4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakterisasi Isolat
Karakterisasi isolat BP (8) untuk verifikasi meliputi pewarnaan Gram, pewarnaan spora, uji motilitas, uji katalase, uji oksidase, uji fermentasi glukosa, penentuan kadar asam laktat. Pendugaan genus dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada media produksi dengan pH 9,6, media produksi yang diinkubasi pada suhu 45 °C dan media produksi yang ditambahkan NaCl 6,5% (Holt et al. 1994). Hasil karakterisasi dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Karakterisasi dan pendugaan genus isolat BP (8) Karakteristik Hasil Verifikasi
Gram Positif
Bentuk tetrad, beberapa berpasangan
Spora -
Motilitas -
Katalase -
Oksidase -
Fermentasi glukosa Tidak menghasilkan gas (homofermentatif) Total kadar asam laktat
- Magnetic stirrer 4,76 % - Skaker waterbath 4,57 %
- Inkubator 4,96 %
Kemampuan untuk tumbuh pada:
pH 9,6 -
Suhu 45 °C +
NaCl 6,5 % +
Hasil verifikasi menunjukkan bahwa isolat BP (8) termasuk dalam anggota kelompok BAL dan pada pendugaan genus, isolat ini termasuk dalam genus
Pediococcus sp.
Keterangan : (+) = memiliki aktivitas/tumbuh, (-) = tidak memiliki aktivitas/tidak tumbuh
4.1.1 Pewarnaan Gram
Pengamatan secara mikroskopik terhadap bentuk dan struktur sel merupakan tahap yang paling penting dalam karakterisasi bakteri. Isolat BP (8) memiliki bentuk bulat, selnya tetrad dan beberapa berpasangan. Pewarnaan Gram menunjukkan reaksi Gram positif pada isolat ini. Hasil pewarnaan Gram dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Bentuk sel dan hasil pewarnaan Gram isolat BP (8)
Ciri-ciri bakteri Gram-positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada sel bakteri. Hal tersebut disebabkan karena bakteri ini mempunyai kandungan lipid yang lebih rendah, sehingga dinding sel bakteri akan lebih mudah terdehidrasi akibat perlakuan dengan alkohol. Dinding sel yang terdehidrasi menyebabkan ukuran pori-pori sel menjadi kecil dan daya permeabilitasnya berkurang sehingga zat warna ungu kristal yang merupakan zat warna utama tidak dapat keluar dari sel dan sel akan tetap berwarna ungu. Bakteri Gram-negatif terlihat berwarna merah karena bakteri ini kehilangan pewarna kristal violet pada waktu pembilasan dengan alkohol namun mampu menyerap pewarna tandingan yaitu safranin. Bakteri Gram-negatif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih tinggi daripada yang dikandung bakteri Gram-positif. Dinding sel bakteri Gram-negatif juga lebih tipis daripada dinding sel bakteri Gram-positif (Pelczar dan Chan 2005).
4.1.2 Pewarnaan spora
Pewarnaan spora menunjukkan bahwa isolat BP (8) tidak membentuk spora. Spora bersifat tahan terhadap kondisi lingkungan ekstrim dan adanya bahan kimia beracun. Spora dibentuk oleh spesies bakteri yang termasuk dalam genera
Clostridium dan Bacillus untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan
bagi bakteri. Spora terbentuk dalam sel sehingga seringkali disebut sebagai endospora dan dalam sel bakteri hanya terdapat satu spora. Sel yang semakin tua menyebabkan sel vegetatif akan pecah sehingga endospora akan terlepas dari sel dan membentuk spora bebas. Zat warna yang paling sering digunakan untuk mewarnai spora adalah malachite green yang akan tetap diikat oleh spora bakteri setelah pencucian dengan air dan sebagai counterstain digunakan safranin. Endospora yang masih terdapat di dalam sel vegetatif maupun spora bebas akan
berwarna hijau-biru, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah sampai merah muda. Spora juga lebih tahan terhadap pewarnaan, akan tetapi sulit untuk melepaskan zat warna yang telah terserap ke dalamnya, sehingga tidak dapat mengikat zat warna lain yang diberikan berikutnya (counterstain). Prinsip pewarnaan ini digunakan untuk membedakan spora dari sel vegetatif (Fardiaz 1987). Hasil pewarnaan spora dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Hasil pewarnaan spora isolat BP (8). 4.1.3 Uji motilitas
Pengujian motilitas menunjukkan bahwa isolat BP (8) bersifat non motil. Hal ini dapat dilihat dari pertumbuhannya yang tidak menyebar pada media SIM. Oleh karena isolat tersebut bersifat non motil, maka dapat dinyatakan bahwa bakteri tersebut tidak mempunyai flagella sebagai organ untuk bergerak. Flagella merupakan salah satu struktur utama di luar sel bakteri yang menyebabkan terjadinya pergerakan (motilitas) pada sel bakteri. Flagella terbuat dari sub unit - sub unit protein yang disebut dengan flagelin. Sebagian besar spesies bakteri yang termasuk ke dalam kelompok Bacillus dan Spirilum mempunyai flagella sebagai alat geraknya, tetapi jarang ditemukan pada kelompok bakteri yang berbentuk coccus (Pelczar dan Chan 2005). Hasil pengujian motilitas bakteri dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10 Hasil uji motilitas isolat BP (8). 4.1.4 Uji katalase
Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada isolat bakteri. Katalase adalah enzim yang dapat mengkatalisasi penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini dapat menginaktivasikan enzim dalam sel. Uji ini penting dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri terhadap kebutuhan akan oksigen (Lay 1994 diacu dalam Candra 2006).
