PENGARUH EKSTRAK ETANOL PROPOLIS TERHADAP HITUNG SEL MAST INTESTINAL PADA TIKUS PUTIH
(Rattus norvegicus) MODEL ASMA ALERGI
SKRIPSI
Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran
Okky Dita Rachmadian G0008035
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET
iii
PERNYATAAN
Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah
diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan
sepanjang pengetahuan penulis juga tidak terdapat karya atau pendapat yang
pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam
naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surakarta, Januari 2012
Okky Dita Rachmadian
G.0008035
iv ABSTRAK
Okky Dita Rachmadian, G.0008035, 2012. Pengaruh Ekstrak Etanol Propolis terhadap Hitung Sel Mast Intestinal pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Model Asma Alergi. Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Tujuan Penelitian: Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol propolis terhadap hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi.
Metode Penelitian: Eksperimental laboratorik dengan the post test only control group design menggunakan 35 ekor tikus putih jantan, dibagi dalam 5 kelompok yaitu kontrol (K1), asma alergi (ovalbumin) (K2), ovalbumin (OVA) dan antihistamin generasi III dosis 2 mg/tikus/hari (K3), OVA dan ekstrak propolis dosis 100 mg/kg BB/hari (K4), sedangkan OVA dan ekstrak propolis dosis 200 mg/kg BB/hari (K5). Sensitisasi pada hari ke-1 dan ke-14 dengan 2,5 cc OVA/ tikus/ i.p, dilanjutkan pemaparan OVA aerosol menggunakan nebulizer kecepatan 6 L/ menit selama 20 menit pada hari ke-21, 23, 25, dan 28. Antihistamin dan ekstrak propolis diberikan per oral selama 28 hari berturut-turut. Hari ke-29, tikus dikorbankan kemudian intestinal diambil untuk dibuat preparat dengan metode blok parafin dan pengecatan Toluidine Blue. Preparat diamati di mikroskop dan sel mast dihitung dalam tiga lapang pandang per preparat. Hasil penelitian dianalisis dengan uji Kruskal Wallis dengan menggunakan program SPSS
Windows Release 17.0. Tingkat kemaknaan digunakan p < 0,005.
Hasil Penelitian: Hitung sel mast (median (min-maks)) sel/lapang pandang masing-masing kelompok K1 1(1-5), K2 3(1-5), K3 3(1-5), K4 2(2-3), dan K5 2(2-3). Hasil uji Kruskal Wallis tidak menunjukkan adanya perbedaan bermakna pada kelima kelompok.
Simpulan Penelitian: Pemberian ekstrak propolis dosis 100 dan 200 mg/kg BB/hari dapat menurunkan hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi namun penurunannya tidak bermakna.
Kata kunci: propolis, sel mast intestinal, asma alergi.
v ABSTRACT
Okky Dita Rachmadian, G.0008035, 2012. The Effect of Propolis Ethanol Extract on Intestines Mast Cell Count in White Mouse (Rattus norvegicus)
Allergic Asthma Model. Medical Faculty of Sebelas Maret University, Surakarta.
Objective: To find out the effect of propolis ethanol extract on intestines mast cell count in white mouse (Rattus norvegicus) allergic asthma model.
Methods: This was laboratory experimental research with the post test only control group design that used 35 male white mice, divided to 5 groups, they were control (K1), allergic asthma (ovalbumin) (K2), ovalbumin (OVA) and antihistamin generation III dosage 2 mg/mouse/day (K3), OVA and propolis extract dosage 100 mg/kg BB/day (K4), whereas OVA and propolis extarct 200 mg/kg BB/day (K5). Sensitization on day 1 and 14 dosage 2,5 cc OVA/ tikus/ i.p, then OVA aerosol with nebulizer for 20 minutes on day 21, 23, 25, and 28. Antihistamin and propolis extract was given per oral for 28 day by day. On day 29, mice were sacrificed to get intestines tissue, mast cell was accounted with
Toluidine Blue. Data was analyzed with Kruskal Wallis methodon SPSS Windows Release 17.0 program. Statistically significant p < 0,005.
Results: Mast cell count (median (min-max)) cell/ view K1 group were 1(1-5), K2 3(1-5), K3 3(1-5), K4 2(2-3), dan K5 2(2-3) respectively. There is no significant difference between five groups from Kruskal Wallis test result.
Conclusion: Propolis extract dosage 100 and 200 mg/kg BB/day can decrease intestines mast cell count in white mouse (Rattus norvegicus) allergic asthma model but it was not significant.
