1. PENDAHULUAN
4.2. Karakteristik Ekstrak Protein dengan Elektroforesis SDS-PAGE
Karakterisasi ekstrak protein dengan elektroforesis SDS PAGE bertujuan untuk mengetahui protein-protein penyusun daging sampel yaitu udang jerbung, ikan tongkol dan kerang hijau. Ekstrak protein baik sarkoplasma dan miofibril yang akan dianalisis dengan elektroforesis terlebih dahulu dihitung kadar proteinnya dengan metode Bradford. Hal ini bertujuan agar konsentrasi sampel tidak kurang dari batas deteksi pewarna yang digunakan (batas deteksi coomassie briliant blue = 0.1µg) (Bollag dan Edelstain 1991). Dengan diketahui kadar protein masing-masing sampel, maka jumlah protein yang akan diinjeksikan ke dalam mini slab elektroforesis dapat dibuat sama.
Elektroforesis memiliki peranan penting dalam pemisahan molekul-molekul biologi, khususnya protein. Elektroforesis juga sangat sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil (Bachrudin 1999). Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan dua jenis gel, yaitu gel penahan (stacking gel) dan gel pemisah (separating gel). Gel penahan dibuat dengan konsentrasi gel 4% yang memiliki ukuran pori lebih besar dan pH lebih kecil (6.8). Sementara gel pemisah dibuat dengan konsentrasi gel 12% yang mempunyai ukuran pori lebih kecil dan pH lebih besar (8.8). Pemilihan konsentrasi gel ini tergantung pada kisaran berat molekul protein yang akan dipisahkan. Semakin besar ukuran pori- pori gel (konsentrasi gel yang rendah) maka semakin besar molekul protein yang dapat bermigrasi. Gel penahan dibuat dengan ukuran pori lebih besar dengan kekuatan ion yang lebih kecil, sehingga mempercepat pergerakan molekul karena tahanan friksi yang rendah.
Protein yang akan dipisahkan dilarutkan dalam bufer yang mengandung SDS (Sodium Dodesil Sulfat) dan 2-merkaptoetanol. Penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS akan membungkus rantai protein yang tidak terikat membentuk kompleks SDS-protein yang bermuatan negatif. Kemudian kompleks SDS-protein ini dialirkan dalam medium yang mengandung medan listrik sehingga senyawa
protein yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah elektroda yang polaritasnya berlawanan dengan molekul protein. Kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih rendah dengan kompleks yang lebih lebih kecil. Hal tersebut disebabkan oleh kerapatan partikel gel yang menghambat mobilitas protein. Prinsip inilah yang digunakan untuk memisahkan molekul-molekul dengan muatan berbeda (Wijaya dan Rohman 2001). Berikut adalah berturut-turut dari atas ke bawah subunit protein dari berbobot molekul terbesar sampai terkecil, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5. Pola elektroforesis fraksi protein. M: low-molecular- weight protein marker, 1: sarkoplasma tongkol, 2: miofibril tongkol, 3: sarkoplasma kerang hijau, 4: miofibril kerang hijau, 5: sarkoplasma udang jerbung, 6: miofibril udang jerbung
Pita-pita yang terbentuk pada gel pemisah diidentifikasi dengan pewarnaan gel menggunakan larutan coomasie blue dalam asam asetat glasial dan metanol. Asam asetat glasial digunakan untuk fiksasi protein yang berguna untuk mengendapkan dan mengimobilisasi protein sehingga warna yang terbentuk permanen. Selanjutnya penentuan berat molekul masing-masing pita protein dihitung berdasarkan kurva standar marker (Lampiran 8a), yang diperoleh melalui hubungan antara mobilitas relatif (Rf) dengan nilai logaritma berat molekul (Log BM) protein marker. Nilai mobilitas relatif (Rf), logaritma berat molekul (Log BM) dan berat molekul protein standar dapat dilihat pada Tabel 3.
36
Tabel 3 menunjukkan Marker yang digunakan sebagai standar protein terdiri atas protein-protein dengan berat molekul kecil (Low Molecular Weight). Marker (Fermentas) tersebut mengandung tujuh jenis protein standar yang sudah diketahui berat molekulnya, yaitu β-galactosidase (BM: 116 kDa), bovine serum albumin (BM: 66.2 kDa), ovalbumin (BM: 45 kDa), lactate dehydrogenase (BM: 35 kDa), REase BSP 981 (BM: 25 kDa), β-lactoglobulin (BM: 18.4 kDa) dan lysozime (BM: 14.4 kDa).
