BAB III METODE PENELITIAN
K. Cara Kerja
1. Sebelum perlakuan
a. Hewan uji diadaptasi dengan kondisi laboratorium tempat penelitian selama kurang lebih 1 minggu.
b. Hewan uji dikelompokkan secara incidental sampling menjadi 5 kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 7 ekor tikus putih. 2. Pemberian Perlakuan
a. Sejak hari ke-1 sampai hari ke-7 kelompok K1, K2, K3, K4 dan K5 diberi diet standar. Masing-masing diberi perlakuan yang berbeda. b. Antihistamin untuk kelompok 3 dan ekstrak propolis untuk kelompok 4
dan 5 diberikan setiap hari.
c. Sensitisasi OVA dalam Al (OH)3/tikus putih dari 2,5 mg ovalbumin yang dilarutkan pada 7,75 ml Al (OH)3. intraperitoneal (i.p.) dilakukan pada hari ke-0 dan 14 dengan dosis 0,15 ml/tikus putih.
d. Hari ke-21, ke-23, ke-25 dan ke-27 tikus putih dipapar dengan ovalbumin aerosol dari 50 mg ovalbumin dalam 5 ml PBS dengan alat
nebulizer kecepatan 6 L/menit selama 20 menit. 3. Setelah perlakuan
Dua puluh empat jam setelah paparan terakhir, semua tikus putih dikorbankan menggunakan teknik cervical dislocation. Jaringan intestinal diambil untuk dibuat preparat imunohistokimia dan dicat dengan Toluidine Blue. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 kali.
L. Teknik Analisis Data
Data yang diperoleh akan dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji Anova dilanjutkan dengan LSD Post Hoc Test untuk membandingkan
perbedaan mean antarkelompok. Jika data tidak memenuhi syarat untuk uji
Anova, sebaran data tidak normal (p < 0,05) dan varians data tidak sama meskipun sudah ditransformasi, digunakan uji alternatifnya yaitu uji Kruskal-Wallis untuk membandingkan perbedaan mean lebih dari dua kelompok. Dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney, untuk membandingkan perbedaan mean antar kelompok menggunakan program SPSS for Windows Release
17.0.
38 BAB IV
HASIL PENELITIAN
A. Hitung Sel Mast
Penelitian ini menggunakan 35 ekor tikus putih (Rattus norvegicus), galur Wistar, jenis kelamin jantan, usia 4 - 6 minggu, berat badan ± 150 - 200 gram. Tikus-tikus tersebut dibagi secara acak menjadi lima kelompok yaitu kelompok I yang menjadi kelompok kontrol, kelompok II yaitu kelompok asma alergi, kelompok III yang dibuat asma dan diberi antihistamin, kelompok IV yang dibuat asma dan diberi ekstrak propolis dosis 100 mg/kg BB/tikus putih/oral, dan kelompok V yang dibuat asma dan diberi ekstrak propolis dosis 200 mg/kg BB/tikus putih/oral.
Sebelum pemberian perlakuan, kelima kelompok tikus diadaptasikan terlebih dahulu dan diukur berat badannya. Rerata berat badan tikus adalah 150 gram. Pada hari ke-28 kelima kelompok tikus dikorbankan, dan diambil jaringan intestinalnya untuk dibuat preparat.
Preparat intestinal masing-masing kelompok diamati menggunakan mikroskop dengan pengecatan toluidine blue. Pengamatan sel mast jaringan intestinal dengan mikroskop perbesaran 10 x 100 dan dihitung dalam tiga lapang pandang. Data selengkapnya disajikan pada tabel 4.1 :
Tabel 3. Hitung Sel Mast (Jumlah Sel/Lapang Pandang) Masing-Masing Kelompok Perlakuan
Kelompok Median (min-max)
K1 = Kontrol 1(1-5)
K2 = Asma Alergi 3(1-5)
K3 = Asma alergi + Antihistamin generasi III 3(1-5)
K4 = Asma Alergi + Propolis I 2(2-3)
K5 = Asma Alergi + Propolis II 2(2-3)
Sumber: Data primer, 2011
Hasil hitung sel mast masing-masing kelompok disajikan pada gambar berikut ini :
Gambar 6. Histogram Hitung Sel Mast Intestinal Tikus Masing-Masing Kelompok Perlakuan
B. Analisis Hasil
Data yang diperoleh dari hasil penelitian, pertama kali diuji apakah data yang ada memenuhi syarat uji parametrik One-Way ANOVA. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program komputer Statistical Product and Service Solution (SPSS)17.0 for Windows.