Key words: propolis, intestines mast cell, allergic asthma.
vi PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT, atas segala karunia dan kasih-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Pengaruh Ekstrak Etanol Propolis terhadap Hitung Sel Mast Intestinal pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Model Asma Alergi”. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat dalam menyelesaikan program studi pendidikan dokter di Fakultas Kedokteran UNS Surakarta.
Penyusunan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Maka pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Zainal Arifin Adnan, dr., Sp.PD-KR-FINASIM. selaku Dekan Fakultas Kedokteran UNS Surakarta;
2. R. P. Andri Putranto, dr., M.Si. selaku Pembimbing Utama yang telah memberikan bimbingan, masukan, dan motivasi bagi penulis;
3. Martini, Dra., M.Si. selaku Pembimbing Pendamping yang telah memberikan bimbingan, masukan, dan motivasi bagi penulis.
4. Diding Heri Prasetyo, dr., M.Si. selaku Penguji Utama yang telah memberikan kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini;
5. Sarsono, Drs., M.Si. selaku Anggota Penguji yang telah memberikan kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini;
6. Seluruh Dosen dan Staf bagian Biokimia FK UNS;
7. Muthmainah, dr., M.Kes. selaku Ketua Tim Skripsi Fakultas Kedokteran UNS Surakarta beserta staf yang telah memberi pengarahan;
8. Semua pihak lainnya yang telah membantu terselesaikannya skripsi ini, yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Penulis mengharapkan kritik dan saran demi perbaikan penulis maupun peningkatan karya ini. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat.
Surakarta, Januari 2012 Penulis
vii A. Latar Belakang Masalah ... 1
B. Rumusan Masalah... 3
4. Sensitisasi Hewan Coba ... 20
B. Kerangka Pemikiran ... 26
1. Kerangka Konsep ... 26
2. Kerangka Pikiran Teoritis ... 27
C. Hipotesis ... 28
E. Penentuan Dosis Perlakuan ... 30
F. Rancangan Penelitian ... 32
G. Identifikasi Variabel Penelitian ... 32
H. Skala Variabel ... 33
I. Definisi Operasional Variabel Penelitian... 33
J. Instrumentasi Penelitian... 34
K. Cara Kerja... 35
viii BAB IV HASIL PENELITIAN
A. Hitung Sel Mast ... 38
B. Analisis Hasil ... 39
BAB V PEMBAHASAN ... 43
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan ... 46
B. Saran ... 46
DAFTAR PUSTAKA ... 47
LAMPIRAN
ix
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Kandungan Kimia Propolis
Tabel 2. Nama-nama Beberapa Flavonoid dan Aktivitas Biologisnya
Tabel 3. Hitung Sel Mast (Jumlah Sel/Lapang Pandang) Masing-Masing Kelompok Perlakuan
x
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur Molekul Chrysin (diambil dari Harris et al., 2006) Gambar 2. Struktur Molekul Kuersetin (diambil dari Santos, et al., 2008) Gambar 3. Sel Mast dengan Pengecatan Methylene Blue (Nivaldo, 2009) Gambar 4. Kerangka Konsep Penelitian
Gambar 5. Rancangan Penelitian
Gambar 6. Histogram Hitung Sel Mast Intestinal Tikus Masing-Masing Kelompok Perlakuan
Gambar 7. Sel Mast pada Kelompok Kontrol dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 8. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 9. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Antihistamin Generasi III dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 10. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Ekstrak Propolis Dosis 100 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 11. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi Ekstrak Propolis Dosis 200 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Jadwal Penelitian
Lampiran 2. Prosedur Pembuatan Ekstrak Etanol Propolis Lampiran 3. Tabel Konversi Dosis Manusia ke Hewan
Lampiran 4. Daftar Volume Maksimal Larutan Sediaan Uji yang Dapat Diberikan pada Berbagai Hewan
Lampiran 5. Data Primer Penelitian Lampiran 6. Hasil Uji Statistik Lampiran 7. Dokumentasi Penelitian
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Penyakit alergi merupakan kumpulan penyakit yang sering dijumpai di
masyarakat (Tanjung & Yunihastuti, 2006). Alergi adalah suatu keadaan
hipersensitivitas diinduksi oleh pajanan antigen tertentu yang menimbulkan
reaksi imunologi berbahaya pada pajanan berikutnya (Dorland, 2002). Salah
satu manifestasinya adalah asma alergi.