Tabel 3. Nilai mobilitas relatif (Rf), logaritma berat molekul (Log BM) dan berat molekul protein standar
Pita
ke- Jenis protein
BM (kDa) Log BM Jarak pergerakan (cm) Rf 1 β-galactosidase 116 2.0645 1.81 0.157 2 BSA 66.2 1.8209 3.4 0.296 3 Ovalbumin 45 1.6532 5.41 0.470 4 Lactate dehydrogenase 35 1.5441 6.92 0.602 5 Rease Bsp981 25 1.3979 8.86 0.770 6 β-lactoglobulin 18.4 1.2648 10.47 0.910 7 Lysozyme 14.4 1.1584 10.97 0.954
Analisis data protein standar dilakukan dengan regresi linier, dimana dari hubungan antara logaritma berat molekul (sumbu Y) dan mobilitas relatif (sumbu X) diperoleh persamaan Y= 2.1739-1.0369X dengan R2= 0.9858. Persamaan regresi dari kurva linier standar tersebut digunakan untuk menghitung berat molekul protein-protein yang berhasil dipisahkan dari ekstrak fraksi protein udang jerbung, ikan tongkol dan kerang hijau.
Hasil pemisahan protein sampel secara keseluruhan (Gambar 5) menunjukkan bahwa pita protein yang muncul pada gel elektroforesis memiliki jumlah dan ketebalan yang berbeda-beda. Pita protein yang muncul lebih banyak dan lebih tebal pada fraksi sarkoplasma dibandingkan dengan fraksi miofibril. Terutama terlihat pada fraksi sarkoplasma udang jerbung dan ikan tongkol. Hal ini sesuai dengan uji kadar protein fraksi tersebut, yang menunjukkan bahwa kadar protein fraksi sarkoplasma sampel lebih tinggi dibandingkan dengan kadar protein fraksi miofibril.
Pita-pita protein yang dihasilkan dari elektroforesis kemudian dianalisis densitasnya dengan menggunakan program Image J, sehingga menghasilkan
visualisasi seperti Gambar 6. Pengukuran densitas pita protein bertujuan untuk mengetahui persentase masing-masing pita tersebut. Hasil pembacaan densitas pita marker standar dengan program Image J dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Hasil pembacaan densitas pita marker standar dengan program Image J Puncak kurva yang terlihat pada Gambar 6 menandakan subunit protein dengan bobot molekul tertentu. Lebar kurva menandakan ketebalan pita yang tampak. Dan dengan garis dasar yang sama pada setiap kurva, luas area di bawah kurva yang dibatasi oleh garis dasar dihitung sebagai konsentrasi subunit protein yang terlihat pada pita. Perhitungan konsentrasi subunit merupakan perbandingan luas area masing-masing pita dibagi dengan luas area seluruh pita, sehingga jumlah total seluruh pita adalah 100%. Dari pembacaan densitas pita marker standar diatas, diketahui bahwa konsentrasi terbesar penyusunnya adalah jenis protein ovalbumin (20.36%) dan β-lactoglobulin (21.14%). Data hasil analisis terperinci mengenai berat molekul dan konsentrasi masing-masing subunit dapat dilihat pada Lampiran 8b – 8d. Penjelasan lebih rinci dari masing-masing sampel adalah sebagai berikut:
4.2.1. Ikan Tongkol
Hasil elektroforesis SDS PAGE dari protein ikan tongkol yang terlihat pada Gambar 5 menunjukkan bahwa fraksi sarkoplasma terdiri dari 13 subunit protein penyusun, sedangkan fraksi miofibril terdiri dari 15 subunit protein penyusun. Kisaran berat molekul penyusun fraksi protein sarkoplasma mulai dari 14.65 kDa - 117.06 kDa. Fraksi miofibril tersusun dari protein dengan berat molekul berkisar
38
(b) (a)
dari 14.62 kDa - 107.28 kDa. Penelitian terhadap pola elektroforesis protein ikan sardine dan ikan mackerel (Hashimoto et al. 1979) menunjukkan bahwa fraksi miofibril terdiri dari beberapa pita protein yang sesuai dengan myosin heavy chain (MHC), aktin, troponin dan tropomiosin. Fraksi sarkoplasma utamanya terdiri dari mioglobin, albumin dan beberapa enzim yang terkait dengan metabolisme penghasil energi seperti kreatinin kinase, aldolase dan gliseraldehid-3-phospat (Ladrat et al. 2003). Gambar 7 memperlihatkan densitas pita-pita elektroforesis hasil pemisahan fraksi protein sarkoplasma dan miofibril ikan tongkol dengan menggunakan program Image J, sedangkan perhitungan konsentrasi masing- masing subunit protein dapat dilihat pada Lampiran 8b.
