3 METODOLOGI
3.3 Metodologi Penelitian
3.3.1 Karakterisasi isolat BP (8)
Isolat BP (8) diperoleh dari hasil isolasi bakteri asal bekasam ikan sepat rawa yang diperoleh dari kecamatan Indralaya, Kabupaten Ogan Ilir, Sumatera Selatan. Tujuan karakterisasi adalah untuk verifikasi isolat BP (8) sebagai kelompok BAL dan menentukan pendugaan genus. Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif, batang atau kokus tunggal, berpasangan atau rantai tidak berspora, terkadang membentuk segiempat, katalase negatif, toleran terhadap asam dan anaerob fakultatif (Defigueredo dan Splittstoesser 1976; Mozzi et al. 2010). Karakterisasi isolat BP (8) untuk verifikasi meliputi pewarnaan Gram, pewarnaan spora, uji motilitas, uji katalase, oksidase, kadar asam laktat dan fermentasi glukosa. Pendugaan genus dilakukan mengikuti tahap karakterisasi menurut Bergey’s Manual (Holt et al. 1994) (Lampiran 2).
(1) Pewarnaan Gram (Fardiaz 1989)
Lapisan tipis dibuat secara aseptis dari suspensi bakteri di atas gelas objek dan dilakukan fiksasi pada udara terbuka. Lapisan tipis ini ditetesi zat warna kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air kran dengan cara memegang gelas objek pada posisi miring. Sisa air yang tertinggal pada gelas objek dibuang dan ditetesi dengan lugol serta dibiarkan selama 1 menit. Gelas objek dibilas kembali, kemudian dihilangkan warnanya dengan menggunakan alkohol 96% dan dibiarkan selama 10-20 detik, lalu dibilas. Olesan pada gelas objek kemudian diwarnai dengan safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik. Objek gelas selanjutnya dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap (tissue). Preparat ini diamati dibawah mikroskop menggunakan lensa objektif yang telah diolesi minyak immersi. Bakteri-Gram positif akan ditunjukkan dengan warna ungu, sedangkan bakteri Gram-negatif akan ditandai dengan warna merah atau merah muda.
(2) Pewarnaan spora (Fardiaz 1989)
Lapisan tipis dibuat secara aseptis dari suspensi bakteri di atas gelas objek dan difiksasi. Lapisan tipis ini ditetesi pewarna malachite green dan dibiarkan selama 20 menit tanpa pemanasan. Preparat kemudian dibilas dengan air dengan cara memegang gelas objek pada posisi miring dan dikeringkan dengan kertas serap (tissue). Olesan pada gelas objek kemudian ditambahkan beberapa tetes zat
warna safranin dan dibiarkan selama 30 detik dan dicuci dengan air mengalir serta dikeringkan. Preparat ini diamati di bawah mikroskop menggunakan lensa objektif yang telah diolesi minyak immersi. Endospora yang masih terdapat dalam sel vegetatif maupun spora bebas akan berwarna hijau biru, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah sampai merah muda.
(3) Uji motilitas (Fardiaz 1989)
Pengujian motilitas bakteri dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis dengan menggunakan jarum ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam media SIM. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 °C selama 1hari. Pertumbuhan bakteri yang menyebar menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat motil dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat non motil.
(4) Uji katalase (Fardiaz 1989)
Isolat bakteri sebanyak 1 lup diambil secara aseptis dan dipindahkan pada gelas objek. Preparat tersebut ditetesi dengan larutan 3% H2O2. Adanya enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung seperti busa sabun. (5) Uji oksidase (Fardiaz 1989)
Sebanyak 1 gram p-aminodimetilanilin oksalat dilarutkan dalam 100 cc akuades kemudian dipanaskan. Larutan tersebut diteteskan ke kertas Whatman 42 hingga warna kertas berubah menjadi ungu. Isolat bakteri yang akan diujikan dioleskan ke kertas Whatman 42. Kertas yang tetap berwarna ungu menunjukkan hasil positif, sedangkan bila berubah menjadi merah maka negatif.
