HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Keragaman Gen FSH Sub-unit Beta Pada Sapi Bali Metode PCR-SSCP Amplifikasi Ruas Gen FSH sub-unit beta Amplifikasi Ruas Gen FSH sub-unit beta
Panjang produk amplifikasi ruas gen FSH sub-unit beta sebagian intron 2 dan bagian penuh ekson 3 adalah 313 bp Gambar 22.
Ket : M = Marker : ladder 100 bp, 1 – 16 = sampel
Gambar 22. Produk PCR gen FSH sub-unit beta dengan panjang fragmen 313 bp.
300 bp 500 bp 200 bp 313 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 A b n o rmal ita s S p e rma ( % ) 1.0 0.5 2.0 3.0 1.5 2.5
Bos javanicus Bos indicus Bos taurus
0.39
0.94
2.97
Amplifikasi ruas gen FSH sub-unit beta berhasil sepanjang 313 bp menggunakan sepasang primer sesuai dengan hasil penelitian Dai et al. (2009). Kondisi PCR yang digunakan pada mesin thermocycler, menggunakan suhu denaturasi awal 94oC selama 5 menit, denaturasi 94oC, penempelan primer atau
annealing 63oC selama 45 detik, penempelan DNA baru pada suhu 72oC selama 1 menit, dan suhu 72oC pemanjangan akhir selama 5 menit.
Keterangan a : hasil elektroforesis, b : hasil rekonstruksi Gambar 23 Visualisasi SSCP ruas gen FSH sub-unit beta.
Produk PCR gen FSH sub-unit beta yang dianalisis dengan metode SSCP menghasilkan tiga macam genotipe disajikan pada Gambar 23 yaitu BB yang tervisualisasi dengan satu pita, genotipe AB dengan tiga pita sedang genotipe AA tervisualisasi dengan dua pita. Hasil penelitian ini berbeda dengan Dai et al. (2009) menggunakan metode PCR-SSCP menemukan empat varian genotipe yaitu BB, AB, AA dan BC. Liang et al. (2006) melaporkan bahwa homologi gen FSH sub-unit beta antara sapi dan kambing 98 %. Penelitiannya menggunakan PCR-SSCP yang diasosiasikan dengan sifat prolifik pada kambing Lioning Cashmere,
Grey goats menemukan tiga varian genotipe (AA, AC dan CC), namun pada kambing Angora ditemukan enam varian genotipe yaitu AA, BB, CC, AB, AC dan BC. Hasil genotipe pada bangsa sapi yang dianalisis menunjukkan sapi Bali (Bos javanicus) tidak ada varian, hal ini menunjukkan bahwa gen ini bersifat monomorfik menjadi salah satu bukti bahwa sapi sapi lokal telah beradaptasi dengan lingkungan. Grigorova et al. (2007) menyatakan bahwa gen FSH sub-unit beta pada mamalia mempunyai struktur dan fungsi untuk menyeimbangkan seleksi demikian pula pada sapi (Kim et al. 1988), sehingga kestabilan runutan nukleotidanya pada kondisi sudah beradaptasi sangat stabil dan jarang mengalami
AB BB AA AB BB AA AB a AA AB BB AA AB BB AB b
mutasi. Berbeda pada sapi Brahman (Bos indicus), FH, Limousin dan Simmental (Bos taurus) yang sudah mengalami seleksi buatan dan yang telah mengalami perkawinan silang. Hasil ini sesuai dengan Wimmer et al. (2005) menemukan hal yang sama pada babi lokal (indegenus breed) di China bahwa gen FSH sub-unit beta tidak ada varian atau monomorfik, selanjutnya Lamminen et al. (2005) meneliti dan mendapat hasil yang sama pada manusia.
Frekuensi Alel dan Genotipe Gen FSH sub-unit beta
Frekuensi alel dan genotipe gen FSH sub-unit beta disajikan pada Tabel 5, pada sapi Bali (Bos sondaicus) hanya ditemukan alel B (1.000) dan genotipe BB (1.000). Hasil tersebut berbeda pada sapi Brahman (Bos indicus), sapi FH, Simmental dan Limosin (Bos taurus) bersifat polimorfik. Hal ini ditunjukkan adanya keragaman yaitu alel A dan B, demikian pula dengan beragamnya genotipe yaitu AA, AB dan BB. Dai et al. (2009) telah meneliti ruas gen FSH sub-unit beta pada sapi jantan di berbagai pusat inseminasi buatan di Amerika menemukan keragaman gen pada sebagian intron 2 dan bagian penuh ekson 3 yang diasosiasikan dengan kualitas sperma cair dan sperma beku, ditemukan 3 alel yaitu alel A, B dan C, 3 genotipe yaitu AB, BB dan BC.
