HASIL PENELITIAN
3 METODOLOGI .1 Waktu dan Tempat Penelitian .1 Waktu dan Tempat Penelitian
3.3.2 Kajian Bioaktif
3.3.2.1 Ekstraksi B. rotundiformis, N. oculata dan Prochloron sp.
Untuk kebutuhan ekstraksi, B. rotundiformis dikultur dalam wadah 1000 ml. Pada tahap awal B. rotundiformis dikultur pada suhu dan salinitas optimum yakni suhu 28 ºC dan salinitas 20 ppt (James dan Abu 1990). Kemudian sebagian B. rotundiformis diadaptasikan pada salinitas 4 ppt, 40 ppt, 50 ppt dan 60 ppt. Untuk memperoleh salinitas yang rendah yaitu diencerkan dengan aquades, kemudian diukur dengan bantuan refraktometer sampai dicapai salinitas yang diinginkan. Sedangkan untuk memperoleh salinitas yang lebih tinggi, air laut dididihkan (sekitar dua jam) dan didinginkan, setelah itu diukur dengan
refraktometer sampai diperoleh salinitas yang diinginkan. Adaptasi B. rotundiformis pada salinitas yang berbeda dilakukan dengan cara menurunkan
dan menaikkan salinitas medium sebesar 2 ppt setiap dua hari dalam tabung reaksi 10 ml yang berisi 10 individu. Setelah diadaptasikan, B. rotundiformis dipindahkan kedalam wadah 1000 ml dengan kepadatan 50 individu dan dikultur pada salinitas 4 ppt, 20 ppt, 40 ppt, 50 ppt, 60 ppt dengan dua jenis pakan berbeda (N. oculata dan Prochloron sp.). Panen B. rotundiformis dilakukan dengan menggunakan jaring plankton 40 μm dan dikerjakan dalam wadah berisi es. B. rotundiformis yang tersaring dipindahkan ke dalam tabung Ependorf dengan menggunakan pipet. Hasil saringannya disimpan dalam Ependorf yang sudah diberi label, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disimpan dalam freezer pada suhu -20 ºC (Gambar 8).
Gambar 8 Kultur dan pemanenan B. rotundiformis untuk ekstraksi senyawa bioaktif Disaring dimasukkan dalam ependorf - Diberi label - Dibungkus dengan alumuniubm foil - Diberi label kembali Di simpan di freezer (-20 0C) 10 ml C A B 1 Individu l Dari alam 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 4 ppt 20 ppt 40 ppt 50 ppt 60 ppt D E 4 ppt 20 ppt 40 ppt 50 ppt 4 ppt 40 ppt 50 ppt 60 ppt 20 ppt 1000 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml adaptasi
Untuk mendeteksi kandungan senyawa bioaktif maka dilakukan proses ekstraksi terhadap B. rotundiformis dan alga mikro N. oculata dan Prochloron sp. Tujuan pengujian alga mikro adalah untuk memastikan apakah alga mikro sebagai pakan B. rotundiformis juga memberikan kontribusi terhadap kandungan senyawa bioaktif yang dimiliki oleh B. rotundiformis. Untuk mendapatkan ekstrak kasar, sampel B. rotundiformis, N. oculata dan Prochloron sp. digerus dengan alat penggerus (lumpang) dan dihomogenasikan dengan metanol 80 % perbandingan 1:2 (satu bagian sampel plankton dan 2 bagian metanol). Homogenat yang ada direndam selama 24 jam, setelah itu disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit, sehingga diperoleh presipitat 1 dan supernatan 1. Dalam presipitat 1 ditambahkan lagi metanol 1:2 kemudian diinkubasi selama 8 jam, setelah itu disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm sehingga diperoleh presipitat 2 dan supernatan 2. Selanjutnya supernatan 1 dan 2 dengan presipitat 1 dan 2 yang diperoleh, dievaporasi dengan menggunakan rotari vacum evaporator sehingga diperoleh ekstrak kasar rotifera B. rotundiformis, N. oculata dan Prochloron sp. (Harborne 1987; Houghton 1998) (Gambar 9).