(6) Uji fermentasi glukosa (Hayward 1957)
Pendeteksian produksi gas dari isolat BP (8) dilakukan dengan metode fermentasi glukosa dalam tabung Durham. Isolat BP (8) diinokulasikan secara aseptik ke dalam media MRSB + glukosa 10% dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Hasil uji heterofermentatif ditunjukkan dengan adanya gas yang terbentuk dalam tabung Durham.
(7) Total kadar asam laktat (Moore et al. 2011)
Pengukuran kadar asam laktat dilakukan dengan metode titrasi menggunakan larutan NaOH (N=0,1091). Supernatan sebanyak 1 ml dilarutkan dengan pewarna fenolftalein, kemudian dititrasi oleh NaOH hingga warna larutan
supernatan berubah kemerahan. Persentase (%) asam laktat dihitung menggunakan rumus:
% Asam laktat = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100% Bobot Sampel
Keterangan:
V NaOH = Volume NaOH yang terpakai
N NaOH = Normalitas NaOH yang terukur (0,1091) FP = Faktor Pengencer (1)
Bobot sampel = bobot supernatan (mg)
90 = BM Asam laktat
(8) Pendugaan genus (Holt et al. 1994)
Isolat BP (8) yang telah diverifikasi kemudian dilakukan pengujian ke tahap selanjutnya hingga tingkat genus dengan menggunakan buku identifikasi
Bergey’s Manual (Holt et al. 1994). Karakteristik yang diamati untuk
membedakan sifat dari genus bakteri asam laktat menurut buku Bergey’s Manual adalah sebagai berikut:
1. Kenampakan sel: sel diamati apakah berpasangan, 4 sel membentuk kelompok (tetrad), membentuk rantai (panjang, pendek, sangat panjang), atau membentuk kluster.
2. Pertumbuhan, bakteri ditumbuhkan pada:
(a) media produksi yang diinkubasi pada suhu 45 °C (b) media produksi dengan pH 9,6
(c) media produksi dengan penambahan 6,5 % NaCl 3. Reaksi katalase (uji katalase)
4. Keberadaan sitokrom (uji oksidase) 3.3.2 Produksi antibakteri
Isolat dari bakteri yang telah teridentifikasi dikultur untuk memproduksi supernatan aktif sebagai antibakteri. Tahapan ini meliputi penyegaran isolat, kultivasi BAL, pemanenan dan uji aktivitas antibakteri.
(1) Penyegaran isolat
Media yang digunakan dalam tahap ini adalah MRSA dan MRSB. Media MRSA yang sudah ditimbang dilarutkan dalam akuades kemudian diaduk hingga homogen di atas kompor listrik pada suhu 100 °C, begitu pula dengan MRSB.
Media yang telah siap kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 °C dan tekanan 1 atm selama 15 menit.
Penyegaran bakteri dan persiapan inokulum dilakukan untuk mendapatkan biakan bakteri yang segar dan siap pakai. Proses penyegaran dan persiapan inokulum adalah sebagai berikut: isolat bakteri asam laktat dalam gliserol disegarkan pada media MRSA miring, disimpan pada kaleng bekas biskuit dengan dimensi kaleng 15x15x25 (cm) dengan kondisi anaerob kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Bakteri di MRSA miring diinokulasikan 1 lup dalam medium inokulum MRSB dengan volume kerja 15 ml. Setelah itu diinkubasi dengan shaker waterbath selama 18 jam pada suhu 37 oC kemudian diukur optical
density dengan λ=660 nm (OD660 0,6-0,8). (2) Kultivasi isolat BP (8)
Kultivasi sel bakteri merupakan proses peningkatan konsentrasi beberapa atau semua komponen suatu populasi dan biasanya secara mutlak ditentukan oleh macam pengukuran yang digunakan untuk memantau proses tersebut. Pengukuran sering digunakan untuk mencerminkan pertambahan jumlah atau massa sel (Hadiutomo 1988).
