Gambar 5.16 Hasil uji aktivitas amylase dengan metode DNS dari P. pastoris [ALPI
78/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dengan pembanding P. pastoris [ALPI-78] dan P. pastoris [ALPI-68]
Aktivitas tinggi seiiring dengan tingginya densitas sel selama masa induksi (Gambar 5.15). Pengukuran pada panjang gelombang 600 nm (OD600) menunjukkan bahwa densitas sel P. pastoris [ALP1-SEC4] ketika dipanen dari media BMGY berada pada kisaran nilai 10-23. Nilai OD600 10 merupakan nilai densitas optik yang sangat tinggi bagi sejumlah mikroorganisme, namun hal ini tidak berlaku bagi P. pastoris. P. pastoris mampu untuk hidup pada densitas sel yang lebih tinggi lagi (Inan & Meagher, 2001).
Hasil ko-ekspresi protein Sec4 terhadap ekspresi α-amilase S. fibuligera oleh P. pastoris sesuai dengan hasil yang diperoleh penelitian-penelitian lain yang juga meneliti pengaruh ko-ekspresi protein Sec4 terhadap ekspresi protein rekombinan. Penelitian yang dilakukan Shi-Hwei dan koleganya (2004) menunjukkan bahwa overekspresi protein Sec4 dapat menghasilkan peningkatan produksi protein glukoamilase pada Rhizopus Oryzae. Dalam studi yang dilakukan oleh Shi-Hwei dan koleganya ini, dilaporkan peningkatan produksi glukoamilase hingga dua kali lipat dengan melakukan manipulasi genetik yang melibatkan overekspresi SEC4.
5.9 Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan metoda Lawry. Larutan standar protein BSA (Bovine Serum Albumin) dibuat dalam bufer fosfat 20 mM dengan konsentrasi (25, 50, 75,
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 0 24 48 72 96 120 144 A kt iv it as ( U /m l ) Waktu ( Jam) [ALPI-68/SEC4] [ALPI-68]
52 100, 125, 150, 200, dan 300) μg/mL. Metoda Lowry dapat mengukur kandungan protein sampel yang rendah. Uji Lowry menggunakan reaksi Biuret dimana Cu2+ (dalam suasana basa) yang terdapat pada pereaksi C bereaksi dengan ikatan peptida pada protein menghasilkan warna biru. Vorteks dilakukan agar larutan tercampur sempurna sehingga larutan yang ada didalamnya dapat bereaksi dengan baik. Kemudian ditambah dengan pereaksi D (larutan fosfomolibdat-fosfowolframat) dikocok dan didiamkan selama 30 menit. Larutan fosfomolibdat-fosfowolframat yang merupakan kompleks campuran garam anorganik ini (pereaksi D) akan bereaksi dengan residu tirosin dan triptopan pada protein menghasilkan warna biru-hijau. Karena kandungan kedua macam asam amino tersebut bervariasi pada berbagai macam protein, maka intensitas warna yang ditimbulkan per miligram proteinpun berbeda (Sudarmadji, 1984). Kemudian diukur serapannya pada λ750 nm karena panjang gelombang tersebut adalah panjang gelombang maksimum untuk BSA sebagai larutan standar protein. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar protein terbesar diperoleh pada jam ke-72 dimana kadar protein [ALP1-78/SEC4] sebesar 13,63 mg/mL dan kadar protein [ALP1-78] sebesar 12,72 mg/mL sedangkan kadar protein [ALP1-68/SEC4] sebesar 14,54 mg/mL dan kadar protein [ALP1-68] sebesar 13,63 mg/mL . Adanya ko-ekspresi protein Sec4 berpengaruh terhadap besarnya kadar protein.
Tabel 5.1 bberikut ini memperlihatkan perbandingan hasil ekspresi α-amilase S. fibuligera R64 pada P. pastoris [ALPI-68] dan P. pastoris [ALPI-78 ] dengan ko-ekspresi protein Sec4 atau tanpa ko-ekspresi. Hasil yang diperbandingkan meliputi OD600 pada saat induksi, aktivitas, kadar protein dan aktivitas spesifik.
