DAFTAR PUSTAKA
D. Keragaman Gen GH Pada Sapi Bali Metode PCR-RFLP Amplifikasi Gen GH
Pengembangan penanda molekuler untuk kualitas sperma sangat penting terutama untuk mendukung penerapan teknologi IB dalam rangka peningkatan populasi sapi. Pemeriksaan kualitas semen termasuk abnormalitas sperma pada sapi jantan sangat penting karena akan meningkatkan kualitas semen yang dibekukan dan didistribusikan dalam program IB. Pengujian pejantan dengan sistem BSE akan meningkatkan akurasi seleksi pejantan sebelum masuk di balai IB sehingga hanya semen yang berkualitas yang akan dibekukan dan didistribusikan sehingga secara langsung meningkatkan angka konsepsi (Chenoweth 2011) dan menurunkan service per conception (S/C).
D. Keragaman Gen GH Pada Sapi Bali Metode PCR-RFLP Amplifikasi Gen GH
Kondisi mesin thermocycler pada amplifikasi gen GH adalah denaturasi awal 94oC selama 5 menit, denaturasi 94oC, suhu annealing 62oC selama 45 detik, suhu pemanjangan DNA baru 72oC dan suhu pemanjangan akhir 72oC (Gambar 30). Kondisi ini berbeda dengan Jakaria et al. (2007) menggunakan suhu annealing 53oC, Mitra et al. (1995) menggunakan suhu annealing 60 oC selama 45 detik. A b n o rmal ita s S p e rma ( % ) 0.5 0.0 1.0 2.0 1.5 3.0 2.5 4.0 5.0 0.39 1.9 4.06
Ket : M = Marker : ladder 100 bp, 1 – 16 = sampel
Gambar 30 Produk PCR gen GH dengan panjang fragmen327 bp
Produk PCR gen GH (327 bp) yang telah dipotong dengan enzim MspI (Gambar 31) setelah dielektroforesis menggunakan agarose 2% diperoleh hasil bahwa terdapat tiga macam fragmen hasil potongan gen GH pada setiap individu yaitu fragmen yang terpotong (dua pita) dikenal dengan genotipe AA, tidak terpotong (satu pita) genotipe BB dan fragmen gabungan (tiga pita) yang disebut genotipe AB.
Ket : M = Marker : ladder 100 bp, AA, BB dan AB = hasil genotyping
Gambar 31 Visualisasi hasil RFLP gen GH menggunakan enzim restriksi Msp1 Pada penelitian ini variasi fragmen gen GH situs Msp1 hanya terdapat pada sapi Brahman, FH, Simmental dan Limousin, namun tidak dijumpai pada sapi Bali. Pada semua sampel sapi Bali yang dianalisis hanya ditemukan genotipe BB. 500 bp 300 bp 200 bp 327 bp 222 bp 105 bp M BB BB BB BB BB BB AB AB AB AB AB AB AB AA AA AA 500 bp 200 bp 300 bp 327 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Frekuensi Alel dan Genotipe Gen GH
Frekuensi alel A tertinggi ditemukan pada sapi Brahman (0.746) dan terendah pada sapi Bali (0.000), frekuensi alel B tertinggi pada sapi Bali (1.000) dan paling rendah pada sapi FH (0.402). Hasil penelitian ini sesuai dengan Jakaria et al. (2007) yang hanya menemukan alel B pada sapi Bali atau monomorfik. Keragaman frekuensi alel dan genotipe fragmen gen GH disajikan pada Tabel 9.
Pada Tabel 9 menunjukkan proporsi alel dan genotipe gen GH pada sapi Bali maupun sapi Brahman, FH, Simmental dan Limousin. Pada sapi Bali proporsi alel B dan genotipe BB lebih tinggi dibanding dengan bangsa sapi lain yang dianalisis. Jakaria et al. (2007) menyatakan bahwa alel B dan genotipe BB lebih dominan pada sapi Bali dan sapi Pesisir dibandingkan dengan sapi kelompok Bos taurus (Limousin dan Simmental).
