konsentrasi zat dalam darah (mg/ml)
LDDKto-tn = luas daerah di bawah kurva dari waktu ke-0 sampai ke-n