Gambar 9 Prosedur ekstraksi - Pengocokan - Sentrifus (3000 rpm, 15’) Pengocokan Homogenasi sampel + metanol 80 % (1:2) Sampel digerus (dihancurkan) Lumpang Shaker Presipitat 1 ditambahkan metanol 80% (1:2) Ekstrak Kasar Presipitat 1,2 dan supernatan EVAPORASI Sentrifus 15 it Presipitat 1, supernatant 1 Presipitat 2, supernatant 2
3.3.2.2 Inokulum Bakteri dan Antibiotik Pembanding
Bakteri yang digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri adalah bakteri gram positif dan gram negatif. Mikroba-mikroba tersebut digolongkan dalam mikroba patogen atau penyebab penyakit, dan kedua golongan mikroba tersebut yang akan dicegah pertumbuhannya dengan antibakteri yang terdapat pada B. rotundiformis. Bakteri uji tersebut adalah Vibrio cholerae (gram negatif, bentuk batang bengkok/spiral), Bacillus subtilis (gram positif, bentuk batang) dan Escherichia coli (gram negatif, bentuk bulat), (Ndukwe et al. 2005). Isolat bakteri dalam medium miring ditumbuhkan di cawan petri yang berisi medium agar steril dengan cara digores menggunakan jarum öse. Setelah bakteri berumur 24 jam, masing-masing bakteri tersebut dimasukkan ke dalam tabung yang berisi larutan NaCl (larutan saline 0,9 %) sebanyak 10 ml dan diukur kepadatannya hingga 109 sel/ml dengan menggunakan metode McFarland. Antibiotik pembanding yang digunakan adalah amoksisilin dan tetrasiklin. Dosis masing-masing antibiotik adalah 0,5 mg/ml.
3.3.2.3 Pembuatan Medium Agar
Medium agar dibuat dari nutrien agar (NA) sebanyak 2 gram yang dilarutkan dalam 100 ml aquades lalu dipanaskan sambil diaduk, kemudian disterilkan dengan otoklaf selama 15 menit pada suhu 121 ºC. Selanjutnya nutrien agar dituang dalam cawan petri steril secara merata masing-masing 15 ml dan dibiarkan mengeras. Untuk memastikan medium agar ini bersih dan tidak terkontaminasi bakteri lain, maka medium agar dibiarkan selama 24 jam. Medium agar yang tidak terkontaminasi dengan bakteri lain selanjutnya digunakan untuk kebutuhan uji aktivitas antibakteri (Gambar 10).
Gambar 10 Pembuatan medium agar
3.3.2.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian antibakteri dilakukan untuk menentukan kesanggupan membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme hidup. Metode pengujian antibakteri yang digunakan adalah metode agar kertas cakram (paper disc method) berdasarkan Jorgensen et al. 1999 dan Waksman 1974 dalam Wangidjaja 2002. Pada cara difusi ini larutan senyawa antibakteri akan berdifusi dari kertas saring yang mengandung senyawa antibakteri lalu masuk kedalam medium agar yang telah diinokulasi dengan mikroba penguji. Setelah inkubasi, terjadi hambatan dari pertumbuhan bakteri uji sehingga terjadi daerah bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram yang ditetesi suspensi senyawa antibakteri tersebut. Daerah hambatan yang terbentuk luasnya berbeda-beda sesuai dengan kadar senyawa antibakteri yang dikandungnya.
Otoklaf Nutrien agar 2 gr Dilarutkan Ditimbang Aquades 100 ml Dituang Nutrien agar
Pengujian antibakteri dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Hayati Laut Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Unsrat. Medium agar yang telah disiapkan diolesi bakteri uji dengan menggunakan kapas steril. Setelah itu kertas cakram yang terbuat dari kertas saring Whatman steril berdiameter 6 mm diletakkan diatas medium agar yang telah diolesi bakteri uji. Selanjutnya 1 mg ekstrak kasar B. rotundiformis dilarutkan dalam 1 ml pelarut metanol (1 mg/ml), dan dari konsentrasi ekstrak kasar ini diambil 1 mikro liter dan diteteskan ke kertas cakram yang telah disiapkan, juga diteteskan antibiotik pembanding dan metanol sebagai kontrol, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi 24 jam, diukur zona bening yang terbentuk yaitu berupa daerah bening sekeliling kertas cakram. Dalam pengujian ini bakteri yang digunakan adalah bakteri V. cholerae, B. subtilis dan E. coli. Antibiotik yang dicoba sebagai pembanding adalah tetrasiklin dan amoksisilin.
Besarnya diameter zona hambat yang terbentuk dari masing-masing ekstrak kasar B. rotundiformis dibandingkan dengan yang dibentuk oleh antibiotik dan metanol. Makin besar diameter zona bening atau zona hambat dari ekstrak berarti makin besar daya antibakterinya (Gambar 11).
Gambar 11 Pengujian aktivitas antibakteri Inkubas
Ukur zona bening