4.2. Metodologi Penelitian
4.2.10 Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan ekstraselular
Sec4p intraselular P. pastoris dan -amilase hasil ekspresi intra dan ekstraseluler P. pastoris akan dikarakterisasi dengan metoda SDS-PAGE (Sambrook et al., 1989). menggunakan gel dengan komposisi 10% separating gel dan 4% stacking gel.
Persiapan supernatan: 50 μL supernatan dicampur dengan sampel bufer (Tris-Cl
50 mM, pH 6,8, gliserol 1% (v/v), β-merkapoetanol 100 mM, SDS 2% (b/v), bromofenol biru 0,1% b/v) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan.
Persiapan pelet sel: Pelet sel diresuspensi dalam 300 μL aquadest, dan
ditambahkan 100 μL TCA 50%, diaduk segera. Sampel dibekukan pada suhu -80C selama 30 menit. Sel disentrifugasi pada suhu ruang dengan kecepatan 14.000 g selama 5 menit. Pelet sel dicuci dua kali dengan 500 μL aseton 80% dingin, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada 14.000 g selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan dibuang dengan hati-hati, dan pelet dibiarkan mengering. Pelet dilarutkan dalam 100 μL SDS 1% dalam natrium hidroksida 0,1N. Kemudian ditambahkan sampel buffer (Tris-Cl 50 mM pH 6,8, gliserol 1% v/v, β-merkaptoetanol 100 mM, SDS 2% b/v, bromofenol biru 0,1% b/v) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan. Kemudian dikarakterisasi dengan SDS-PAGE.
36 4.3 Bagan Alir Penelitian
38 BAB V. HASIL YANG DICAPAI
5.1 Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli.
Amplifikasi gen SEC4 dengan teknik PCR menggunakan pasangan primer 5’Sec4f dan 3’Sec4r menghasilkan fragmen berukuran 615 pb (Gambar 1a) sesuai dengan panjang gen SEC4 P. pastoris di GenBank (nomor akses: XM_002492307.1). Selanjutnya gen SEC4 telah berhasil disubkloning menggunakan vektor pJet1.2 dalam E. coli (Gambar 1b). Sebanyak 104 koloni transforman E. coli telah diperoleh dan diremajakan untuk pencarian koloni yang mengandung plasmid rekombinan.
a. b.
Gambar 5.1. (a) Produk PCR gen SEC4. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) SEC4. (b) Koloni transforman E. coli [pJET1.2-SEC4].
Hasil isolasi plasmid dan karakterisasi dengan enzim EcoR1 diperoleh koloni yang positif mengandung gen SEC4 (Gambar 2). Hasil restriksi plasmid yang ditunjukkan pada Gambar 2 menunjukkan bahwa koloni 92 (lajur 6) positif mengandung plasmid pJET-SEC4, ditunjukkan dengan adanya pita pada daerah ~3000 bp yang sesuai dengan ukuran plasmid pJET1.2 dan pita pada daerah ~615 bp yang sesuai dengan ukuran gen SEC4. Koloni 64 dan 68 (lajur 3 dan 4) diduga mengandung vektor pJET1.2 yang mengalami re-ligasi, ditunjukkan dengan pita plasmid yang tidak terpotong oleh enzim EcoRI karena vektor pJET1.2 tidak memiliki sisi pengenal EcoRI. Namun, seharusnya koloni ini tidak tumbuh pada media seleksi karena vektor pJET1.2 yang tidak disisipi DNA sisipan akan mengekspresikan protein yang mematikan bagi transforman E. coli. Diduga hal ini terjadi karena adanya kontaminasi nuklease. Kontaminasi ini dapat
39 merusak integritas dari gen mematikan dengan rusaknya ujung vektor pJET1.2 oleh aktivitas nuklease. Hasil restriksi koloni 21 dan 50 (lajur 2 dan 5) menghasilkan plasmid yang terpotong oleh enzim EcoRI, namun tidak menunjukkan pita spesifik pET1.2 maupun SEC4. Diduga hal ini terjadi karena proses restriksi yang kurang sempurna sehingga menghasilkan plasmid pJET-SEC4 linear, ditunjukkan dengan pita yang terletak diantara daerah ~3500 pb.
Gambar 5.2. Hasil restriksi plasmid pJET1.2-SEC4 dengan enzim EcoRI. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) pJET-SEC4 koloni 21 cut/ EcoRI, (lajur 3) pJET-SEC4 koloni 64 cut/
EcoRI, (lajur 4) pJET-SEC4 koloni 68 cut/EcoRI, (lajur 5) pJET-SEC4 koloni 50 cut/ EcoRI, (lajur 6) pJET-SEC4 koloni 92 cut/EcoRI.