Prevalensi asma dipengaruhi oleh banyak faktor, antara lain jenis
kelamin, umur, status atopi, faktor keturunan, serta lingkungan (Sundaru &
Sukamto, 2007). Dalam tiga puluh tahun terakhir terjadi peningkatan
prevalensi baik di negara berkembang maupun di negara maju. Dampak asma
meliputi penurunan kualitas hidup, produktivitas yang menurun,
ketidakhadiran di sekolah, peningkatan biaya kesehatan, risiko perawatan di
rumah sakit dan bahkan kematian (Muchid dkk, 2007).
Sel imun yang berperan penting dalam respon inflamasi alergi antara lain
limfosit T-helper, sel plasma, sel mast, dan eosinofil (Hohlfeld, 2001).
Infiltrasi sel mast pada otot polos saluran nafas merupakan ciri khas asma dan
bertanggung jawab terhadap kerusakan fungsi saluran nafas (Jeffery et al.,
2006). Sel mast adalah mediator inflamasi pada reaksi hipersensitivitas dan
alergi.
1
Sel mast tampak sebagai sel besar yang terdapat pada jaringan pengikat,
khususnya di dermis dan mukosa sistem pernafasan serta pencernaan. Sel
mast terdiri atas granul yang mengandung bermacam-macam molekul
mediator termasuk histamin. Di permukaannya terdapat high-affinity Fcε
reseptors (FcεRI) yang memungkinkannya untuk berikatan dengan
Imunoglobulin E (IgE) (Janeway et al., 2004). IgE akan berikatan kuat
dengan reseptor di permukaan sel mast (Platts-Mill, 2001). Adanya
cross-linking antara antigen dengan IgE di permukaan sel mast akan menginduksi
pelepasan mediator yang menyebabkan reaksi hipersensitivitas (Abbas dan
Lichtman, 2003). Mediator tersebut diantaranya amine biogenic, mediator
lipid dan sitokin (Robbins et al., 2007).
Pada penelitian ini, sel mast yang diambil adalah sel mast yang berada pada
jaringan intestinal karena sel mast jaringan ikat memiliki granul yang banyak
mengandung heparin dan histamin.
Asma merupakan penyakit yang tidak bisa disembuhkan secara total.
Pengobatan profilaksis memerlukan waktu lebih lama, sering menjadi
problem tersendiri (Medlinux, 2008).
Salah satu pengobatan asma yang saat ini sedang dikembangkan adalah
dengan menggunakan obat herbal. Masih banyak obat-obat tradisional
nusantara yang belum dikaji secara ilmiah khasiatnya (Handayani, 2001).
Oleh karena itu, pembuktian manfaat obat tradisional melalui uji klinik yang
didukung dengan penelitian imunologis, baik melalui penilaian kualitatif
Propolis merupakan herbal yang bisa dimanfaatkan dalam terapi asma
alergi. Senyawa terpenting dalam propolis adalah flavonoid. Salah satu
flavonoid yang terkandung dalam propolis adalah cafeic-acid dan kuersetin
(Kosalec et al., 2004). Cafeic-acid merupakan Ca-antagonist, sehingga
mampu mencegah degranulasi sel mast yang akan melepaskan
mediator-mediator inflamasi setelah sel mast terjadi Ca influks (Kuby, 1997).
Sedangkan kuersetin sebagai mast cell stabilizer (Duke, 2009) akan
menguatkan efek penghambatan degranulasi sel mast. Dengan dihambatnya
degranulasi sel mast, maka sekresi vasoaktif amin seperti histamin, mediator
lipid, serta sitokin yang berperan dalam proses inflamasi pada reaksi alergi
akan berkurang.
Berdasarkan temuan ilmiah di atas, penulis merasa perlu melakukan
penelitian mengenai efek propolis terhadap jumlah sel mast intestinal pada
tikus putih model asma alergi.
B. Rumusan Masalah
Adakah pengaruh pemberian ekstrak etanol propolis terhadap hitung
sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi?
C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian
ekstrak etanol propolis terhadap hitung sel mast intestinal pada tikus putih
D. Manfaat Penelitian 1. Manfaat Teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang
pengaruh propolis terhadap hitung sel mast intestinal pada tikus putih
(Rattus norvegicus) model asma alergi.
2. Manfaat Praktis
Penelitian ini diharapkan dapat menjadi langkah awal untuk
penelitian lebih lanjut dalam upaya memanfaatkan propolis sebagai obat
anti asma alergi, serta sebagai bahan pertimbangan pemanfaatan propolis
dalam pelayanan kesehatan formal.
