D. Prosedur Pengamatan dan Analisis
3. Kadar hormon testosteron tikus jantan dan estrogen tikus
a. Kadar hormon testosteron tikus jantan (Cusabio 2012a)
Pengujian hormon testosteron dilakukan di akhir intervensi. Hormon testosteron dideteksi pada serum darah tikus di mana darah diperoleh dari bagian jantung. Serum darah diperoleh dengan cara memisahkan bagian cairan dari sel darah dengan teknik sentrifugasi pada kecepatan 1000 x g selama 15 menit.
Serum yang telah didapat ataupun standar kemudian dimasukkan ke dalam
tabung reaksi mikro sebanyak 50 L. Selanjutnya ditambahkan HRP-conjugated
testosteron sebanyak 50 L dan antibodi monoklonal anti testosteron sebanyak itu
pula lalu dilakukan inkubasi pada 370C selam 1 jam. Kemudian dilakukan
pencucian dengan buffer sebanyak 200μL dengan cara mendiamkan campuran
selama 10 detik lalu menggoyang perlahan hingga tercampur (diulangi 3 kali).
Selanjutnya dilakukan pemberian substrat sebanyak 50 L ke dalam test tube
berisi sampel serum dan diinkubasi selama 370C selama 15menit. Kemudian akan
terjadi perubahan warna yang menunjukkan interaksi antara enzim dengan substrat yang membentuk produk. Konsentrasi hormon dideteksi menggunakan alat ELISA Reader. Sebelum dideteksi dengan ELISA Reader, sampel diberi
larutan stop solutionsebanyak 50 L untuk menghentikan reaksi (Gambar 13).
b. Stadium siklus estrus tikus betina (Purnamasari et al. 2012)
Pengamatan siklus estrus tikus betina dilakukan sebagai tahap persiapan analisis kadar hormon estrogen yaitu untuk menentukan waktu terminasi tikus
betina yang tepat. Pada pengamatan status reproduksi tikus betina, dilakukan pembuatan preparat apusan vagina dengan cara menggoreskan kapas yang mengandung NaCl 0,95% pada lubang vagina dan meletakkan goresan tersebut pada gelas objek kemudian direndam dalam larutan etanol 70% selama 10 menit. Setelah itu, preparat dibilas dengan air dan ditunggu hingga kering. Selanjutnya preparat diwarnai dengan metilen biru 0,1% dan dibiarkan mengering. Preparat apusan vagina diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x. Stadium siklus estrus tikus betina dibagi menjadi empat fase yaitu proestrus, estrus, metestrus dan diestrus (Gambar 12).
(a) (b)
(c) (d)
Gambar 12 Sel epitel vagina tikus betina F0 pada: Fase proestrus (a), fase estrus (b), fase metestrus (s), fase diestrus (d), di bawah mikroskop
perbesaran 400x Sel epitel
berinti
Sel epitel mengalami penandukan
Sel leukosit
Gambar 13 Prinsip pengujian hormon menggunakan perangkat ELISA
c. Kadar hormon estrogen tikus betina (Cusabio 2012b)
Analisis hormon menggunakan kit ELISA produksi Cusabio Biotech Co. Prinsip dari pengujian ini adalah mekanisme penghambatan kompetitf di mana estrogen dari sampel akan berkompetisi dengan estrogen dari kit yang telah dilabel enzim. Terjadinya reaksi antara substrat dengan enzim membentuk produk yang ditandai dengan perubahan warna. Perubahan warna yang terjadi kemudian diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader. Nilai absorbansi berbanding terbalik dengan kadar hormon di dalam sampel (Gambar 13).
Pengujian hormon estrogen dilakukan di akhir intervensi. Hormon estrogen dideteksi pada serum darah tikus. Darah tikus diperoleh dari bagian jantung karena volume darah yang dibutuhkan cukup banyak. Serum darah diperoleh dengan cara memisahkan bagian cairan dari sel darah dengan teknik sentrifugasi pada kecepatan 1000 x g selama 15 menit.