5.2 Kostruksi plasmid ekspresi pPIC3,5K-SEC4 dan kloning dalam E. coli
Gen SEC4 hasil subkloning dipotong dari plasmid pJet1.2-SEC4 menggunakan enzim EcoR1. Pemotongan plasmid ini dengan enzim EcoR1 menghasilkan dua pita DNA yaitu 3000 pb (vektor pJet1.2) dan 615 pb (gen SEC4). Sedangkan pemotongan plasmid pPIC3.5K dengan enzim EcoR1 menghasilkan satu pita dengan ukuran 9000 pb (Gambar 5.3)
Gambar 5.3. Hasil restriks pJET1.2-SEC4 dan vektor pPICK3.5K dengan enzim EcoR1. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) pPICK3.5K cut/ EcoR1, (lajur 3) pJET1.2-SEC4 cut/
40 Fragmen 9000 pb (pPIC3.5K) dan 615 pb(SEC4) dipotong dari gel agaros, kemudian dimurnikan menggunakan GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas). Kedua fragmen DNA ini diligasi dengan perbandingan molar fragmen SEC4:vektor pPIC3.5K = 5:1. Hasil ligasi dikloning dalam E. coli TOP10F’ dan diperoleh 104 transforman E. coli (Gambar 5.4).
a. b.
Gambar 5.4. Koloni E. coli [pPIC3.5K-SEC4] yang diremajakan.(a) koloni 1-52, (b) koloni 53-104.
Peta plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 hasil konstruksi diperlihatkan pada gambar 5.5. Plasmid ini membawa dua gen marker seleksi yaitu gen pengode resistan ampisilin dan kanamisin. Gen SEC4 berada dibawah kontrol promotor dan terminator AOX1. Induksi ekspresi dilakukan dengan menambahkan penginduksi metanol.
41 Hasil penentuan urutan nukleotida terhadap urutan gen SEC4 dalam plasmid rekombinan pJet1.2-SEC4 menunjukkan bahwa gen SEC4 hasil subkloning homologi 100% dengan urutan gen SEC4 P. pastoris pada GenBank (nomor akses: XM_002492307.1) (Gambar 5.6).
Gambar 5.6 Homologi urutan nukleotida SEC4 hasil subkloning dengan urutan SEC4 nomor NCBI. Warna merah menunjukkan tingkat homologi 100%.
42 5.3 Isolasi Plasmid pPIC3,5K-SEC4 dari E.coli TOP10F’ dan linearisasi
Plasmid pPIC3,5K-SEC4 diisolasi dari transforman E. coli TOP10F’ yang akan digunakan untuk transformasi P. pastoris. E. coli TOP10F’ [pPIC3,5K-SEC4] ditumbuhkan dalam media LB cair yang mengandung antibiotik tetrasiklin dan ampisilin. Setelah diinkubasi selama semalam diperoleh kultur E. coli TOP10F’ [pPIC3,5K-SEC4]. Penambahan antibiotik bertujuan untuk seleksi koloni transforman. E. coli TOP10F’ yang telah mengandung plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 akan resisten terhadap antibiotik ampisilin karena vektor pPIC3.5K memiliki gen pengode resistensi kanamicin/ ampisilin. Selain itu transforman juga resisten terhadap antibiotik tetrasiklin karena E.coli TOP10F’ membawa gen pengode resisten tetrasiklin, sehingga, hanya E.coli yang mengandung plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 yang akan tumbuh.
Plasmid rekombinan pPIC3,5K-SEC4 diisolasi dari E. coli TOP10F’ menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Sebagai pembanding digunakan plasmid pPIC3.5K yang diisolasi dengan metode yang sama. Hasil isolasi plasmid pPIC3.5K dan pPIC3,5K-SEC4 dari E. coli TOP10F’ dikarakterisasi dengan agarosa 1% (b/v). Plasmid pPIC3,5K-SEC4 mempunyai ukuran ~9615 pb. Hasil isolasi ditunjukkan pada Gambar 5.7.
Gambar 5.7 Hasil isolasi plasmid pPIC3,5K-SEC4 dengan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). (lajur 1) plasmid pPIC3,5K, (lajur 2) Ladder DNA 1 kb, (lajur 3) plasmid pPICK3.5K-SEC4.
