Penelitian dilakukan bulan Januari 2010 sampai Oktober 2011 yang dibagi dalam dua tahap pertama yaitu tahap pertama berupa pengambilan sampel darah dan sampel semen untuk ekstraksi DNA. Sampel berasal dari BIB / BIBD sebanyak 195 dan 301 sampel berasal dari populasi berasal dari Propinsi Bali, Sulawesi Selatan, Sulawesi Tenggara, Nusa Tenggara Timur dan Nusa Tenggara Barat. Penelitan tahap kedua dilakukan untuk analisis DNA di laboratorium genetika molekuler bagian pemuliaan Fakultas Peternakan IPB, dan analisis sperma di laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Sampel Penelitian
Pada penelitian ini menggunakan beberapa bangsa sapi seperti yang disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Jumlah dan asal sampel yang digunakan
No. Bangsa Sapi Jumlah Asal
1 Bali 28 BIB1 100 Sulsel2 20 NTT2 28 NTB2 49 BPTU Bali2 2 Brahman 8 BIB1 62 Sulsel 3 FH 53 BIB1 42 Sulsel2 4 Simmental 57 BIB1 5 Limousin 49 BIB1 Total 496
Ket : 1 = Sampel darah dan sperma, 2 = sampel darah Isolasi DNA Total
Isolasi DNA dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Molekuler Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Prosedur isolasi DNA menggunakan metode standar fenol-kloroform (Sambrook et al. 1989) dimodifikasi oleh Andreas et al. (2010) sebagai berikut : sebanyak 200 µl sampel darah (EtOH) ditambah DW 1000 µl, guncang menggunakan vortex, didiamkan
selama 5 menit, kemudian sentrifus 6800 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang. Ditambahkan DW 1000 µl, dikocok menggunakan vortex, didiamkan selama 5 menit, disentrifus kembali 6800 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang. Kemudian ditambahkan 200 µl 1 X STE, 20 µl proteinase-K dan 40 µl SDS 10 %. Campuran diinkubasi 55oC selama dua jam sambil dikocok pelan. Molekul DNA dimurnikan dengan metode fenol-kloroform, yaitu dengan menambahkan 40 µl 5 M NaCl dan 400 µl larutan fenol dan kloroform iso amil alkohol (CIAA) kemudian dikocok pada suhu ruang selama dua jam. Molekul DNA yang larut dalam fase air dipisahkan dari fase fenol dengan sentrifus 7000 rpm selama 5 menit, kemudian dipindahkan ke tabung baru dengan volume terukur dan ditambahkan 1/10 X vol DNA 5 M NaCl dan 2 X vol DNA ethanol absolut, molekul DNA diinkubasikan ±12 jam atau minimal 3 jam pada suhu –
20oC. Endapan yang dihasilkan dilakukan pencucian dengan menambahkan 400 µl ethanol 70 % kemudian disentrifus 12000 rpm selama 5 menit, sisa ethanol dibuang dan diendapkan dalam ruang vakum. Endapan DNA disuspensikan dalam 180 µl buffer TE 80 %. Setelah DNA hasil isolasi dimurnikan dan diketahui konsentrasinya, maka dipreparasikan untuk cetakan (template) pada reaksi PCR
Polymerase Chain Reaction
DNA genom sapi digunakan sebagai cetakan (template) dalam reaksi amplifikasi DNA (reaksi PCR), primer sekuens nukleotida gen FSH sub-unit beta
(Forward dan Reverse). Primer yang digunakan untuk FSH sub-unit beta sebagai gen pengontrol produksi / kualitas sperma, merupakan primer yang dirancang dan telah diaplikasikan pada bangsa sapi Bos Indicus dan Bos Taurus (Dai et al.
2009). Total volume reaksi PCR 25 l : campuran larutan yang terdiri dari DNA
Taq Polimerase dan 10X buffer Taq Polimerase (100 mM tris-Cl, pH 8,3; 500mM KCL; 15mM MgCl2; 0,01 % gelatin); dNTP’S mix (dGTO, dATP, dTTP dan
dCTV) (Pharmacia); dan dH2O steril. Sedangkan kondisi reaksi PCR dalam mesin thermocycler dirancang dengan suhu pra-denaturasi 94oC, denaturasi 94oC, annealing 55-64oC, perpanjangan 72oC dan pasca PCR 4oC. Untuk perbanyakan, siklus diulang sebanyak 35 kali.