Tabel 9 Frekuensi alel dan genotipe gen GH
Populasi Gen GH Alel Genotipe A B AA AB BB Bali 0.000 1.000 0.000 (0) 0.000 (0) 1.000 (225) Brahman 0.746 0.254 0.594 (41) 0.304 (21) 0.101 (7) FH 0.402 0.598 0.239 (22) 0.326 (30) 0.435 (40) Simmental 0.625 0.375 0.089 (20) 0.089 (20) 0.036 (8) Limousin 0.727 0.273 0.545 (12) 0.364 (16) 0.091 (4) Gabungan Bos javanicus 0.000 1.000 0.000 (0) 0.000 (0) 1.000 (225) Bos indicus 0.746 0.254 0.594 (41) 0.304 (21) 0.101 (7) Bos taurus 0.506 0.494 0.314 (54) 0.384 (66) 0.302 (52)
Ket: angka di dalam kurung ( ) = jumlah individu
Pada sapi FH di Iran juga dtemukan dominasi alel B ) dan genotipe BB (-/-) (Mohammadabadi et al. 2010). Selanjutnya Zakizadeh et al. (2006) meneliti gen GHMspI pada 3 bangsa sapi lokal (Mazandrani, Sarabi dan Golpaygani) di Iran menyatakan bahwa proporsi alel A dan B hampir sama, demikian pula pada genotipenya. Yardibi et al. (2009) meneliti keragaman gen GH pada sapi Red Anatolian menemukan hal yang berbeda. Pada penelitian tersebut ditemukan proporsi alel A dan genotipe AA yang lebih tinggi.
Lagziel et al. (2000) menyatakan bahwa ada fenomena proporsi alel dan genotipe gen GH pada bangsa sapi di dunia. Proporsi alel B yang tinggi dan genotipe BB umumnya ditemukan pada kelompok sapi berpunuk (humped). Sapi berpunuk umumnya termasuk pada Bos indicus, sedang proporsi alel A yang tinggi dan genotipe AA ditemukan pada sapi yang tidak berpunuk (humpless) yang umumnya sapi Eropa Bos taurus. Ditemukannya proporsi alel B, genotipe BB yang tinggi pada sapi Bali merupakan informasi baru pada sebaran alel dan genotipe gen GH serta dapat dijadikan sebagai penciri pada sapi Bali bahwa gen GH di situs MspI intron 3 ekson 4.
Nilai Heterozigositas
Hasil analisis herozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) gen GH disajikan pada Tabel 10. Pada gen GH hasil analisis nilai heterozygositas menunjukkan bahwa heterozigositas pengamatan tertinggi pada sapi Simmental (0.500) dan terendah sapi Bali (0.000). Hasil peneltian ini sesuai dengan Jakaria et al. (2007) menemukan nilai heterozigositas pengamatan (0.000) pada sapi Bali.
Tabel 10 Nilai heterozigositas harapan gen GH
Populasi n Gen GH H o H e x2 PIC Bali 225 0.000 0.000 - - Brahman 69 0.304 0.379 2.64 tn 0.307 FH 92 0.326 0.481 9.53 * 0.365 Simmental 48 0.500 0.469 0.59 tn 0.359 Limousin 32 0.364 0.397 0.31tn 0.359 Gabungan Bos javanicus 225 0.000 0.000 - - Bos indicus 69 0.304 0.379 2.64 tn 0.307 Bos taurus 172 0.348 0.500 4.54 ** 0.375
Tingkat Abnormalitas Sperma pada Genotipe yang Berbeda
Pada genotipe AA, persentase tipe round head ditemukan paling tinggi, diikuti oleh tipe abaxial dan microcephalus, dan terendah ditemukan pada macrocephalus. Tipe knobbed acrosom defect ditemukan paling tinggi pada genotipe BB, kemudian tipe abaxial dan microcephalus, sedang terendah ditemukan tipe round head. Tipe abaxial ditemukan paling tinggi pada genotipe AB, kemudian microcephalus dan round head, sedang tipe abnormalitas terendah ditemukan pada tipe microcephalus. Hasil pengamatan tingkat abnormalitas sperma pada genotipe gen GH yang berbeda disajikan pada Gambar 32.