Mikroba dapat dibedakan atas tiga grup berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, yaitu mikroba yang bersifat aerobik, anaerobik dan anaerobik fakultatif. Setiap bakteri mempunyai suatu enzim yang tergolong flavoprotein yang dapat bereaksi dengan oksigen membentuk senyawa-senyawa beracun yaitu H2O2 dan suatu radikal bebas yaitu O2*, dengan reaksi sebagai berikut:
Flavoprotein oksigen H2O2 + O2*
Bakteri yang bersifat anaerobik fakultatif juga mempunyai enzim superoksida dismutase, tetapi tidak mempunyai enzim katalase, melainkan mempunyai enzim peroksidase. Enzim tersebut dapat mengkatalis reaksi antara H2O2 dengan senyawa organik, menghasilkan senyawa yang tidak beracun (Fardiaz 1989). Reaksinya adalah sebagai berikut:
H2O2 + Senyawa organik peroksidase Senyawa organik teroksidasi + H2O Bakteri yang bersifat aerobik mempunyai enzim superoksida dismutase yang dapat memecah radikal bebas dan enzim katalase yang dapat memecah H2O2
sehingga menghasilkan senyawa-senyawa akhir yang tidak beracun. Reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut:
2 O2*+ 2 H+ superoksida dismutase H2O2 + O2 2 H2O2
katalase
2 H2O2 + O2
Berbeda halnya dengan bakteri anaerobik obligat, bakteri ini tidak mempunyai enzim superoksida dismutase maupun katalase. Oleh karena itu oksigen merupakan racun bagi bakteri tersebut karena terbentuknya H2O2 dan O2* (Fardiaz 1989).
Penentuan adanya enzim katalase diuji menggunakan larutan 3 % H2O2 pada koloni terpisah. Isolat bakteri yang bersifat katalase positif akan terlihat pembentukan gelembung udara di sekitar koloni. Isolat BP (8) tidak menghasilkan gelembung (tidak memiliki enzim katalase), sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut bersifat anaerobik fakultatif.
4.1.5 Uji oksidase
Uji oksidase berfungsi untuk menentukan adanya sitokrom oksidase yang ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Sitokrom oksidase merupakan enzim yang berperan sebagai katalisator dalam transfer atom hidrogen dari sitokrom yang terakhir ke molekul oksigen. Sitokrom merupakan senyawa organik yang terdapat dalam sel hidup dan berperan dalam transfer atom hidrogen dari substrat ke molekul oksigen dengan katalis enzim sehingga dapat terbentuk air (Winarno dan Fardiaz 1984).
Berdasarkan hasil uji, dapat diketahui bahwa isolat BP (8) tidak menghasilkan enzim sitokrom oksidase yang mengkatalis transfer hidrogen dari sitokrom ke molekul oksigen. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak melakukan metabolisme energi melalui proses respirasi, melainkan melalui proses fermentasi. Hal tersebut terjadi karena dalam produk bekasam terdapat senyawa organik yang mampu digunakan oleh bakteri tersebut sebagai donor dan aseptor elektron untuk menghasilkan energi (Candra 2006). Berdasarkan uji katalase dan oksidase, dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diisolasi dari produk bekasam mempunyai sifat anaerobik fakultatif.
4.1.6 Uji fermentasi glukosa
Uji fermentasi glukosa bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut tergolong dalam bakteri homofermentatif atau heterofermentatif. Tabung
durham yang terdapat gelembung udara menunjukkan bahwa bakteri tersebut menghasilkan CO2, sehingga tergolong dalam BAL heterofermentatif. Tabung durham yang tidak terdapat gelembung udara menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk dalam golongan homofermentatif. Bakteri asam laktat yang hanya menghasilkan asam laktat pada fermentasi glukosa termasuk dalam golongan homofermentatif. Bakteri asam laktat yang menghasilkan asam laktat, CO2 dan etanol dari heksosa termasuk dalam golongan heterofermentatif (Jay et al. 2005). Isolat BP (8) tidak menghasilkan gelembung udara pada tabung Durham, maka isolat BP (8) tergolong dalam BAL homofermentatif. Hasil uji fermentasi glukosa dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11 Hasil uji fermentasi glukosa isolat BP (8). 4.1.7 Total kadar asam laktat
Pengujian kadar asam laktat berfungsi untuk mengetahui total asam laktat yang terbentuk selama pertumbuhan isolat BP (8). Asam laktat yang dihasilkan ini akan menurunkan pH. Total kadar asam laktat yang dihasilkan oleh isolat BP (8) pada perlakuan kultivasi magnetic stirrer sebesar 4,76%, shaker waterbath sebesar 4,57% dan inkubator sebesar 4,96% (Lampiran 4).