Tabel 2 Sekuens primer yang digunakan
Primer Sequence An
FSH sub-unit beta 1 F : 5`CTTCCAGACTACTGTAACTCATC‘3 63 R : 5`GTAGGCAGTCAAAGCATCCG‘3
FSH reseptor 2 F : 5`CTGCCTCCCTCAAGGTGCCCCTC‘3 60
R : 5`AGTTCTTGGTCAAATGTCTTAGGGGG‘3
GH 3 F : 5`CCCAGCGGCAAGAATGAGGC‘3 62
R : 5`TGAGGAACTGCAGGGGCCCA‘3
Ket : An = suhu annealing, 1(Dai et al. 2009), 2(Hernandez et al. 2009), 3(Gordon et al. 1983)
4201 agagcgagca gtattcaatc cctgtctcac tttgattaag ctaaacagaa acttccagac
4261 tactgtaact catctgtctc tctctctgtc tcctaaacca ctcaggactt ggtatacagg 4321 gacccagcaa ggcccaatat ccagaaaacg tgtaccttca aggagctggt ctacgagacg 4381 gtgaaagtgc ctggctgtgc tcaccatgca gactccctgt acacgtaccc agtagccact 4441 gaatgtcact gcagcaagtg cgacagcgac agcactgact gcaccgtgag aggcctgggg 4501 cccagctact gctccttcag ggaaatcaaa gaataaagag cagcggatgc tttgagctgc
4561 ctacccttat
Gambar 14 Fragmen gen FSH sub-unit beta didasarkan GenBank (Dai et al. 2009) 1 ctgcctccct caaggtgccc ctcatcactg tgtccaagtc aaagatcctc ctggtcctgt 61 tctaccccat caactcctgt gccaacccct tcctctatgc catcttcacc aagaacttcc 121 gcagggattt cttcattctg ctgagcaagt ttggctgcta tgaagtgcaa gcccagacct 181 ataggtcaga aacctcatcc actgcccaca actttcatcc aaggaatggc cactgccccc 241 cagctcccag ggttactaat ggttccaatt acacccttat ccccctaaga catttagcca
301 agaact
Gambar 15 Fragmen gen FSH reseptor didasarkan GenBank (Hernandez et al. 2009)
1441 cccacgggca agaatgaggc ccagcagaaa tcagtgagtg gcaacctcgg accgagga 1501 gcaggggacc tccttcatcc taagtaggct gccccagctc ccgcaccggc ctggggcggc 1561 cttctccccg aggtggcgga ggttgttgga tggcagtgga ggatgatggt gggcggtggt 1621 ggcaggaggt cctcgggcag aggccgacct tgcagggctg ccccagaccc gcggcaccca 1681 ccgaccaccc acctgccagc aggacttgga gctgcttcgc atctcactgc tcctcatcca 1741 gtcgtggctt gggcccctgc agttcctca
Gambar 16 Fragmen gen GH didasarkan GenBank (Gordon et al. 1983)
Penentuan Genotipe dengan Pendekatan PCR-RFLP
Produk PCR yang diperoleh sebanyak 5 l dicampur dengan 0,5 l enzim
PstI, 0,5 l DW dan 1 l buffer. Campuran sampel tersebut diingkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Genotipe dilakukan dengan pendekatan Restriction Fragment Length Polymorphism yang divisualisasikan pada gel agarose 2% dengan buffer 0,5 TBE (tris borat EDTA) ditambah ethidium bromida (EtBr). Hasil visualisasi menggunakan UV transluminator dan difoto menggunakan gel documentation system (Alpha imager®). Enzim restriksi yang digunakan pada gen FSH sub-unit beta adalah PstI (ctgca|g), FSH reseptor adalah AluI (ag|ct) dan gen GH adalag MspI(c|cgg).