.
Gambar 7. Hasil pembacaan densitas pita protein ikan tongkol dengan program Image J: (a).fraksi sarkoplasma; (b). fraksi miofibril.
Gambar 7(a) memperlihatkan pita protein yang dominan pada fraksi protein sarkoplasma adalah pita ke-4, 5, 7, 8, 9 dan ke 13 yang memiliki berat molekul berturut-turut adalah 63.19 kDa, 54.41 kDa, 39.85 kDa, 36.6 kDa, 28.89 kDa dan 14.65 kDa. Sesuai dengan penelitian Ladrat et.al (2003), pita protein dengan berat molekul 39.85 kDa dan 54.41 kDa diperkirakan sebagai kreatinin kinase dan aldolase, sedangkan komponen 36.6. kDa sebagai gliseraldehid-3-phospate dehidrogenase. Protein dengan berat molekul sekitar 14 kDa diidentifikasi sebagai parvalbumin.
Gambar 7(b) menunjukkan fraksi protein miofibril ikan tongkol memiliki 4 pita protein yang dominan yaitu pita ke-5, 10, 11 dan ke-15 dengan berat molekul 69.95 kDa, 40.94 kDa, 38.63 kDa dan 14.62 kDa. Dengan membandingkan berat
(a) (b)
molekul, komposisi protein penyusun fraksi miofibril dapat diidentifikasi. Komponen myosin heavy chain (MHC, ~200 kDa) dalam elektroforesis fraksi miofibril ini tidak terdeteksi. Komponen dengan berat molekul 40.94 kDa diidentifikasi sebagai aktin. Miosin dan aktin merupakan protein utama yang mendominasi fraksi miofibril (Hashimoto et al. 1979). Pita protein dengan berat molekul 14.62 kDa diidentifikasi sebagai myosin light chain, sedangkan pita dengan berat molekul 38.63 kDa diperkirakan sebagai tropomiosin (Ladrat et al. 2003).
4.2.2. Kerang Hijau
Berdasarkan hasil pemisahan protein, diketahui bahwa fraksi sarkoplasma kerang hijau terdiri dari 11 komponen penyusun, yaitu dengan berat molekul berkisar 14.5 kDa – 92.5 kDa. Fraksi protein miofibril terdiri dari 5 komponen yang memiliki berat molekul berkisar dari 15.18 kDa – 136.21 kDa. Gambar 9 memperlihatkan hasil pembacaan densitas pita protein kerang hijau dengan program Image J, sedangkan perhitungan konsentrasi masing-masing subunit protein dapat dilihat pada Lampiran 8c.
Gambar 8. Hasil pembacaan densitas pita protein kerang hijau dengan program Image J: (a).fraksi sarkoplasma; (b). fraksi miofibril.
Dari Gambar 8 dapat dilihat bahwa terdapat empat subunit protein yang dominan penyusun fraksi sarkoplasma kerang hijau adalah protein dengan berat molekul 33.85 kDa, 39.56 kDa, 50.87 kDa dan 59.45 kDa. Lima komponen penyusun fraksi miofibril terdapat 2 subunit protein yang dominan yaitu dengan berat molekul 136.21 kDa dan 93.51 kDa yang diidentifikasi sebagai MHC dan
40
paramiosin. Pita paramiosin menyusun sekitar 14% fraksi miofibril dari protein otot kerang-kerangan (Thanonkaew et al. 2006). Penelitian elektroforesis SDS- PAGE terhadap protein kerang Crasosstrea gigas memperlihatkan band protein yang memiliki berat molekul berkisar dari 19 kDa – 233 kDa (Romero et al. 2004).