Gambar 32 Abnormalitas sperma pada genotipe yang berbeda
gen GH berdasarkan PCR-RFLP.
Hasil analisis gabungan menunjukkan persentase abnormalitas sperma Bos javanicus lebih rendah hanya 0.39%, diikuti oleh Bos indicus 2.12% dan paling tinggi pada Bos taurus sebesar 4.19% (Gambar 33). Hasil penelitian ini sesuai Arifiantini et al. (2010) bahwa persentase abnormalitas sapi Bali (Bos javanicus), lebih rendah jika dibandingkan dengan sapi Brahman (Bos indicus), sapi Limousin dan Simmental (Bos taurus). Purwantara et al. (2012) juga melaporkan pada sapi FH (Bos taurus) abnormalitas primer bervariasi antara 1.00 % sampai dengan 8.40% bergantung pada lokasi pemeliharaan dan managemen.
1.33 0.52 1.33 1.40 1.11 1.38 0.92 1.19 0.46 1.93 1.01 0.33 0.44 0.39 0.28 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
Abaxial Macro chepalus Micro chepalus Round head Knobbed acrosome defect A b n o rmal itas S p e rma ( % ) 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 AA BB AB
Gambar 33 Abnormalitassperma pada bangsa sapi yang berbeda pada gen GH
PEMBAHASAN UMUM
Pada tahun 2007 terjadi peningkatan konsumsi daging sapi dari 1.95 kg per kapita per tahun menjadi 2 kg per kapita per tahun tahun 2008, dan tahun berikutnya meningkat 2.24 kg per kapita per tahun. Meningkatnya konsumsi berdampak terhadap meningkatnya kebutuhan daging dan jeroan dari dari 455.755 ton pada tahun 2008 menjadi 516.603 ton pada tahun 2009 (BPS 2009). Jumlah tersebut setara dengan jumlah sapi sebanyak 2.432 juta ekor sapi pada tahun 2008 dan 2.746 juta ekor sapi pada tahun 2009. Kebutuhan tersebut dipenuhi melalui impor daging sebesar 110.246 ton serta untuk sapi bakalan sebanyak 768.133 ekor pada tahun 2009. Hal ini dilakukan karena sapi lokal hanya dapat mensuplai kebutuhan daging sebesar 49% dari kebutuhan daging nasional pada tahun 2009 (BPS 2009).
Upaya yang dilakukan untuk mengantisipasi hal tersebut adalah memberi peluang pengembangan sapi lokal. Di Indonesia beberapa sapi lokal seperti Bali, sapi Aceh, sapi Pesisir dan sapi Madura. Total populasi sapi di Indonesia pada tahun 2009 sebesar 12.7 juta ekor. Total tersebut, terdapat 2.6 ekor sapi Bali dan
A b n o rmal ita s S p e rma % 0.5 0.0 1.0 2.0 1.5 3.0 2.5 4.0 5.0 0.39 2.12 4.19
1.961 juta ekor sapi lokal lainnya (sapi Aceh, sapi Pesisir dan sapi Madura) (Martojo 2012). Hal ini membuktikan bahwa posisi sapi lokal dalam memenuhi kebutuhan daging sapi dalam negeri sangat strategis. Peningkatan populasi sapi lokal seperti sapi Bali dilakukan dengan perbaikan sistem kelembagaan, integrasi dengan sistem usahatani tanaman pangan dan perkebunan, perbaikan pakan dan peningkatan reproduktivitas melalui penerapan teknolgi IB. Dari evaluasi pelaksanaan IB sampai tahun 2009 bahwa dari tiga kriteria wilayah pengembangan IB (introduksi, pengembangan dan swadaya) belum mencapai target yang ditentukan.