Penentuan Genotipe dengan Pendekatan PCR-SSCP
Produk PCR yang diperoleh dianalisis dengan metode SSCP, kemudian diidentifikasi konformasi DNA untai tunggal (single strand conformational), 12
l produk PCR dicampur dengan 12 l loading dye (98% formamide, 10 mM EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene-cyanol). Denaturasi pada suhu 95oC selama 5 menit, sampel langsung didinginkan dengan es batu selama 3 menit dan diloading pada gel poliacryalmide 8%. Elektroforesis menggunakan Protean II xi cells (Bio-Rad) pada kondisi 200-300 V pada suhu 5oC selama 18 jam pada larutan buffer 0,5x TBE. Setelah elektroforesis, diwarnai dengan metode silver staining (Byun et al. 2009) dan Tegelstrom (1986).
Pembuatan Preparat Ulas Semen Segar
Semen segar yang dikoleksi di balai IB dilarutkan dengan NaCl fisiologis satu banding empat, lalu dibuat preparat ulas tipis pada gelas objek dan dikeringudarakan, disimpan pada boks preparat. Prerapat ulas difiksasi diatas api bunsen, selanjutnya dicuci dalam alkohol absolute selama 4 menit dan dikeringudarakan. Preparat dimasukkan kedalam larutan 0,5% chloramin selama 1-2 menit, untuk menghilangkan mukus dan ulasan terlihat jernih preparat dimasukkan berulang kali. Dicuci dalam distilled water, selanjutnya dalam alkohol 95% dan diwarnai dengan larutan carbofluchin selama 10 menit, kemudian dicuci pada air mengalir dan dikeringkan.
Analisis Sperma
Analisis morfologi sperma dilakukan dengan menghitung jumlah spermatozoa yang normal dan abnormal (pada bagian kepala). Pengamatan dilakukan pada sepuluh lapang pandang atau 500 sel menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 1000X dengan bantuan minyak emersi.
Analisis Data
a. frekuensi alel: Frekuensi alel dihitung berdasarkan Nei (1987)
Keterangan :
xi = Frekuensi alel,
nii = Jumlah genotipe dari alel ke-i, nij = Jumlah alel ke-i terpaut alel ke-j (j≠i) b. Frekuensi Heterozigositas Pengamatan
Keragaman genetik (genetic variability) dilakukan melalui estimasi frekuensi heterozigositas pengamatan (Ho), heterozigositas harapan (He) dan standar eror heterozigositas harapan (Weir 1996) :
Keterangan :
Ho = frekuensi heterozigositas pengamatan,
N1ij = jumlah individu heterozigositas pada lokus ke-1, N = jumlah individu yang dianalisis
c. Frekuensi Heterozigositas Harapan
Frekuensi heterozigositas harapan dihitung berdasarkan Nei (1987)
Keterangan :
Ho = frekuensi heterozigositas harapan P1i = frekuensi alel ke-I pada lokus 1 n = jumlah alel pada lokus ke-1
Ragam heterosigositas harapan dihitung berdasarkan Nei (1987)
Keterangan :
Vsl (He) = ragam heterozigositas harapan xi = frekuensi gen ke-1
Ragam (SE) heterosigositas harapan diperoleh dari =
e. Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan Chi-Kuadrat menurut
(Hartl & Clark 1997).
Keterangan :
² = uji Chi-kuadrat
obs = jumlah pengamatan genotipe ke-i
exp = jumlah harapan genotipe ke-i f. Polymorphic Informative Content (PIC)
Tingkat polimorfisme suatu alel dihitung menggunakan pendekatan nilai
Polymorphic Informative Content (PIC) (Botstein et al 1980) :
Keterangan :
Pi = frekuensi alel ke-i
n = jumlah alel per penciri (marker)
Derajat bebas dihitung berdasarkanAllendorf dan Luikart (2007) : Jumlah genotipe –i
Jumlah alel –j
g. Sekuensing DNA
Sequensing fragmen gen FSH sub-unit beta, gen FSH reseptor dan gen GH dilakukan dengan purifikasi fragmen DNA. Sampel yang disequensing berdasarkan genotipe.
h. Abnormalitas sperma :