BAB 3 METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.5 Karakterisasi Gelatin
Nilai pH dari larutan gelatin dapat diukur menggunakan metode Alfaro et al. (2014). Larutan gelatin dibuat dalam konsentrasi 1% (b/v) dengan cara melarutkan 0,1 gram gelatin dalam 10 ml aquadest pada suhu 60°C. Selanjutnya diaduk konstan selama 30 menit dan dibiarkan pada suhu ruang (25°C). pH diukur menggunakan pH meter F-52 Horiba .
3.3.5.2 Uji Kejernihan Larutan Gelatin
Kejernihan dapat diuji dengan menggunakan metode Shyni et al., 2013. Larutan gelatin dibuat pada konsentrasi 6,67% (b/v) dengan cara dilarutkan menggunakan aquadest pada suhu 60°C selama 1 jam. Kemudian dilakukan pengukuran transmittan (%T) pada panjang gelombang 620 nm menggunakan spektrofotometer.
29
3.3.5.3 Uji Kadar Air Gelatin
Sebanyak 2 gram sampel gelatin dimasukkan dalam botol timbang kering yang telah dipijarkan dan ditara sebelumnya. Botol timbang yang berisi sampel tersebut dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105°C selama 6 jam atau hingga diperoleh berat konstan. botol berisi sampel tersebut didinginkan dalam desikator. Proses selanjutnya adalah penimbangan botol yang berisi sampel setelah dikeringkan (Rachmania, et al., 2013).
Kadar air dapat dihitung dengan rumus :
% Kadar air= W1-W2W3 x 100%
Keterangan:
W1= berat (sampel + botol) sebelum dikeringkan, W2 = berat (sampel + botol) setelah dikeringkan, W3= berat sampel sebelum dikeringkan
3.3.5.4 Uji Kadar Abu Gelatin
Sampel gelatin sebanyak 2 gram dimasukkan dalam cawan pengabuan yang telah dipijarkan dan ditara sebelumnya. Cawan yang berisi sampel dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600°C selama 6 jam atau sampai didapat abu yang berwarna keabu-abuan (sampai terbentuk abu sempurna). Cawan berisi sampel didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang (Rachmania, 2013). Kadar abu dihitung dengan rumus:
Kadar Abu=Berat sampel x 100%Barat abu
3.3.5.5 Uji Viskositas Larutan Gelatin
Untuk menentukan viskositas dari gelatin digunakan metode Shyni et al., 2014. Larutan gelatin dibuat dalam konsentrasi 6,67% (b/v) menggunakan aquadest yang dipanaskan pada suhu 60°C. Sebanyak 250 ml larutan diukur viskositasnya menggunakan alat Brookfield Digital Viscometer. Spindel nomor 1 dipasang pada alat, kemudian dicelupkan sampai tanda batas yang ditentukan ke dalam gelas beker yang berisi larutan gelatin. Kecepatan putaran alat diatur kemudian pembacaan skala dilakukan dengan mengamati jarum merah pada posisi stabil di tiap kecepatan. Pengukuran ini dilakukanpada suhu 30± 0,5°C.
3.3.5.6 Uji Sifat Busa Larutan Gelatin
Foaming Expansion (FE) dan Foaming Stability (FS) dari larutan gelatin diuji menggunakan metode Jellouli et al. (2011) dengan sedikit modifikasi. Larutan gelatin dibuat dalam konsentrasi 1% (b/v) dengan cara melarutkan 0,5 gram sampel gelatin dalam 50 ml aquadest suhu 60°C. Larutan gelatin tersebut didinginkan hingga suhu 31°C. Kemudian untuk pembentukan busa, larutan gelatin dihomogenisasi menggunakan Homogenizer selama 5 menit pada suhu ruang dengan kecepatan 10.000 rpm. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam gelas ukur 250 ml, dan volume total diukur pada menit ke 0, 10, 30, dan 60 setelah pencampuran. Kapasitas busa akan terlihat sebagai ekspansi busa pada menit ke 0, yang dapat di dihitung dengan menggunakan persamaan berikut ini:
FE % =VT-V0 V0 x100 %
Stabilitas Busa dihitung sebagai volume busa yang bertahan setelah 10, 30 dan 60 menit.
FS % = Vt-V0Vo x 100 %
Keterangan:
VT adalah volume total tepat setelah proses homogenisasi larutan gelatin (ml); V0 adalah volume sebelum proses homogenisasi larutan gelatin (ml); Vt adalah Volume total setelah didiamkan pada suhu ruang untuk waktu yang berbeda.
3.3.5.7 Uji Sifat Emulsifikasi Gelatin
Indeks Aktivitas Emulsifikasi (IAE) dan Indeks Stabilitas Emulsi (ISE) ditentukan bedasarkan M. Ahmad, S Benjakul (2011). Minyak kacang kedelai sebanyak 2 ml dan larutan gelatin (1%, 6 ml) dihomogenisasi menggunakan Homogenizer dengan kecepatan 20.000 rpm selama 1 menit kemudian diambil sebanyak 100 μl dari dasar tabung menggunakan pipet mikro pada menit ke 0 dan ke 10. Larutan gelatin tersebut dimasukkan ke dalam 5 ml larutan SDS (Sodium Dodesil Sulfat) 0,1 % hingga volume total 5 ml, selanjutnya dicampur menggunakan vortex mixer selama 10 detik sampai homogen. Absorbansi dari larutan tersebut diukur menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 500 nm.
31
Indeks Aktivitas Emulsi dan Indeks Stabilitas Emulsi dapat dihitung menggunakan rumus berikut ini:
IAE (m2 g )=
(2x 2,303 x A x DF) l∅C
Keterangan:
A= A500, DF= Faktor dilusi (100), l= panjang kuvet (m), ø= fraksi volume minyak dan C= konsentrasi protein dalam fasa air (g/m3).