Tabel 5 Frekuensi alel dan genotipe gen FSH sub-unit beta PCR-SSCP
Populasi FSH sub-unit beta Alel Genotipe A B AA AB BB Bali 0.000 1.000 0.000 (0) 0.000 (0) 1.000 (110) Brahman 0.372 0.628 0.270 (20) 0.203 (15) 0.527 (39) FH 0.645 0.355 0.530 (44) 0.229 (19) 0.241 (20) Simmental 0.491 0.581 0.233 (10) 0.372 (16) 0.395 (17) Limosin 0.466 0.534 0.318 (14) 0.295 (13) 0.386 (17) Gabungan Bos javanicus 0.000 1.000 0.000 (0) 0.000 (0) 1.000 (110) Bos indicus 0.372 0.628 0.270 (20) 0.203 (15) 0.527 (39) Bos taurus 0.830 0.170 0.761 (68) 0.136 (48) 0.102 (54)
Hormon FSH sub-unit beta berperan secara khusus dalam reproduksi mamalia (Mellink et al. 1995) utamanya proses spermatogenesis pada jantan (Dai
et al. 2009: Dai et al. 2011) dan laju ovulasi (ovulation rate) pada betina (Lenville
et al. 2001), bahkan polimorfisme gen FSH sub-unit beta berpengaruh terhadap kualitas sperma dan ovulasi seperti yang dilaporkan oleh (Kossakowska et al. 2003; Lui & Lee 2009; Humpolicek et al. 2009 )
Proses fisiologis hormon FSH sub-unit beta dalam pengaruhnya pada proses spermatogenesis telah dibuktikan oleh Ji et al. (1995). Dalam penelitian tersebut dinyatakan bahwa sel-sel Sertoli tidak mampu menginduksi perkembangan primary spermatocyte menjadi round spermatids kalau level hormon FSH tidak mencapai level tertentu. Hasil penelitian ini sesuai dengan Dai
et al. (2009) bahwa sapi jantan yang bergenotipe AB dan BB mempunyai level hormon FSH dalam darah relatif lebih tinggi dibanding dengan sapi jantan yang bergenotipe AA. Selanjutnya McLachlan et al. (1996) meneliti mekanisme aksi fisiologis hormon FSH dan testosteron pada proses spermatogenesis pada hewan percobaan (tikus, mencit, hamster dan kelinci) melaporkan bahwa hormon FSH berperan juga dalam perkembangan testis sebelum dan sesudah kelahiran, dan pada saat dewasa kelamin FSH berperan dalam pemeliharaan spermatozoa di dalam tubuli seminiferi.
Frekuensi alel A yang ditemukan pada penelitian ini tertinggi pada sapi FH (0,645), terendah ditemukan pada sapi Bali (0.000). Alel B ditemukan paling tinggi pada sapi Bali (1.000) sedang terendah ditemukan pada sapi FH (0.533). Nei dan Kumar (2000) menyatakan bahwa heterozygositas merupakan persentase heterozygot tiap individu atau rataan persentase individu heterozygot dalam populasi.
Nilai Heterozigositas
Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) disajikan pada Tabel 6. Nilai heterozigositas sangat penting untuk menganalisis polimorfisme dalam suatu populasi (Noor 2008). Pendugaan nilai heterozigositas pengamatan dan harapan dihitung untuk mendapatkan keragaman genetik atau
pada ternak yang akan digunakan sebagai sumber genetik pada generasi berikutnya (Noor 2008; Marson et al. 2005).
Analisis nilai heterozygositas gen FSH sub-unit beta menggunakan metode PCR-SSCP menunjukkan bahwa heterozigositas pengamatan tertinggi pada sapi Simmental (0.372) dan terendah pada sapi Bali (0.000). Nilai chi-squre atau X2
gen FSH sub-unit beta menunjukkan bahwa pada sapi Brahman, FH dan Limousin
terjadi ketidakseimbangan Hardy-Weimberg. Ketidakseimbangan
Hardy-Weimberg biasanya terjadi pada populasi yang terseleksi, terjadi mutasi dan migrasi dan genetic drift (Falconer & Mackay 1996 dan Noor 2008).