Pada Gambar 5.7 terlihat pita DNA plasmid pada gel agarosa membentuk lebih dari satu pita. Adanya beberapa pita pada satu jalur menunjukkan DNA plasmid berhasil diisolasi. DNA plasmid memiliki konformasi superkoil yang berbeda-beda seperti
43 supercoiled monomer, supercoiled dimer, nicked circular, dan lain-lain (Jazwinski and Edelman, 1982), sehingga akan menghasilkan beberapa pita DNA pada gel agarose. Pita plasmid pPIC3.5K terletak lebih bawah dibandingkan plasmid pPICK3.5K-SEC4. Menurut literatur gen SEC4 P. pastoris dari NCBI (nomor akses: XM_002492307.1) memiliki 615 bp nukleotida dan mendapat tambahan plasmid pPICK3.5K yang memiliki ukuran ~9000 pb, sehingga ukuran pPICK3.5K-SEC4 menjadi ~9615 pb. Hasil ini menguatkan dugaan bahwa transforman E. coli TOP10F’ telah membawa plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4.
Vektor pPIC3.5K merupakan vektor ekspresi untuk P. pastoris berukuran 9004 bp. Vektor P. pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka panjang. Kaset ekspresi diintegrasi ke genom P. pastoris pada lokus spesifik untuk menghasilkan transforman yang stabil secara genetik. Integrasi dapat dilakukan dengan dua cara. Cara yang paling sederhana adalah dengan memotong vektor pada sisi yang unik dalam gen penanda (seperti HIS4) atau pada fragmen promotor AOX1 (Romanos, 1995; Gaffar, 2010). Pemotongan vektor P. pastoris dalam urutan yang sama dengan genom inang, akan menstimulasi peristiwa rekombinasi homolog yang merupakan target yang efisien untuk integrasi vektor ke lokus genom (Cregg & Madden, 1988).
Vektor pPIC3.5K sendiri memiliki sisi restriksi yang unik untuk melinearkan vektor pada lokus AOX1 dan HIS4 untuk integrasi yang efisien kedalam genom P. pastoris. Pada penelitian ini, linearisasi dilakukan pada lokus HIS4 karena lokus AOX1 telah terintegrasi gen ALP1. Terdapat tiga sisi restriksi unik yang dimiliki vektor pPIC3.5K agar menjadi linier yaitu SacI (dari Streptomyces achromogenes), SalI (dari Streptomyces albus), dan BspEI (dari Bacillus species) (Invitrogen, 2006). Pada penelitian ini digunakan enzim restriksi BspEI untuk melinierkan plasmid pPIC3.5K-SEC4 pada lokus HIS4. Enzim BspEI ini memiliki sisi pemotongan 5’T↓CCGGA3’ (BioLabs, 2007). Gen SEC4 tidak memiliki sisi pengenal BspEI sehingga gen SEC4 tidak terpotong. Hasil linierisasi plasmid pPIC3,5K─SEC4 oleh enzim BspEI ditunjukkan pada Gambar 5.8.
44 Gambar 5.8 Hasil linierisasi plasmid pPIC3.5K─SEC4. Lajur 1 Ladder DNA 1 kb, lajur 2
pPIC3.5K─SEC4/BspEI.
5.4 Uji Kualitatif P. pastoris WT-78 dan WT-68
Uji kualitatif perlu dilakukan untuk memastikan bahwa koloni P. pastoris yang akan dipakai mengekspresikan α-amilase. Uji kualitatif P. pastoris dilakukan dengan menggunakan media YPD (yeast-peptone-dextrose) padat yang ditambah pati. Hasil pengamatan (Gambar 5.9) menunjukkan bahwa koloni P. pastoris [ALP1-78] dan P. pastoris [ALP1-68] mampu mensekresikan α-amilase keluar sel. Hal ini ditunjukkan oleh adanya daerah bening di sekeliling koloni P. pastoris setelah dilakukan penambahan larutan KI/I2. Daerah bening tersebut terbentuk karena tidak adanya pati yang membentuk kompleks dengan KI/I2 karena pati telah dihidrolisis oleh -amilase yang disekresikan oleh P. pastoris, sedangkan daerah biru menunjukkan adanya pati yang masih tersisa dalam media pertumbuhan sehingga membentuk kompleks dengan iodium.