ISE min = A0-A10 ∆tA0
Keterangan: A0= A500 pada menit ke 0, A10= A500pada menit ke 10 dan Λt= 10 menit. 3.3.5.8 Penentuan Daya Serap Air Gelatin
Kemampuan daya serap air ditentukan dengan menggunakan metode Razali et al., 2015. Sebanyak 0,5 gram gelatin dimasukkan dalam tabung sentrifugasi. Kemudian sebanyak 10 ml aquadest ditambahkan ke dalam tabung tersebut dan divortex selama 30 detik. Larutan tersebut dibiarkan pada suhu ruang selama 25 menit. Kemudian Larutan gelatin disentrifugasi dengan kecepatan 4800 rpm selama 25 menit. Supernatan yang terbentuk disaring dengan kertas Whattman no 1. Kemudian diukur volume sisa supernatan yang diperoleh menggunakan gelas ukur. Daya serap air dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Daya Serap Air (mlg )=Volume awal-volume supernatan (ml)berat gelatin (g) 3.3.5.9 Penentuan Daya Serap Lemak Gelatin
Kemampuan daya serap lemak ditentukan dengan menggunakan metode Razali et al., (2015) dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 0,5 gram gelatin dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi. Kemudian sebanyak 10 ml minyak palm ditambahkan ke dalam tabung tersebut dan divortex selama 30 detik. Supernatan yang terbentuk disaring dengan kertas Whattman no 1. Kemudian diukur volume sisa supernatan yang diperoleh menggunakan gelas ukur. Daya serap lemak dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
3.3.5.10 Uji Kandungan Hidroksiprolin dalam Gelatin 3.3.5.10.1 Penyiapan Bahan Baku
1. Pembuatan larutan induk hidroksiprolin 1000 ppm
Ditimbang sebanyak 10 mg serbuk standar hidroksiprolin dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas kocok sampai homogen.
2. Pembuatan larutan standar 100 ppm
Dipipet sebanyak 10 ml dari larutan induk hidroksiprolin 1000 ppm secara kuantitatif, kemudian larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas kocok sampai homogen.
3. Pembuatan larutan hidroksiprolin standar konsentrasi 0, 3, 6, 9, 12, 15, dan 18 ppm
Dipipet sebanyak 0,3 ml, 0,5 ml, 0,9 ml, 0,12 ml, 0,15 ml dan 0,18 ml dari larutan standar hidroksiprolin 100 ppm, masing-masing larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Aquades ditambahkan sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.
3.3.5.10.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dan Pembuatan Kurva Standar Hidroksiprolin
Sebanyak 1 ml larutan standar hidroksiprolin (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 ppm) dipipet dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Kemudian sebanyak 2 ml buffer sitrat-asetat pH 6 dimasukkan ke dalam labu ukur. NaCl 0,3 M ditambahkan ke dalam labu ukur hingga tanda batas dan kocok homogen. Sebanyak 10 ml larutan dari masing-masing konsentrasi diambil dari labu ukur 25 ml tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung uji. Kemudian ditambahkan 300 mikroliter isopropanol dan 600 mikroliter larutan oksidan dan dicampur hingga merata. Campuran larutan tersebut divortex selama 4 menit, kemudian sebanyak 4
ml larutan reagen Ehrlich’s ditambahkan dan campuran dimasukkan ke dalam
shaker bath selama 25 menit pada 60°C dengan pergerakan ±3 movement per minute.
33
a. Penentuan panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang maksimum ditentukan dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada rentang panjang gelombang 400–800 nm pada konsentrasi 9 ppm. Aquades digunakan sebagai blanko.
b. Pembuatan kurva standar hidroksiprolin
Pembuatan kurva standar dilakukan dengan mengukur serapan pada larutan standar hidroksiprolin konsentrasi 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 ppm yang telah dibuat. Serapan diukur menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang yang sudah diketahui dari penentuan panjang gelombang maksimal. Kemudian dibuat kurva kalibrasi sampai didapat persamaan linear y=a+bx. Linearitas dari kurva kalibrasi dilihat dengan menghitung koefisien korelasi (r) dari persamaan regresi linear.
3.3.5.10.3 Penentuan Kandungan Hidroksiprolin pada Sampel Gelatin
Kandungan hidroksiprolin ditentukan dengan menggunakan metode R. Balti et al. (2011). Sampel gelatin 10 mg dihidrolisis menggunakan 5 ml HCl 6N selama 12 jam pada suhu 110°C. Setelah hidrolisis asam, larutan sampel dinetralisasi menggunakan NaOH 6N. Sebanyak 1 ml larutan sampel dan 2 ml larutan buffer asetat/sitrat ditambahkan ke dalam labu ukur 25 ml kemudian NaCl 0,3 M ditambahkan ke dalam labu ukur hingga tanda batas dan kocok homogen. Sebanyak 1 ml larutan diambil dari labu ukur 25 ml tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung uji. Kemudian ditambahkan 300 mikroliter isopropanol dan 600 mikroliter larutan oksidan dan dicampur hingga merata. Campuran larutan tersebut divortex selama 4 menit, kemudian sebanyak 4 ml larutan reagen
Ehrlich’s ditambahkan dan campuran dimasukkan ke dalam shaker bath selama 25 menit pada 60°C dengan pergerakan ±3 movement per minute.
Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang yang sudah diketahui. Kandungan hidroksiprolin dari larutan sampel dihitung dengan cara memasukkan nilai absorbansi ke dalam kurva kalibrasi yang diturunkan dari standar hidroksiprolin grade analytical.