Pita protein yang muncul lebih banyak dan lebih tebal pada fraksi sarkoplasma dibandingkan dengan pita protein yang muncul pada fraksi miofibril kerang hijau. Pita dominan yang muncul tersebut menunjukkan protein penyusun fraksi sarkoplasma memiliki konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan protein penyusun fraksi miofibril. Perbedaan komposisi protein disebabkan karena perbedaan sifat dan karakteristik dari masing-masing fraksi tersebut. Paredi et al. (1998) melakukan karakterisasi protein SDS-PAGE dari kerang jenis Aulacomya ater ater (Molina) yang menunjukkan bahwa protein miofbril terdiri dari MHC, paramiosin, aktin, troponin dan myosin light chain dengan berat molekul masing- masing adalah 200, 110, 42, 37 dan 17 kDa.
4.2.3. Udang Jerbung
Hasil elektroforesis protein sarkoplasma dan protein miofibril udang jerbung yang terlihat pada Gambar 6 memperlihatkan adanya pita-pita yang merupakan protein-protein penyusun masing-masing fraksi tersebut. Dari hasil pemisahan protein sarkoplasma udang jerbung terdiri dari 22 komponen penyusun, yaitu dengan berat molekul berkisar 14.87 kDa – 143.77 kDa. Fraksi protein miofibril udang jerbung terdiri dari 17 komponen, dengan berat molekul berkisar dari 15.18 kDa – 107.48 kDa.
Fraksi protein sarkoplasma udang jerbung memiliki jumlah komponen yang lebih banyak dibandingkan dengan fraksi miofibril. Dari 22 komponen penyusun fraksi protein sarkoplasma udang jerbung, diketahui terdapat 4 komponen protein yang dominan. Fraksi protein miofibril udang jerbung memiliki 3 protein yang dominan. Hal ini dapat dilihat dari hasil analisis gel dengan program Image J, ditunjukkan pada Gambar 9.
(a) (b)
Gambar 9. Hasil pembacaan densitas pita protein udang jerbung dengan program Image J:(a).fraksi sarkoplasma; (b). fraksi miofibril.
Gambar 9 menunjukkan persentase pita protein penyusun fraksi sarkoplasma dan miofibril udang jerbung. Empat protein dominan yang menyusun fraksi sarkoplasma udang jerbung terlihat dengan persentase yang lebih besar yaitu pita protein ke-19, 12, 10 dan ke-4 dengan berat molekul berturut-turut 19.2 kDa, 45.47 kDa, 56.91 kDa dan 91.4 kDa. Persentase masing-masing subunit penyusun fraksi protein sarkoplasma dan miofibril udang jerbung secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 8d.
Pita protein dengan berat molekul 91.4 dan 45.47 kDa diidentifikasi sebagai phosporilase dan kreatinin kinase. Ayuso et al. (2009) melakukan karakterisasi protein udang dengan SDS-PAGE dan uji alergenisitas dengan ELISA. Hasil menunjukkan bahwa protein dengan berat molekul ~20 kDa ditemukan sebagai alergen baru dari udang, yang diidentifikasi sebagai SCP (sarcoplasmic calcium- binding protein).
Pola elektroforesis dari fraksi miofibril udang jerbung menunjukkan 3 subunit protein yang dominan yaitu pita ke-2, ke-8 dan ke-17 dengan berat molekul masing-masing adalah 100.77 kDa, 38.19 kDa dan 15.18 kDa. Komponen dengan berat molekul berkisar 100.77 kDa diperkirakan sebagai paramiosin. Pita protein dengan berat molekul 38.19 kDa dianggap sebagai tropomiosin. Sahabudin et al. (2011) melakukan uji ELISA dan imunoblotting protein udang menggunakan serum subyek penderita alergi. Hasil uji menunjukkan bahwa tropomiosin merupakan suatu komponen protein miofibril
42
yang terdiri dari 2 subunit dengan berat molekul 34-38 kDa yang dilaporkan sebagai alergen utama dalam spesies udang. Komponen myosin light chain diidentifikasi pada pita protein ke-17 dengan berat molekul 15.18 kDa.
Pita dengan ketebalan (densitas) dominan menunjukkan bahwa protein dengan berat molekul tersebut memiliki konsentrasi yang lebih tinggi dibanding protein lainnya. Protein dengan berat molekul tertentu yang memiliki konsentrasi tinggi akan lebih banyak mengikat pewarna bromfenol biru. Kompleks yang terbentuk ini akan bergerak melalui pori-pori gel dan ketika ukuran molekul lebih besar dari ukuran pori, protein akan terperangkap dalam pori gel. Konsentrasi protein yang tinggi akan membentuk pita protein yang lebih tebal dan lebih dominan dibanding pita protein yang lain.