Setelah preparasi sampel selesai, sampel serum atau standar ditempatkan ke
dalam tabung reaksi mikro sebanyak 50μL. Kemudian tambahkan HRP-conjugate
estrogen sebanyak 50μL ke dalam sampel lalu tambahkan pula Antibodi anti
estrogen sebanyak 50μL, kemudian inkubasi selama 2 jam pada suhu 370C.
1 . 2 3 4 Stop solution 5 Diukur pada λ=450nm
Prinsip pengujian hormon: ELISA Kompetitif tak langsung Keterangan:
= antibodi primer yang sudah
ada di dalam plate
= antibodi sekunder (antiobodi spesifik: anti estrogen/testosteron) = enzim HRP-conjugated estrogen/testosteron = estrogen/testosteron dari sampel = substrat
= produk yang terbentuk
= produk setelah diberi stop
solution
Nilai absorbansi sampel/standar berbanding terbalik dengan kadar hormon
Setelah inkubasi, dilakukan pencucian dengan wash buffer sebanyak 250μL
(diulangi 3 kali). Setelah itu dilakukan penambahan substrat sebanyak 50 L
kemudian ditutup dengan adhesive strip yg baru dan diinkubasi kembali selama
15menit pada suhu 370C. Tahap terakhir adalah penambahan stop solution
sebanyak 50 L. Reaksi yang akan terjadi di dalam tabung reaksi mikro berupa
perubahan warna. Nilai absorbansi sampel dideteksi menggunakan alat ELISA Reader.
E. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan pada pengamatan konsumsi ransum, berat organ, jumlah anak, motilitas sperma, konsentrasi sperma dan kadar hormon adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dikarenakan kondisi unit percobaan yang homogen. Percobaan ini terdiri atas tujuh kelompok yaitu Kontrol, TP1, TP2, TP3, IS1, IS2 dan IS3 dengan lima ulangan. Pada pengujian kadar hormon testosteron dan estrogen, data yang diperoleh hanya dua ulangan untuk tiap kelompok karena keterbatasan perangkat uji. Berikut adalah model linier dari rancangan percobaan ini:
Yij= + τi+ εij , di mana: i = 1, β, ... ,7 dan j = 1, β, … ,5
Yij = Pengamatan pada perlakuan ke-i dan kelompok ke-j = Rataan umum
τi = Pengaruh perlakuan ke-i, μ;-μ
εij= Pengaruh acak pada perlakuan ke-i ulangan ke-j
Hasil yang didapat kemudian diolah dengan Analysis of Variance (ANOVA)
dengan selang kepercayaan 95% (α = 0,05). Bila terdapat pengaruh nyata maka
akan dilakukan uji lanjutan menggunakan metode uji Duncan dengan selang
kepercayaan λ5% (α = 0,05). Data hasil penelitian untuk semua parameter juga
akan diolah dengan uji T antara kelompok kontrol dengan TP (gabungan TP1- TP3), kontrol dengan IS (gabungan IS1-IS3) serta kelompok TP dan IS. Data hasil analisis diolah menggunakan program SPSS 17.
Selanjutnya pada pengamatan perkembangan berat badan, data yang diperoleh akan diolah menggunakan metode analisis regresi linier sederhana. Regresi linier sederhana adalah persamaan regresi yang menggambarkan
hubungan antara satu variabel bebas dan satu variable terikat (Mattjik & Sumertajaya 2006). Hubungan kedua variable tersebut dituangkan ke dalam persamaan berikut:
Yi = α + βXi
Kemudian, dugaan dari persamaan tersebut yaitu: Ŷi= a + bXi , di mana Y = berat
badan (gram); X = lama perlakuan (hari); a = intersep dan b = gradient. Selain
itu, dilakukan pula analisis hubungan antara konsumsi protein kedelai terhadap semua parameter dan hubungan antara konsumsi isoflavon kedelai terhadap parameter profil reproduksi menggunakan analisis Korelasi Pearson pada selang