5 BAB II
LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka 1. Propolis
a. Pengertian Umum
Lebah menghasilkan beberapa produk seperti madu, royal jeli,
polen dan propolis. Propolis sebagai kompleks resin yang
dikumpulkan lebah madu dari berbagai sumber tanaman untuk
kemudian dicampur dengan air liurnya, sehingga menghasilkan
produk lebah yang bermanfaat (Marcucci et al., 2001; Salatino et al.,
2005). Secara penampakan fisik (warna), aroma dan komposisi
kimiawi propolis terlihat bervariasi tergantung dari berbagai faktor.
Warnanya mungkin putih kekuningan ( krem), kuning, hijau, coklat
terang atau gelap. Beberapa sampel memiliki tekstur, rapuh keras,
sedangkan sampel lainnya mungkin elastis dan kenyal. Propolis
berasal dari bahasa Yunani, pro yang berarti pertahanan dan polis
berarti kota. Dengan demikian menyiratkan bahwa propolis sebagai
produk yang terlibat dalam pembelaan terhadap masyarakat lebah
(Salatino et al., 2005), yang digunakan oleh lebah dalam pembuatan,
pemeliharaan, perlindungan dan mensterilkan sarang lebah (Marcucci
et al., 2001).
Faktor-faktor biologis, zona geografis dan lingkungan dapat
mempengaruhi jumlah dan kualitas produksi propolis (Pereira et al.,
2009). Beberapa penelitian melaporkan bahwa komposisi propolis
dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti sumber bunga (jenis tanaman)
untuk madu, musim dan faktor-faktor lingkungan (seperti jenis tanah
dan iklim, faktor genetik, dan metode pengolahan). Dengan kata lain,
kemungkinan efek-efek yang berhubungan dengan kesehatan sangat
tergantung asal-usulnya (Baltrusaityte et al., 2007).
Komposisi propolis sangat kompleks. Unsur utamanya adalah
lilin lebah, resin dan senyawa volatil. Lebah mensekresikan lilin
lebah, sedangkan resin dan senyawa volatil berasal dari tanaman.
Aktivitas biologis propolis ditentukan oleh zat tanaman ini berasal.
Oleh karena itu, meskipun propolis jelas merupakan produk binatang,
proporsi yang cukup besar dari komponen-komponennya yang
berperan dalam menentukan aktivitas biologis berasal dari tanaman.
Resin merupakan kandungan yang kebanyakan ditemukan dalam
ekstrak alkohol dikonsumsi oleh orang dari berbagai negara sebagai
makanan pelengkap atau obat alternatif (Salatino et al., 2005).
Beberapa senyawa telah diidentifikasi dalam propolis, terutama resin
(50%), lilin (30%), minyak esensial (10%), serbuk sari (5%), dan
senyawa organik lainnya (5%) (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005;
G’omez-Caravaca et al., 2006; Viuda-Martos et al., 2008).
b. Kandungan Kimia
Propolis mempunyai kandungan kimia yang sangat kompleks,
antara lain resin, lilin dan asam lemak, minyak esensial, protein, serta
senyawa organik lain dan mineral. Selengkapnya disajikan pada tabel
berikut :
Tabel 1. Kandungan Kimia Propolis
Kelas komponen Jumlah Group Komponen
Resin 45-55 % Flavonoid, asam fenolat dan
esternya
Lilin dan asam lemak 25-53% Sebagian besar dari lilin lebah dan beberapa dari tanaman
Minyak esensial 10% Senyawa volatile
Protein 5% Protein kemungkinan berasal
dari polen dan amino bebas
Senyawa organik lain 5% 14 macam mineral yang
dan mineral Paling terkenal adalah Fe dan
Zn, sisanya seperti Au, Ag,
dikelompokkan dalam tiga kelompok yaitu (i) flavonoid (flavonol,
flavon, flavanon, dan hidroflavonol), (ii) turunan cinnamic acid, dan
(iii) terpenoid. Flavonol (kaempferide, kaempferol, galangin,
isorhamnetin, rhamnetin, myricetin, fisetin dan rutin), flavon
(apigenin, acacetin, baicalein, chrysin, luteolin dan tectochrysin),
flavanon (pinocembrin, sakuranetin dan isosakura-netin), turunan
cinnamic acid (ferulic acid, p-coumaric acid dan caffeic acid) dan
terpenoids (tt-farnesol, β-caryophyllene, terpineol dan
syringaldehyde) (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005; Lotfy, 2006).