Gambar 5.9 Hasil uji aktivitas -amilase secara kualitatif dalam media padat yang mengandung 2% pati dan 0,5% metanol. (1) P. pastoris [ALP1-78], (2) [ALP1-68]. 2 2 ~ 9615 pb 10.000 bp 6000 bp 3000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 1 1
45 5.5 Transformasi P. pastoris menggunakan pPIC3.5K–SEC4 dengan metode
EasyCompTM (Invitrogen).
Vektor rekombinan pPIC3,5K─SEC4 yang telah linier kemudian digunakan untuk mentransformasi P. pastoris[ALP1-68] dan [ALP1-78] dengan Metode EasyComp™ (Invitrogen). Prosedur transformasi dilakukan mengikuti prosedur Invitrogen. Kemudian transforman P. pastoris [ALP1-68/SEC4] dan [ALP1-78/SEC4] ditumbuhkan pada media YPDS (yeast-peptone-dextrose-sorbitol) padat dan di inkubasi selama 3 hari, sehingga diperoleh koloni P. pastoris [ALP1-78/SEC4] dan [ALP1-68/SEC4] yang dapat dilihat pada Gambar 5.10.
Gambar 5.10 Koloni P. pastoris SEC4] hasil transformasi. (1) P. pastoris [ALP1-68/SEC4], (2) P. pastoris [ALP1-78/SEC4].
Hasil transformasi yang ditumbuhkan pada media YPDS padat tidak ditemukan koloni tunggal, maka koloni hasil transformasi diambil menggunakan jarum oase lalu digores ulang pada media YPDS padat untuk memperoleh koloni tunggal. Hasil pertumbuhan pada media YPDS tidak ditemukan koloni tunggal dikarenakan konsentrasi dari transforman terlalu pekat, sehingga koloni-koloni tunggal tidak terbentuk. Gambar hasil pertumbuhan transfoman Pichia pastoris pada media YPDS dapat dilihat pada Gambar 5.11.
46 Gambar 5.11 Koloni P. pastoris [ALP1/SEC4] pada media YPD padat.
5.6 Seleksi dan Karakterisasi Transforman P. pastoris a. Uji Resistensi Terhadap Geneticin
Hasil uji geniticin yang dilakukan terhadap P. pastoris [ALP1-SEC4] menunjukkan bahwa transforman P. pastoris resisten terhadap geniticin (2,5mg/mL). Transforman P. pastoris [ALP1-SEC4] ditumbuhkan pada media YPD cair selama semalam, kemudian densitas optiknya diukur dan diperoleh sebesar 2,653 untuk P. pastoris [ALP1-78/SEC4] dan 2,578 untuk P. pastoris [ALP1-68/SEC4]. Kemudian ditambahkan antibiotik geneticin dengan konsentrasi akhir 2,5 mg/mL ke dalam kultur, lalu diinkubasi selama semalam (16-18 jam), kemudian diukur OD-nya sebesar 2,664 untuk [ALP1-78/SEC4] dan 2,581 untuk [ALP1-68/SEC4]. Adanya produk gen resisten kanamisin dari Tn903 yang dibawa oleh plasmid pPIC3.5K menyebabkan P. pastoris resistens terhadap geniticin (Invitrogen, 2004), sehingga tranforman P. pastoris akan resisten terhadap antibiotik geneticin yang artinya gen pengode resisten terhadap geneticin telah terintegrasi ke genom P. pastoris.
b. Seleksi Fenotif His+ Pada Transforman P. pastoris
Seleksi fenotif His+ transforman P. pastoris dilakukan dengan cara menumbuhkan koloni tunggal P. pastoris pada media YPD cair selama semalam, kemudian dipindahkan ke media YPD padat yang telah mengandung Histidin dengan konsentrasi 0,004 mg/mL dan media YPD padat yang tidak mengandung histidin. Kemudian diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 30ºC. Transformasi menggunakan plasmid [pPIC3.5K─SEC4] akan merubah fenotip P. pastoris [ALP1-68]/His- maupun P. pastoris [ALP1-78] His- menjadi His+ karena vektor ekspresi pPIC3.5K yang digunakan membawa lokus HIS4. HIS4 mengode histidinol dehidrogenase yang merupakan salah satu enzim yang terlibat dalam biosintesis histidin. Galur His+ akan dapat tumbuh pada
47 media yang tidak mengandung histidin sedangkan galur His- tidak dapat tumbuh pada media yang tidak mengandung histidin. Gambar 5.12 menunjukan bahwa transforman P. pastoris [ALPI-78/SEC4] maupun [ALPI-68/SEC4] dapat tumbuh pada media yang tidak mengandung histidin, sehingga fenotipnya adalah His+.