Tabel 5.1 Pengaruh ko-ekspresi protein Sec4 terhadap level ekspresi -amilase oleh P. pastoris [ALPI-78/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-68/SEC4]
P ichi a pas tor is Wak tu I n d u k si Op tim u m ( Jam ) T in gk at P er tu m b u h an S el ( OD 600 ) Kad ar P rot ein (m g/m L ) Akt ivi tas (U/m L ) Akt ivi tas S p es if ik ( U/ m g) [ALP1-68] 72 20,55 13,63 321,36 23,57 [ALP1-68/SEC4] 72 22,95 14,54 485,47 33,38 [ALP1-78] 72 19,38 12,72 315,46 24,80 [ALP1-78/SEC4] 72 24,15 13,63 503,18 36,91
53 Level sekresi merupakan jumlah atau banyaknya α-amilase yang disekresikan keluar sel. Untuk mengetahui peningkatan level sekresi, maka seharusnya ditentukan aktifitas dan kadar protein secara intraselular dan ekstraselular. Dalam peneltian ini hanya dilakukan pengukuran aktivitas enzim α-amilase dan kadar protein secara ekstraselular (pada supernatan). Shi wei et al., pada tahun 2004 juga melakukan hal yang sama.
Pada Tabel 5.1 terdapat aktivitas spesifik. Aktivitas spesifik adalah banyaknya aktivitas enzim dalam setiap miligram protein. Aktivitas spesifik merupakan salah satu parameter yang menunjukkan kualitas enzim.
Perhitungan aktivitas spesifik:
Aktivitas spesifik (U/mg) = Aktivitas (U/mL) Kadar Protein (mg/mL)
Berdasarkan data yang diperoleh, aktivitas spesifik yang diperoleh tidak terlalu besar, hal ini berarti kualitas enzim α-amilase yang disekresikan tidak terlalu bagus. Hal ini didukung juga kadar protein yang dihasilkan cukup besar. Aktifitas spesifik P. pastoris [ALPI-68/SEC4] pada penelitian ini sebesar 485,47 U/mL, sedangkan kadar protein yang diekspresikan sebesar 14,54 mg/mL dan aktifitas spesifik P. pastoris [ALPI-78/SEC4] sebesar 503,18 U/mL, sedangkan kadar protein diekspresikan sebesar 13,63 mg/mL. Menurut teori, P. pastoris merupakan ragi yang mampu memproduksi protein heterolog dengan tingkat ekspresi yang tinggi (Cereghino & Cregg, 2000) dan mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri (Glick & Pasternak, 2003). Namun, pada peneltian ini kadar protein yang dihasilkan cukup besar. Hal ini berarti terdapat protein lain yang disekresikan oleh P. pastoris selain α-amilase yang menyebapkan kadar protein lebih besar.
Dengan adanya ko-ekspresi protein Sec4 dalam P. pastoris maka akan meningkatkan jumlah SEC4 secara intraselular. Sec4p berperan sebagai transport vesikel untuk menargetkan vesikel sekresi ke membran plasma pada proses pasca-Golgi dalam sekresi protein pada ragi dan selanjutnya protein akan disekresikan ke luar sel. Peningkatan level Sec4p dalam suatu inang ekspresi, akan meningkatkan jumlah protein asing yang disekresikan.
54 BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan : 1. Gen SEC4 Pichia pastoris berhasil diamplifikasi dengan metode PCR dari genom
P. pastoris dan disubkloning dengan vektor pJET1.2 dalam Escherichia coli. 2. Hasil penentuan urutan nukleotida menunjukkan bahwa urutan nukleotida gen
SEC4 hasil subkloning memiliki homologi 100% dengan urutan nukleotida gen SEC4 nomor aksesi XM_002492307.1 (NCBI).
3. Gen SEC4 P. pastoris telah berhasil dikonstruksi dalam vektor ekspresi untuk P. pastoris (pPIC3.5K-SEC4) dan dikloning dalam E. coli.
4. Transforman P. pastoris [ALP1-SEC4] telah berhasil diperoleh
5. Hasil analisis aktivitas a-amilase menunjukkan ko-ekspresi Sec4p meningkatkan level sekresi a-amilase 2x lipat dibanding tanpa ko-ekspresi.
7. 2 Saran
1. Perlu dilakukan penentuan aktivitas -amilase intraselular untuk mengetahui level
-amilase intraselular.
2. Perlu dilakukan karakterisasi Sec4p intraselular P. pastoris untuk mengetahui peningkatan konsentrasi Sec4p dalam P. pastoris.
55 DAFTAR PUSTAKA
Brennwald, P. 2000. Reversal of Fortune: Do Rab GTPases Act on the Target Membrane? The Journal of Cell Biology. 149(1):1–3.
Campbell, N. A., Reece, J. B., & Mitchell, L. G. 2002. Biologi, Edisi Kelima, Jilid I. Erlangga. Jakarta.
Chavrier, P., Vingron, M., Sander, C., Simons, K. & Zerial, M. 1990. Molecular Cloning of YPT1/SEC4-Related cDNAs from an Epithelial Cell Line. Molecular And Cellular Biology. 10(12): 6578-6585
Cregg, J. M. & Madden, K. R. 1988. Development of the metylotrophic yeast Pichia pastoris, as a host system for the production of foreign protein. Dev. Ind. Microbiol. 29:33-41.
Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y., & Madden, K. R. 1985. Pichia pastoris as a host system for tansformation. Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385
Fermentas, 2010. Molecular Biology Catalog and Product Application Guide. Canada. Gaffar, S. 2011. Pengaruh Kombinasi Manipulasi Genetik terhadap Tingkat Sekresi
α-amilase S. fibuligera R64 dalam Pichia pastoris. Disertasi Program Pasca Sarjana Universitas padjadjaran. Bandung.
Gaffar, S. 2010a. Bioteknologi Molekul, Aplikasi dan Teori. Widya Padjadjaran. Bandung.
Gaffar, S. 2010b. Produksi Protein Rekombinan dalam Sistem Ekspresi Pichia pastoris. UNPAD PRESS.
Glick, B. R., & Pasternak , J. J. 2003. Molecular biotechnology, principles and applications of recombinant DNA. ASM press. Washington DC.
Grosshans, B. L., Andreeva, A., Gangar, A., Niessen, S., Yates, J. R., Brennwald, P., & Novick, P. J. 2006a. The yeast lgl family member Sro7p is an effector of the secretory Rab GTPase Sec4p. The Journal of Cell Biology. 172(1):55–66.
Grosshans, B. L., Ortiz, D. & Novick, P. J. 2006b. Rabs and their effectors: Achieving specificity in membrane traffic. PNAS. 103(32):11821–11827.
Grote, E., Carr, C. M. & Novick, P. J. 2000. Ordering the Final Events in Yeast Exocytosis. The Journal of Cell Biology. 151(2):439–451.
Grote, E. & Novick, P. J. 1999. Promiscuity in Rab–SNARE Interactions. Molecular Biology of the Cell. 10:4149–4161.
Guo, W., Roth, D., Walch-Solimena, C. & Novick, P. J. 1999. The exocyst is an effector for Sec4p, targeting secretory vesicles to sites of exocytosis. The EMBO Journal. 18(4):1071–1080.
Invitrogen. 2004. A manual of methods for expresion of recombinant proteins in Pichia Pastoris. California.
Koolman, J., & Roehm, K. H. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Second Edition. Thieme Stuttgart. New York.
Lipschutz, J. H. & Mostov, K. E. 2002. Exocytosis: The Many Masters of the Exocyst. Current Biology. 12:R212–R214.
Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky, S. L. & Darnell, J. 2003. Molecular Cell Biology. Fifth edition. W.H.Freeman & Co Ltd.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Brock, T. D. 2006. Brock Biology of Microorganisms. 11th Ed. Pearson Prentice Hall. New Jersey.
Oliveira, D.L., Nakayasu, E. S., Joffe, L. S., Guimara˜es, A. J., & Sobreira, T. J. P. 2010. Characterization of Yeast Extracellular Vesicles: Evidence for the Participation of
56 Different Pathways of Cellular Traffic in Vesicle Biogenesis. PLoS ONE 5(6): e11113.
Orlando, K. & Guo, W. 2009. Membrane Organization and Dynamics in Cell Polarity. Biol. 1:a001321.
Romanos, M. A. 1995. Advances in the use of Pichia pastoris for high-level gene expression. Curr. Opin. Biotechnol. 6:527-533
Rothman, J. E. 1996. The protein machinery of vesicle budding and fusion. Protein Science. 5:185-194.
Salminen, A. & Novick, P. J. 1989. The Sec15 Protein Responds to the Function of the GTP Binding Protein, Sec4, to Control Vesicular Traffic in Yeast. The Journal of Cell Biology. 109:1023-1036.
Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., & Chang, M. D. 2004. Improved secretory production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic manipulations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 326:817–824
Takai, Y., Sasaki, T., & Matozaki, T. 2001. Small GTP-Binding Proteins. Physiological Reviews. 81:1.
Thomas, G. H. 2009. Intracellular Compartments-Exocytosis, Endocytosis, and the Lysosome. https://wikispaces.psu.edu/display/230/Intracellular+Compartments-Exocytosis,+Endocytosis, and+the+Lysosome#Intracellular
Compartments-Exocytosis%2CEndocytosis%2CandtheLysosome-Exocytosis Walworth, N. C., Goud, B., Alisa, K. K. & Novick, P. J. 1989. Mutational analysis of
SEC4 suggests a cyclical mechanism for the regulation of vesicular traffic. The EMBO Journal. 8(6)1685 – 1693.
57 LAMPIRAN 1