Asam laktat pada produk fermentasi terbentuk akibat adanya pemecahan glukosa oleh bakteri asam laktat. Bakteri ini dapat dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu bakteri homofermentatif dan heterofermentatif. Bakteri asam laktat yang menghasilkan asam laktat, CO2 dan etanol dari heksosa termasuk dalam golongan heterofermentatif (Jay et al. 2005). Golongan heterofermentatif memfermentasi glukosa melalui jalur fosfoketolase, sedangkan golongan homofermentatif melalui jalur EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) (Hidayat et al. 2006).
Hasil verifikasi menunjukkan bahwa isolat BP (8) termasuk kelompok bakteri Gram positif, bentuknya tetrad dan beberapa berpasangan, tidak berspora, non motil, katalase negatif, oksidase negatif. Hal ini sesuai dengan penyampaian Defigueredo dan Splittstoesser (1976) serta Mozzi et al. (2010), bahwa anggota bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram-positif, batang atau kokus yang tunggal, berpasangan atau rantai tidak berspora, terkadang membentuk segiempat, katalase negatif. Berdasarkan hasil verifikasi isolat BP (8) termasuk dalam kelompok bakteri asam laktat. Tahap selanjutnya dilakukan beberapa pengamatan karakteristik sehingga dapat diduga genus bakteri. Hal ini masih bersifat dugaan, karena untuk mengidentifikasi genus bakteri secara pasti masih diperlukan beberapa uji yang tidak dilakukan dalam penelitian ini.
Tahap pendugaan genus menggunakan buku identifikasi Bergey’s Manual (Holt et al. 1994). Berdasarkan hasil verifikasi terhadap isolat BP (8), isolat ini tergolong dalam kelompok 17, yaitu genera Gram positive cocci, dan bersifat anaerob fakultatif, pembedaan sifat antar genus menggunakan Tabel 17.2 (Lampiran 1). Anggota bakteri genera Gram positive cocci yang anaerob fakultatif antara lain, Aerococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc,
Melisococcus, Pediococcus, Saccharococcus, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus dan Vagococcus. Hasil karakterisasi isolat BP (8)
untuk pendugaan genus, berdasarkan Tabel 17.2 adalah sebagai berikut:
1. Kenampakan sel: sel yang diamati menggunakan mikroskop menunjukkan bahwa sel tetrad dan ada juga beberapa yang berpasangan (Gambar 9). Genus bakteri yang mendekati sifat ini adalah Aerococcus, Enterococcus,
Leuconostoc dan Pediococcus.
2. Pertumbuhan: bakteri yang ditumbuhkan pada:
(a) media produksi yang diinkubasi pada suhu 45 °C menunjukkan reaksi positif. Genus bakteri yang mendekati sifat ini adalah Enterococcus dan Pediococcus.
(b) media produksi dengan pH 9,6 menunjukkan reaksi negatif. Genus bakteri yang mendekati sifat ini adalah Pediococcus.
(c) media produksi dengan penambahan 6,5 % NaCl menunjukkan reaksi positif. Genus bakteri yang mendekati sifat ini adalah Pediococcus.
5. Reaksi katalase (uji katalase) menunjukkan reaksi negatif. Genus bakteri yang memiliki sifat ini adalah Pediococcus.
6. Keberadaan sitokrom (uji oksidase) menunjukkan reaksi negatif. Genus bakteri yang memiliki sifat ini adalah Pediococcus.
Berdasarkan hasil identifikasi menurut buku Bergey’s Manual (Holt et al. 1994), diduga isolat BP (8) termasuk dalam genus Pediococcus.
Pediococcus merupakan bakteri Gram-positif, nonmotil, tidak berspora, fakultatif
anaerob dan tergolong dalam bakteri asam laktat homofermentatif. Glukosa difermentasi dengan memproduksi asam tapi tidak menghasilkan gas. Katalase negatif, sitokrom negatif. Suhu pertumbuhan optimum adalah 20-40 °C. Hal ini diperkuat dengan hasil uji fermentasi glukosa yang menunjukkan bahwa isolat BP (8) merupakan BAL homofermentatif. Hasil pendugaan genus sesuai dengan pernyampaian Cai et al. (1999) yang mengkarakterisasi Pediococcus strain LA 3, LA 35 dan LS 5. Bentuknya tetrad, Gram-positif, homofermentatif dan tumbuh pada suhu 45 °C.
Pediococcus merupakan penghasil pediosin, yaitu bakteriosin kelas II.
Strain yang memproduksi pediosin adalah P.acidilactici, P.pentosaceus dan
P.damnosus (Papagianni dan Anastasiadou 2009). Pediosin yang dihasilkan dari
strain ini umumnya kecil dan protein hidrofobik. Pediocin PA-1/Ach memiliki zona hambat terhadap L.monocytogenes, B.cereus, C.perfringens, C.botulinum,
C.laramie, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus dan Lactococcus (Jeevaratnam et al. 2005).