Isolat BP (8) dikultivasi dengan menggunakan tiga alat yang memiliki kondisi yang berbeda, yaitu menggunakan magnetic stirrer, shaker waterbath dan inkubator. Magnetic stirrer pada kondisi suhu ruang dan agitasi 150 rpm, shaker
waterbath dengan suhu 37 °C dengan agitasi 150 rpm dan inkubator dengan
kondisi suhu 37 °C dan berada dalam kaleng yang hampa udara serta tanpa agitasi.
Sebanyak 1% inokulum dimasukkan dalam medium produksi (MRSB) dengan volume kerja 100 ml menggunakan botol Schott®. Media yang telah diinokulasi diinkubasi dengan tiga perlakuan, yaitu inkubasi dengan magnetic
stirrer pada kondisi suhu ruang dan agitasi 150 rpm, inkubator dengan kondisi
suhu 37 °C dan berada dalam kaleng yang hampa udara serta tanpa agitasi dan
shaker waterbath dengan suhu 37 °C dengan agitasi 150 rpm. Pengamatan
dilakukan setiap 3 jam selama 36 jam. Parameter yang diamati adalah perubahan pH dan pertumbuhan dengan mengukur OD pada λ =660 nm.
(3) Pemanenan
Pemanenan dilakukan terhadap kultur yang telah berumur 24 jam. Kultur disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4 oC selama 15 menit (Nurhasanah 2004 diacu dalam Nurmalis 2008), kemudian supernatan dipisahkan dari endapan (biomassa sel).
Supernatan diberi tiga perlakuan, yaitu (1) tidak dinetralkan/pH asam (kode A), (2) dinetralkan dengan NaOH 1N/pH netral (kode N), (3) dinetralkan lalu diendapkan dengan (NH4)2SO4 (ammonium sulfat) pada konsentrasi 50% saturasi (kode E). Ammonium sulfat 50% kejenuhan adalah 341 g ammonium sulfat dilarutkan dalam 1 liter.
Supernatan yang tidak dinetralkan dan yang dinetralkan difiltrasi menggunakan millipore dengan ukuran pori 0,2 µm sehingga diperoleh supernatan bebas sel (kode A dan kode N).
Ammonium sulfat dimasukkan ke dalam supernatan netral secara perlahan-lahan sambil diaduk dengan magnetic srirrer sampai larut dan homogen, diendapkan dan disimpan dalam refrigerator selama 24 jam, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC (Purwanti 2003). Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam buffer fosfat 0,1 M pH 7 (kode E). Pembuatan larutan buffer fosfat pH 7 dapat dilihat pada Lampiran 3.
(4) Uji aktivitas antibakteri
Uji aktivitas antibakteri dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat BAL dalam menghasilkan zat antibakteri. Uji aktivitas antibakteri dilakukan terhadap bakteri uji seperti Escherichia coli, Salmonella typhimurium dan Listeria
monocytogenes menggunakan metode difusi sumur agar (well diffusion agar)
(Hilmi dan Gokalp 2000). Bakteri uji disegarkan pada media NA miring secara aseptik, dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Sebanyak 1 lup bakteri uji diinokulasikan dalam 10 ml NB dan diinkubasi dalam shaker waterbath selama 18 jam setelah itu diukur OD pada λ=600 sebesar 0,6-0,8.
Sebanyak 20 µl bakteri uji berumur 18 jam (OD600 sebesar 0,6-0,8) dicampurkan dalam 20 ml media MHA (Mueller Hinton Agar) pada suhu media 50 oC. Media yang telah diinokulasikan tersebut kemudian dituangkan ke dalam
cawan petri. Media agar yang telah padat dibuat sumur-sumur dengan pipet Pasteur steril dengan diameter 6 mm. Supernatan aktif (asam, netral dan yang diendapkan) diambil sebanyak 50 µl dan dimasukkan ke dalam sumur pada media agar, lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 hari dan diamati aktivitasnya. Zona bening di sekeliling sumur menunjukkan adanya daya hambat. Areal penghambatan diukur berdasarkan diameter areal bening yang terbentuk di sekitar sumur (Hilmi dan Gokalp 2000).