Senyawa-senyawa tersebut memiliki peran penting dalam aktivitas
biologis propolis, antara lain sebagai imunomodulator, antimikrobial,
antioksidan, antiinflamasi, antifungal, antiprotozoa, antiparasit dan
antiproliferatif (Banskota et al., 2001; Koo et al., 2002; Ahn et al.,
2004; Lotfy, 2006; El-Bussuony & Abouzid, 2010). Sehingga banyak
digunakan sebagai ”obat” secara umum pada sistem kardiovaskuler
dan darah (anemia), alat pernapasan (untuk berbagai infeksi),
perawatan gigi, dermatologi (regenerasi jaringan, ulkus, eksim,
penyembuhan luka-terutama luka bakar, mikosis, infeksi selaput
lendir dan lesi), pengobatan kanker, perbaikan dan penunjang sistem
imunitas, saluran pencernaan (ulkus dan infeksi), hepatoprotektor dan
lain sebagainya (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005).
c. Flavonoid
Flavonoid banyak terdapat dalam buah-buahan, sayuran dan
minuman yang berasal dari tanaman, dan dalam sejumlah makanan
suplemen maupun obat-obatan herbal (Moon et al., 2006). Flavonoid
juga dikenal sebagai bioflavonoid memiliki kelas beragam, secara
alami disusun dari polifenol tanaman yang memiliki berbagai aktivitas
biologis penting dalam terapi. Secara kimiawi dikenal ada 12 klas
flavonoid yaitu flavon, isoflavon, flavan, flavanon, flavanol
dihidrokhalkon, dan auron. Nama-nama dari flavonoid disajikan pada
tabel berikut :
Tabel 2. Nama-Nama Beberapa Flavonoid dan Aktivitas Biologisnya
Jenis flavanoid Aktivitas biologis
Anthosianidin Efek menguntungkan pada
Sirkulasi dan penglihatan, dan antibakteri
Hesperidin Mencegah kerapuhan kapiler
Myrecetin Anti-oksidan, mencegah
Kerusakan sel-sel syaraf dari
Radikal bebas
Nobitelin Anti-inflamasi dan membantu
detoksifikasi
Proanthosianidin (juga dikenal Efek anti-oksidan, 20 kali sebagai pycnogenols) lebih besar dibandingkan
vitamin E
Kuersetin Mencegah pembentukan
katarak. Membantu
permasalahan yang
berhubungan dengan alergi, seperti hay fever, asma dan
eczema. Kuersetin
strukturnya seperti obat anti-alergi yaitu disodium chromoglycate
Rutin Membantu dalam pengobatan
hipertensi, memar dan
meningkatkan kesehatan dan mencegah penyakit, karena sangat aman
dan toksisitasnya rendah (Moon et al., 2006). Ribuan flavonoid
tanaman telah diidentifikasi dan kadar yang berarti biologis dari
bioflavonoid dalam manusia ditunjukkan pada konsumsi 1 gram/hari.
Secara umum dianggap bersifat non-toksik (Heo et al., 2001).
Flavonoid dilaporkan memperlihatkan aktivitas biologis yang luas,
termasuk antibakteri, antiviral, antiinflamasi, antialergik dan
vasodilatasi. Flavonoid juga menunjukkan antioksidan, agregasi
trombosit, fragilitas dan permeabilitas kapiler, dan menghambat
aktivitas sistem enzim termasuk siklooksigenase dan lipoksigenase
(Viuda-Martos et al., 2008). Selain itu flavonoid berpotensi untuk
pencegahan atau pengobatan arthritis, kardiovaskuler, dan beberapa
kanker, termasuk kanker payudara (Murray et al., 2006).
1) Caffeic Acid Phenethyl Ester
Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) merupakan antioksidan
fenolik, yang memperlihatkan sejumlah efek farmakologik dan
biologik termasuk aktivitas anti-inflamasi (Jung et al., 2008),
antiviral dan anti-tumor (Orsolic et al., 2005). CAPE merupakan
penghambat yang poten dan spesifik terhadap aktivasi NF-κB
(Fitzpatrick et al., 2001).
Peningkatan reactive oxygen species (ROS) maupun aktivitas
NF-κB pada pemberian OVA inhalasi, maupun diminimalkan
dengan pemberian CAPE. Hal ini mengindikasikan stres oksidatif
memiliki fungsi penting dalam patogenesis asma bronchial dan
CAPE dapat digunakan sebagai terapi pembantu dalam
penatalaksanaan asma bronchial (Jung et al., 2008).