Syarat menggunakan uji parametrik One-Way ANOVA:
1. Hanya dapat digunakan dengan masalah skala pengukuran numerik. 1
3 3
2 2
Jumlah Sel Mast
2. Skala variabel numerik harus memiliki sebaran data normal, yang dibuktikan dengan uji normalitas data metode analitik yaitu uji Kolmogorov-Smirnov atau Saphiro-Wilk. Pada sebaran data normal, nilai p lebih besar daripada nilai α. Misal, α = 0,200 maka nilai p untuk uji sebaran data normal harus p > 0,200.
3. Varians data, untuk jumlah kelompok lebih dari dua, harus sama. Hal ini dapat diketahui dengan menggunakan uji homogenitas varians yaitu
Levene’s Test of Varians. Varians data yang sama akan memiliki nilai p lebih besar daripada nilai α. Misal, α = 0,05 maka nilai p untuk uji varians data normal harus p > 0,05.
4. Jika salah satu dari ketiga syarat di atas tidak terpenuhi, dilakukan transformasi data untuk menormalkan data. Apabila hasil transformasi data tidak berhasil menormalkan data maka digunakan uji hipotesis alternatifnya yaitu uji non parametrik Kruskall-Wallis.
Uji normalitas data metode analitik yang dapat digunakan untuk menentukan sebaran data normal atau tidak adalah uji Kolmogorov-Smirnov (sampel > 50) atau uji Saphiro-Wilk (sampel ≤ 50) (Dahlan, 2007). Penelitian ini menggunakan 35 sampel, maka digunakan uji Saphiro-Wilk untuk menentukan apakah sebaran data normal atau tidak.
Hasil uji Saphiro-Wilk menunjukkan distribusi data tidak normal karena ada nilai p = 0,032 dan p = 0,150. Syarat kedua untuk menggunakan uji One-Way ANOVA tidak terpenuhi sehingga perlu dilakukan normalisasi data dengan cara transformasi data.
Setelah dilakukan transformasi data, ternyata data tetap tidak memenuhi syarat untuk uji Anovakarena meskipun varians data sama tetapi sebaran data tidak normal (p < 0,05), sehingga data dianalisis menggunakan uji alternatifnya, yaitu Kruskal-Wallis untuk membandingkan perbedaan mean lebih dari dua kelompok, dilanjutkan uji Mann-Witney untuk membandingkan perbedaan mean antar kelompok menggunakan program SPSS for Windows Release 17.0.
Hasil uji Kruskal-Wallis diperoleh nilai 0,371. Jadi nilai tidak signifikan, tidak terdapat perbedaan bermakna antar kelompok. Hasil perhitungan uji sebaran data, uji varians, dan uji Kruskal-Wallis selengkapnya dilihat pada lampiran 1.
Gambar 7. Sel Mast pada Kelompok Kontrol dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 8. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 9. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Antihistamin Generasi III dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 10. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Ekstrak Propolis Dosis 100 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 11. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi Ekstrak Propolis Dosis 200 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
43 BAB V PEMBAHASAN
Menurut Zukesti (2003), alergi merupakan reaksi imunologik spesifik yang ditimbulkan oleh alergen baik berupa pertahanan selular maupun humoral dari organisme terhadap benda asing.