Gambar 5.12 Seleksi fenotif His+. 1 merupakan P. pastoris dengan penambahan Histidin, 2 merupakan P. pastoris tanpa penambahan Histidin
5.7. Ekspresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan a. Peremajaan P. pastoris Rekombinan
Koloni hasil transformasi yang telah ditumbuhkan pada media YPD padat selanjutnya diremajakan dalam media YPD cair. Peremajaan ini dilakukan untuk memperoleh koloni yang lebih muda dengan densitas optik P. pastoris masih berada pada fase log pertumbuhan sekitar 10-12 (Triana,2010). Kultur diinkubasi selama 16-18 jam pada suhu 28-30°C dan kecepatan pengocokan 185 rpm. Gambar 5.13 menunjukkan sel P. pastoris yang telah diremajakan.
Gambar 5.13 Hasil peremajaan P. pastoris (1) [ALPI-68/SEC4] dan (2) [ALPI-78/SEC4] .
2
1 2
YPD padat dengan histidin
YPD padat tanpa histidin
48 b. Induksi Ekspresi α-Amilase oleh P. pastoris Rekombinan
P. pastoris [ALP1] yang diperoleh dari hasil penelitian (Gaffar 2011) digunakan sebagai pembanding untuk mempelajari pengaruh ko-ekspresi SEC4 terhadap level sekresi α-amilase. Koloni P. pastoris ditumbuhkan pada media YPD cair dan diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam 10 mL media BMGY (Buffered Glycerol-complex Medium: ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), kalium fosfat 100 mM pH 6, YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5% (b/v), gliserol 1% (v/v)) menggunakan labu 100 mL. Komponen yang terdapat pada media ini berperan dalam mengontrol pH media, menurunkan aktivitas protease dan meningkatkan biomassa (Invitrogen, 2004). Media BMGY ini mengandung gliserol karena sel P. pastoris dengan cepat dapat mencapai densitas sel yang tinggi pada kultur yang mengandung gliserol. Media BMGY tidak mengandung metanol karena pada fase pertumbuhan ini hanya bertujuan untuk memperbanyak sel P. pastoris sehingga metanol sebagai penginduksi belum ditambahkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 28-30°C dengan kecepatan 200 rpm agar sel dapat tumbuh optimal. Kultur yang diinkubasi selama 16-18 jam mencapai OD600 (densitas optik yang diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ600) sekitar 9-10. Hasil ini sangat tinggi bagi beberapa mikroorganisme namun tidak bagi P. pastoris.
Inokulum dari media BMGY disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan pelet. Supernatan didekantasi dan pelet sel P. pastoris diresuspensi dalam 25 mL media BMMH (buffered minimal methanol histidine: YNB 1,34% (b/v), kalium fosfat 100 mM pH 6, biotin 4x10-5% (b/v), metanol 1% (v/v), histidin 0,004%) menggunakan labu 250 mL. Labu ditutup dengan kapas steril dan inkubasi dilanjutkan dengan pengocokan. Inkubasi dilakukan pada suhu 28-30°C dengan kecepatan pengocokan 185 rpm, pertumbuhan di atas 32oC selama fase induksi dapat mengganggu ekspresi protein dan dapat menyebabkan kematian sel (Invitrogen, 2004). Induksi dilakukan dengan menambahkan metanol dengan konsentrasi akhir 0,75% setiap 24 jam, pada jam ke 24, 36, 72, 96, 120, dan 144. Pengambilan sampel dilakukan setiap jam induksi dengan mengambil 1 mL kultur hasil ekspresi dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Sampel disentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 2-3 menit pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan ke tabung lain, supernatan dan pelet disimpan pada pendingin -20C sampai siap untuk diuji.
49 c. Densitas Optik Selama Masa Ekspresi
Densitas optik dapat menunjukkan tingkat pertumbuhan sel. Spektrofotometer digunakan untuk analisis ini, densitas optik diukur pada panjang gelombang 600 nm. Gambar 5.14 di bawah ini menunjukkan densitas optik P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-78/SEC4] selama waktu induksi. OD tertinggi diperoleh pada jam ke-72, yaitu 24,15 pada P. pastoris 78/SEC4] dan 22,95 pada P. pastoris [ALPI-68/SEC4] .
Gambar 5.14 Densitas optik P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dan [ALPI-78/SEC4] yang ditumbuhkan pada media yang mengandung 0,75% metanol sebagai penginduksi.