Sapi Bali yang merupakan sapi asli Indonesia telah dibuktikan oleh Mohamad et al. (2009) bahwa dengan analisis kromosom Y dan mitokondria DNA menunjukkan posisi spesifik sapi Bali dengan sapi lokal lainnya yang ada di Indonesia. Merkens (1926) melaporkan bahwa hasil penelitian taksonomi Schlegel dan Muller pada tahun 1836 membuktikan bahwa sapi Bali merupakan hasil domestikasi dari Banten. Lenstra dan Bradley (1999) mengatakan bahwa Banteng adalah wild progenitor sapi Bali dan telah didomestikasi sekitar 3500 tahun sebelum masehi. Adaptasi sapi Bali berupa perubahan morfologi tubuh dibanding tetuanya untuk mengantisipasi perubahan lingkungan di iklim tropis, serat kasar yang tinggi dan nutrisi rendah pada kandungan pakan, eksternal parasit. Jika dibandingkan dengan Banteng berat jantan dewasa 600 – 800 kg, betina dewasa 600 – 650 kg (Purwantara et al. 2012), sedang pada sapi Bali menurut Talib et al. (2002) saat ini umumnya ditemukan berat jantan dewasa 335 – 365 kg, berat betina dewasa 300 kg. Hasil perbandingan data tersebut bahwa sapi Bali telah mengalami perubahan morfologi tubuh dibanding dengan Banteng sekitar 50 %. Bentuk adaptasi ini merupakan trade of dari sapi Bali bahwa untuk bertahan hidup dan bereproduksi sehingga harus mengubah bentuk tubuhnya lebih kecil dan ramping.
Peningkatan populasi lokal seperti sapi Bali di Indonesia dilakukan dengan penerapan teknologi tepat guna seperti IB. Saat ini beberapa wilayah pengembangan sapi di Indonesia membentuk Balai IB. Sapi Bali jantan yang digunakan hanya diseleksi berdasarkan fenotipe dan tidak dilakukan BSE secara keseluruhan. Bebagai uji kualitas semen dilakukan dalam BSE, diantaranya
konsentrasi, motilitas dan morfologi sperma. Konsentrasi dan motilitas telah dilakukan dengan baik, tetapi morfologi spermatozoa sampai saat ini masih jarang dilakukan.
Pengembangan populasi sapi Bali ke depan sebaiknya dilakukan seleksi berdasarkan nilai pemuliaan (breeding value), penggunaan penciri genetik terutama yang mengontrol reproduksi dan penerapan BSE sehingga sapi jantan yang akan ditempatkan di balai IB dapat dipertanggungjawabkan kualitasnya, karena jantan tersebut akan menyebarkan sifat sifat unggul ke populasi. Pengembangan pengujian pejantan dengan metode BSE telah dilakukan di negara maju (Bellin et al. 1999; Hopkins 2005; Godfrey & Dodson 2005; Chenoweth 2011; Escriche & Recio 2011), serta penciri genetik untuk kualitas semen (Lechniak et al. 1998; Dai et al. 2009; Gorbani et al. 2009b; Afshar et al. 2011 dan Chenoweth 2011).
Keberhasilan IB, ditentukan oleh berbagai faktor diantaranya oleh kualitas semen beku yang dihasilkan. Semen beku yang dikualitas akan diperoleh jika semen segar yang diejakulasikan oleh seekor jantan yang telah terseleksi sebelumnya. Kombinasi penerapan BSE dan penciri genetik pada seleksi sapi Bali jantan untuk program IB maupun jantan yang akan dipertahankan di dalam populasi akan meningkatkan kualitas genetiknya. Hal ini disebabkan jantan yang sudah terseleksi akan menyebarkan sifat-sifat unggul ke populasi. Martinez (2012) melaporkan bahwa penggunaan jantan terseleksi pada program IB akan meningkatkan kualitas genetiknya sebesar 50 %. Selanjutnya Menegassi et al. (2011) melaporkan bahwa dengan penerapan BSE pada program IB akan meningkatkan efisiensi ekonomi.
Pada penelitian ini amplifikasi gen FSH sub-unit beta menggunakan metode RFLP, SSCP, gen FSH reseptor menggunakan metode PCR-RFLP dan gen GH menggunakan metode PCR-PCR-RFLP menunjukkan bahwa sapi Bali bersifat monomorfik. Walaupun sapi Bali monomorfik dari semua gen yang diamplifikasi, namun abnormalitas spermatozoa pada sapi Bali lebih rendah dibanding sapi lain yang dianalisis. Persentase abnormalitas spermatozoa sapi Bali pada penelitian ini adalah abaxial (0.48%), microcephalus (0.24%), macrocephalus (0.24%), round head (0.0%), knobbed acrosom defect (0.19%).