2) Chrysin
Chrysin (5,7-dihydroxyflavone) adalah senyawa flavon alami
yang ditemukan pada tanaman. Beberapa penelitian terkini
menunjukkan chrysin memiliki banyak aktivitas biologic, seperti
anti-inflamasi, anti-kanker, dan anti-oksidan (Cho et al., 2004;
Harris et al., 2006; Fu et al., 2007). Aktivitas anti-inflamasi
chrysin melalui mekanisme penekanan aktivitas promoter
enzim-enzim pro-inflamasi, cyclooxygenase-2 (COX-2) dan inducible
nitric oxide synthase (iNOS) (Cho et al., 2004). Chrysin berpotesi
untuk menghambat angiogenesis dan tumorigenesis, melalui
penghambatan hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) yang
merupakan faktor transkripsi heterodimer. HIF-1 diekspresikan
secara berlebih pada sejumlah kanker pada manusia dan kadarnya
akan meningkat pada angiogenesis dan tumorigenesis (Fu et al.,
2007).
3) Galangin
Galangin (3,5,7-trihydroxyflavone) termasuk salah satu kelas
flavonoid yang dikenal sebagai flavonol. Galangin adalah
komponen utama propolis lebah madu yang memiliki aktivitas
anti-inflamasi (Borrelli et al., 2002). Aktivitas biologis galangin
yang lain adalah menghalangi induksi mRNA iNOS selama respon
inflamasi (Blonska et al., 2004), menurunkan transkripsi COX-2
(O’Leary et al., 2004), menghambat replikasi virus secara In Vitro
(Amoros et al., 1992), menekan pertumbuhan sel bakteri (Basio et
al., 2000), dan menghambat proliferasi sel kanker payudara
melalui penurunan regulasi siklin D3, E, dan A. Galangin
menghambat aktivitas aryl hydrocarbon receptor (AhR), suatu
faktor transkripsi yang terlibat dalam memprakarsai dan
pertumbuhan tumor payudara (Murray et al., 2006).
4) Kuersetin
Kuersetin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone), merupakan
flavonoid yang banyak ditemukan pada tanaman ataupun
buah-buahan termasuk bawang, brokoli, apel, teh, coklat, dan anggur
merah. Kuersetin adalah flavonoid utama yang banyak ditemukan
pada makanan yang dikonsumsi manusia, di USA diperkirakan
asupan kuersetin berkisar 25 mg/hari (Nanua et al., 2006).
Gambar 2. Struktur Molekul Kuersetin (diambil dari Santos, et al., 2008)
Oleh karena itu, kuersetin memiliki aktivitas biologis yang
beragam. Aktivitas biologis yang ditunjukkan antara lain adalah
efek pro-apopotosis dan anti-proliferatif untuk sejumlah sel
kanker ataupun pre-neoplastik, anti-inflamasi, proteksi terhadap
stress oksidatif.
Pemanfaatan kuersetin untuk kesehatan, antara lain :
a) Manfaat kuersetin pada penyakit saluran nafas
Manfaat potensi kuersetin dalam pengobatan penyakit
saluran nafas, karena beberapa penelitian telah menunjukkan
efek penghambatan pada produksi sitokin atau kemokin
dalam kultur sel. Kuersetin dapat mengurangi produksi Nitric
Oxide (NO) yang diinduksi lipopolisakarida, ekspresi
inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS), dan pelepasan
TNF-α dan IL-6. Kuersetin sangat mengurangi aktivasi
Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) dan NF-κB, suatu
ekspresi gen-gen pro-inflamasi (Cho et al., 2003). Kuersetin
juga memiliki efek penghambatan terhadap aktivasi sel mast
dan pelepasan histamin, TNF-α, IL-6, dan IL-8 (Kimata et
al., 2005). Kuersetin menghambat induksi IL-8 dan Monocyte
Chemotractant Protein (MCP)-1 oleh TNF-α pada kultur sel
sinovial manusia. EM-X, suatu campuran mengandung
kuersetin berasal dari fermentasi beras yang tidak dipoles,
papaya, dan rumput laut, memperlihatkan penghambatan
ekspresi IL-8 yang diinduksi TNF-α pada kultur sel epitel
alveolar manusia (Deiana et al., 2002). Hasil-hasil penelitian
tersebut konsisten pada suatu gagasan yang memperlihatkan
bahwa kuersetin dapat mengurangi inflamasi saluran nafas
pada pasien asma.
b) Manfaat kuersetin pada sistem kardiovaskuler
Flavonoid dapat memperbaiki fungsi endotel dan
akhirnya menyebabkan efek kardiovaskuler yang
menguntungkan. Kuersetin dapat meningkatkan status NO
dan mengurangi konsentrasi endotelin-1 dan dengan
demikian dapat memperbaiki fungsi endotel (Loke et al.,
2008). Konsumsi makanan yang kaya akan kuersetin akan
menurunkan risiko trombosis dan penyakit kardiovaskuler
(Hubbard et al., 2006).
c) Manfaat kuersetin sebagai antioksidan
Sehubungan dengan aktivitas anti-oksidan, anti-tumor
dan anti-inflamasi, kuersetin banyak diteliti pada sejumlah
model kanker sebagai agen kemoprotektif. Kuersetin
memperlihatkan penghambatan berbagai macam kanker,
seperti kanker prostat, serviks, paru, payudara dan kolon.