Penelitian ini menggunakan ovalbumin (OVA) sebagai alergen. Hasil penelitian didapatkan peningkatan jumlah sel mast pada kelompok asma (tabel 3), tetapi tidak bermakna dibandingkan kelompok kontrol (p = 0,337), sedangkan pada penelitian Prihantiny (2010) dengan petanda asma hitung sel mast didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dan asma (p < 0.001). Hal ini sesuai dengan pernyataan Busse dan Lemanske (2001) bahwa OVA akan mengaktivasi sel mast serta sel CD4+ Th2 sebagai reaksi terhadap alergi. Sel CD4+ Th2 yang teraktivasi akan memproduksi mediator-mediator inflamasi seperti histamin, leukotriene, serta sitokin-sitokin seperti IL-4, IL-5 (Busse dan Lemanske, 2001), IL-10, dan IL-13 (Abbas dan Lichtman, 2003). IL-4 dan IL-10 dapat merangsang pertumbuhan sel mast (Li-Weber dan Krammer, 2003). Sitokin-sitokin yang dihasilkan oleh sel CD4+ Th2 berperan dalam hiperplasi sel mast (Blease et al., 2000; Temann, 2002; Abbas dan Lichtman, 2003) dan sangat berpengaruh pada respon alergi (Hohlfeld, 2001). Tidak didapatkannya perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dan kelompok asma pada penelitian ini kemungkinan disebabkan oleh sistem kekebalan tubuh setiap individu bervariasi, sehingga respon yang diberikan juga berbeda.
Pemberian antihistamin generasi III (fexofenadine) pada tikus model asma alergi diharapkan dapat menekan reaksi inflamasi akibat alergi pada kelompok K2 (kelompok asma alergi) sebagai kontrol positif, sehingga dapat menurunkan hitung sel mast. Dari hasil penelitian, antihistamin generasi III (fexofenadine) tidak dapat menurunkan hitung sel mast. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh efek obat yang belum mencapai jaringan intestinal.
Propolis mengandung flavonoid, kandungannya antara lain Cafeic-Acid Phenethyl Ester (CAPE), chrysin, galangin dan kuersetin. Flavonoid yang berpengaruh dalam penurunan hitung sel mast pada penelitian ini yaitu CAPE, dan kuersetin. Menurut Fitzpatrick et al. (2001) CAPE memiliki aktivitas biologis sebagai penghambat poten dan spesifik terhadap aktivasi NF-kB, sehingga sebagai Ca-antagonis yang akan menghambat degranulasi sel mast. Menurut Kimata et al. (2000) dan Kempuraj et al. (2005) kuersetin memiliki aktivitas biologis yang akan memperkuat membran sel mast sehingga membran sel mast tidak mudah terdegranulasi dan menghambat pelepasan histamin, TNF-α dan IL-6. Selain itu propolis juga memiliki efek antileukotrien, antihistamin, dan antiprostaglandin sehingga dapat mencegah stres oksidatif yang dapat menimbulkan reaksi inflamasi. Pada penelitian ini propolis dosis 100 dan 200 mg/kgBB/hari dapat menurunkan hitung sel mast pada intestinal tikus putih tetapi penurunannya tidak bermakna. Saat tikus diberi dosis propolis yang lebih tinggi (200 mg/kg BB/hari) efek terapinya sama dengan propolis dosis 100 mg/kg BB/hari. Hal ini dapat disebabkan oleh dosis yang diberikan belum mencapai dosis optimal yang dibutuhkan dalam pengobatan asma alergi. commit to user
Penelitian ini juga tidak terlepas dari adanya kekurangan yang bisa mempengaruhi hasil penelitian. Dosis ekstrak propolis yang diberikan kemungkinan belum mencapai kadar optimal sehingga tidak menimbulkan efek yang diharapkan.
46 A. Simpulan
Hasil penelitian ini menunjukkan pemberian ekstrak propolis dosis 100 dan 200 mg/kg BB/hari dapat menurunkan hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi namun secara statistik penurunannya tidak bermakna.
B. Saran
Penelitian lebih lanjut dalam pengembangan terapi untuk asma alergi dengan menggunakan propolis dapat dilakukan dengan memberikan dosis yang berbeda sehingga didapatkan dosis yang optimal untuk digunakan dalam terapi.