Hasil penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan hasil penelitian dari Arifiantini et al. (2006a), yang mendapatkan nilai abaxial (0.25%), microcephalus (0.52%), macrocephalus (0.3%), round head (0.0%) dan knobbed acrosom defect (0.2%). Hal tersebut dapat dipahami mengingat sample yang digunakan Arifiantini et al. (2006b), hanya berasal dari UPTD Baturiti yang memang merupakan BIBD khusus sapi Bali, sedangkan sampel spermatozoa pada penelitian ini berasal dari berbagai balai IB di Indonesia yang mempunyai lingkungan dan manajemen yang berbeda.
Gambar 34 Tipe abnormalitas sperma (Williams stains 1000x magnification)
Abnormalitas sperma tipe round head Abnormalitas sperma tipe Knobbed acrosome defect
Abnormalitas sperma tipe microcephalus Abnormalitas sperma tipe macrocephalus
Berdasarkan SNI produksi semen beku Indonesia No 01-4869.1-2005 mensyaratkan bahwa, persentase abnormalitas sperma yang diizinkan untuk diproduksi menjadi semen beku adalah 20%. Abnormalitas sperma terbagi atas primer dan sekunder. Abnormalitas sekunder adalah kelainan sperma yang umumnya terjadi pada bagian ekor dan mudah diperbaiki untuk dideteksi pada saat pemeriksaan motilitas karena spermatozoa yang mempunyai abnormalitas pada bagian ekor biasanya tidak bergerak progresif (Arifiantini et al. 2010). Abnomalitas primer umumnya terjadi pada bagian kepala, sebagian bersifat genetik dan mempunyai dampak pada fertilitas. Pada penelitian ini abnormalitas primer yang berdampak menurunnya fertilitas adalah knob acrosome defect. Ditemukannya penciri genetik dengan teknik genetika molekuler sehingga didapat beberapa kandidat gen, seperti yang mengontrol kualitas sperma, maka hasil penelitian ini dapat diterapkan di BIB pusat maupun BIB di daerah melalui penambahan satu tahapan yaitu pengujian kualitas sperma.
Penggunaan catatan produksi dan dan silsilah akan menghasilkan beberapa parameter genetik yang diperlukan untuk mengestimasi nilai pemuliaan, seperti performans individu dan kelompok, serta nilai heritabilitas sifat yang akan diseleksi. Seleksi berdasarkan nilai pemuliaan akan menghasilkan keturunan yang dapat diprediksi keunggulannya, dalam jangka panjang seleksi ini akan menghasilkan trend genetik yang semakin meningkat.
Seleksi berdasarkan nilai pemuliaan selanjutnya dapat dikombinasikan melalui tahapan pengujian kualitas sperma berdasarkan hasil penelitian ini. Khusus untuk sapi Bali, tahapan pengujian yang disarankan adalah pengujian polimorfisme gen FSH sub-unit beta dan gen GH, sapi Bali dan harus memiliki genotipe BB dan gen FSH reseptor harus memiliki genotipe GG. Hasil tahapan seleksi tambahan ini diharapkan akan berdampak pada hasil seleksi sapi Bali unggul dengan kualitas reproduksi yang baik (tingkat persentase abnormalitas spermanya rendah).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Hasil keragaman ketiga gen yang dianalisis menunjukkan bahwa sapi Bali bersifat monomorpik, sedang pada sapi FH, Brahman, Limousin dan Simmental bersifat polimorfik. Berdasarkan analisa gabungan abnormalitas sperma menunjukkan bahwa persentase abnormalitas sperma lebih rendah pada Bos javanicus dibandingkan dengan Bos indicus dan Bos taurus.
Saran
Pada penelitian selanjutnya disarankan untuk analisa kandidat gen yang berhubungan dengan reproduksi sapi Bali dan penerapan BSE pada seleksi sapi Bali jantan yang akan ditempatkan di balai IB.
xxv