Penelitian terbaru telah mengungkapkan bahwa kuersetin
menghambat proliferasi sel dengan menyebabkan apoptosis
dan/atau menahan siklus sel (Lee et al., 2006). Kuersetin
merupakan antioksidan yang kuat, sebab dapat mengikat
logam-logam, menangkap radikal bebas, dan menghambat
xanthine oxidase dan li;id peroxidation secara In Vitro
(Vulcain et al., 2005).
2. Asma Alergi
Alergi adalah suatu keadaan yang disebabkan oleh reaksi imunologik
spesifik yang ditimbulkan oleh alergen. Pada umumnya berupa
pertahanan selular dan humoral organisme terhadap benda asing (Zukesti,
2003). Degranulasi sel mast merupakan komponen sentral pada penyakit
alergi, sedangkan manifestasi klinis dan patologis bergantung pada letak
dan kronisitasnya (Abbas & Lichtman, 2003).
Asma alergi diawali dengan inhalasi alergen (Busse dan Lemanske,
Antigen Presenting Cells (APCs) menjadi peptida-peptida untuk
selanjutnya dipresentasikan pada sel limfosit T CD4+ atau yang lebih
dikenal dengan sel Th0. Sel T CD4+ dapat berdiferensiasi menjadi sel
CD4+ Th1 dan sel CD4+ Th2 (Baratawidjaja, 2004).
Aktivasi sel CD4+ Th2 terlihat berperan utama dalam mengawali dan
memelihara terjadinya inflamasi alergi (Temann, 2002; Blease et al.,
2000; Laouini et al., 2003). Hal ini terlihat pada penderita asma dimana
jumlah sel CD4+ Th2 lebih tinggi secara signifikan dibandingkan kontrol,
sebaliknya jumlah sel CD4+ Th1 tidak berbeda (Laouini et al., 2003).
Sel CD4+ Th2 akan memproduksi mediator-mediator inflamasi seperti
histamin dan leukotriene yang dapat menarik sel-sel inflamasi (netrofil,
monosit, eosinofil, dll); sitokin-sitokin termasuk IL-4, IL-5(Busse &
Lemanske, 2001), IL-10, dan IL-13 (Abbas & Lichtman, 2003). Histamin
meningkatkan sekresi sitokin sel CD4+ Th2 seperti IL-3, IL-4, IL-5, IL-10
dan IL-13 serta menghambat produksi sitokin sel CD4+ Th1, di antaranya
IL-2, IL-12 dan IFN-. Melalui sitokin yang dihasilkannya, sel CD4+
Th2 juga berperan dalam hipersekresi mukus dan hiperplasi sel mast
(Blease et al., 2000; Temann, 2002; Abbas & Lichtman, 2003).
Interleukin-4 yang dihasilkan oleh sel CD4+ Th2 akan merangsang
perkembangan sel CD4+ Th2 sendiri dari sel Th0 dan merupakan stimulus
utama produksi IgE (Baratawidjaja, 2004). IL-4 bersama IL-3 dan IL-10
berperan dalam merangsang pertumbuhan sel mast. IL-5 berfungsi
sitokin (Li-Weber & Krammer, 2003). Sedangkan IL-4 dan IL-13
merangsang pertumbuhan, proliferasi, diferensiasi, dan pematangan sel B
menjadi sel plasma dan memproduksi IgE (Janeway, 2004; Kuby, 1997).
Pembentukan IgE oleh sel B memerlukan enzim Protein-Kinase-C (PKC),
Phosphatidilinositol-specific Phospholipase C-γ (PLCγ), dan faktor
transkripsi Nuclear Factor кB (NF-кB) (Abbas & Lichtman, 2003).
Imunoglobulin E sangat berperan dalam terjadinya reaksi alergi. IgE
yang dihasilkan sel plasma tersebut akan berikatan dengan sel mast pada
reseptor FceRI. Proses perlekatan IgE pada sel mast disebut sensitisasi
(Janeway, 2004; Abbas & Lichtman, 2003).