Tabel 6 Nilai heterozigositas gen FSH sub-unit beta
Populasi Gen FSH sub-unit beta
n H o H e x2 PIC Bali 110 0.000 0.000 - - Brahman 74 0.203 0.467 23.70 ** 0.358 FH 83 0.229 0.458 20.78 ** 0.358 Simmental 43 0.372 0.487 2.39 tn 0.368 Limousin 44 0.295 0.498 7.26 ** 0.374 Gabungan Bos javanicus 110 0.000 0.000 - - Bos indicus 74 0.203 0.287 23.70 ** 0.358 Bos taurus 170 0.282 0.497 31.64 ** 0.373 Ket : tn =tidak berbeda nyata (p < 0.05), * = berbeda nyata, ** = berbeda sangat nyata
Sampel sapi Brahman berasal ranch PT BULI Sulawesi Selatan merupakan tempat pemeliharaan sapi yang terseleksi, demikian pula sampel dari BIB dan BIBD merupakan sampel yang terseleksi sebelumnya. Demikian pula sapi FH dan Limousin yang berasal dari Balai Inseminasi Buatan Nasional / Daerah.
Tingkat Abnormalitas Sperma pada Genotipe yang Berbeda
Abnormalitas sperma menurut Chenoweth (2005) dan Frenau et al. (2009) terbagi menjadi abnormalitas mayor (15 jenis) dan abnormalitas minor (16 jenis), namun yang diketahui faktor genetik adalah abaxial (abormalitas pada bagian
ekor), round head, microchepalus, macrochepalus, knobbed acrosome defect
(abnormalitas pada bagian kepala).
Tingkat persentase abnormalitas sperma pada genotipe yang berbeda disajikan pada Gambar 24. Berdasarkan hasil analisis genotipe dengan metode PCR-SSCP bahwa pada genotipe AA ditemukan microchepalus merupakan tipe yang paling tinggi, paling rendah tipe macrochepalus. Abnormalitas tipe abaxial
ditemukan paling tinggi pada genotipe AB dan paling rendah tipe macrochepalus, sedang pada genotipe BB juga ditemukan tipe abaxial paling tinggi dan diikuti
knobbed acrosome defect tetapi tipe round head ditemukan paling rendah. Persentase tipe abnormalitas sperma yang disebabkan oleh faktor genetik dari hasil penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan hasil penelitian Arifiantini
et al. (2010) bahwa pada sapi potong termasuk sapi Bali masing masing adalah
abaxial 0.01- 0.02%, macrochepalus 0 – 0.03%, microchepalus 0.01 - 0.02% ,
round head 0 – 0.01% dan knobbed acrosome defect adalah 0.01 – 0.15%.
Gambar 24 Abnormal sperma pada genotipe yang berbeda gen FSH sub-unit beta berdasarkan PCR-SSCP.
Knobbed acrosome defect merupakan abnormalitas faktor genetik yang mayor, sehingga dapat menurunkan fertilitas. Pada penelitian ini menggunakan metode PCR-SSCP ternyata genotype BB juga menunjukkan jumlah persentasi abnormalitas tinggi yaitu abaxial. Abnormalitas sperma akan mempengaruhi fertilitas jika jumlahnya melebihi 20% dari total sperma (Garner & Hafez 2000).
0.56 0.28 0.95 0.34 0.84 0.72 0.12 0.66 0.42 0.30 1.09 0.57 0.62 0.26 1.04 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20
Abaxial Macrochepalus Microchepalus Round Head Knobbed acrosome defect Ab n o rm ali tas sp erm a (% ) AA BB AB 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00
Dalam penelitian ini ternyata secara umum sapi Bali mempunyai jumlah abnormalitas yang paling rendah dibandingkan jenis sapi lainnya (Gambar 25)
Abnormalitas sperma pada Bos javanicus lebih rendah hanya 0.39 % dan jika dibandingkan dengan Bos indicus 0.35 % dan Bos taurus yang mencapai 4.96% (Gambar 25). Hasil ini hampir sama dengan yang dilaporkan Arifiantini et al. (2010) bahwa tingkat abnormalitas primer sperma pada Bos javanicus hanya 1.8% lebih rendah jika dibandingkan dengan Bos indicus 2.6% dan Bos taurus
4.2%. Rendahnya nilai abnormalitas pada Bos javanicus atau sapi bali ini juga memperkuat laporan Arifiantini et al. (2006b), sebelumnya dimana abnormalitas sperma dari sapi Bali yang terdapat balai IB Baturiti hanya 2.7%, sehingga membuktikan bahwa sapi Bali sudah beradaptasi dengan baik terutama pada suhu dan lingkungan tropis, serta rendahnya kandungan nutrisi pada pakan.
Gambar 25 Abnormal sperma pada bangsa sapi yang berbeda gen FSH sub-unit beta berdasarkan PCR-SSCP
C. Keragaman Gen FSH Reseptor pada Sapi Bali Metode PCR-RFLP