Setelah tersensitisasi, sel mast mempengaruhi reaksi inflamasi. Pada
paparan berikutnya dengan alergen yang sama, alergen akan berikatan
dengan IgE pada sel mast atau basofil yang tersensitisasi dan terjadi
proses degranulasi pada sel tersebut, kemudian mediator akan dilepaskan
dari granula sel mast dan berefek pada jaringan sekitar (Kuby, 1997;
Abbas & Lichtman, 2003).
Dalam peristiwa degranulasi, sel mast melepaskan sejumlah mediator
antara lain histamin, enzim siklooksigenase (COX) dan lipoxygenase
(Laprise et al., 2004; Blease et al., 2000), Prostagalandin D2 (PGD2),
leukotriene-C4, leukotriene-D4, leukotriene-E4, dan platelet-activating
factor (Abbas & Lichtman, 2003).
Histamin memainkan peran yang sangat penting pada patogenesis
et al., 2000; Abbas & Lichtman, 2003). Histamin menyebabkan
peningkatan permeabilitas pembuluh darah, kontraksi otot polos, dan
meningkatkan aktivitas kelenjar respirasi yang merupakan pathogenesis
asma alergi (Abbas & Lichtman, 2003; Kuby, 1997).
Siklooksigenase melalui mediator utamanya PGD2 menyebabkan
vasodilatasi pembuluh darah, bronkokontriksi, dan kemotaksis neutrofil.
Sedangkan lipoxygenase melalui mediator utamanya leukotriene
menyebabkan bronkokontriksi, sekresi mukus dan peningkatan
permeabilitas pembuluh darah. Selain mediator-mediator di atas, sel mast
juga mengeluarkan sitokin berupa TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6 (Abbas &
Lichtman, 2003; Kuby, 1997).
3. Sel Mast
Semua sel mast merupakan derivat dari progenitor di sumsum tulang.
Awalnya sel mast membelah secara heteroplastik, lalu dilanjutkan secara
mitosis homoplastik (Arvy, 1956). Normalnya, sel mast matur tidak
terdapat di sirkulasi. Progenitor bermigrasi ke jaringan perifer sebagai sel
mast imatur dan berdeferensiasi in situ (Abbas & Lichtman, 2003).
Pada mencit terdapat dua tipe sel mast yaitu sel mast mukosa dan sel
mast jaringan ikat.
a. Sel mast mukosa mempunyai granul yang banyak mengandung
kondroitin sulfat dan sedikit histamin. Sel mast jenis ini predominan
b. Sedangkan sel mast jaringan ikat memiliki granul yang banyak
mengandung heparin dan histamin. Predominan terdapat di
submukosa intestinal dan kulit (Abbas & Lichtman, 2003).
Di intestinal, sel mast terutama terdapat di vili, sekitar glandula
duodenal Lieberkuhn, dan juga tersebar di mukosa usus kecil serta
caecum (Sansonow, 1909). Sedangkan pada bronkus, sel mast dapat
ditemukan di sekitar glandula submukosa, otot polos bronkus, dan bagian
lain dari bronkus (Martin et al., 1991).
Salah satu cara untuk melihat sel mast di jaringan yaitu dengan
melakukan pewarnaan preparat menggunakan methylene blue. Dengan
pewarnaan ini, granula sitoplasma sel mast akan terlihat sebagai
gambaran metakromasi (Martin et al., 1991).
Sebenarnya, organ normal hanya mengandung sedikit jaringan
pengikat dan sel mast. Sebaliknya, sel mast terlihat banyak pada jaringan
yang mengalami inflamasi baik pada inflamasi kronik (Prakken dan
Woedermann, 1952) maupun inflamasi akut (Bensley, 1950). Pada
keadaan tersebut terjadi peningkatan jumlah sel mast secara progresif di
sekitar area inflamasi. Selama fase proliferasi sel mast masih terjadi,
populasinya akan terus meningkat (Bensley, 1950). Kemudian melalui
pemeriksaan secara histologi diketahui bahwa peningkatan destruksi sel
mast mengakibatkan reaksi inflamasi yang besar pada jaringan di
sekitarnya (Riley, 1959).
Gambar 3. Sel Mast dengan Pengecatan Methylene Blue (Nivaldo, 2009)
Pada reaksi inflamasi, aktivasi sel mast didahului dengan masuknya
alergen (Utomo & Sutijanto, 2005) yang dapat menimbulkan respon
biologi berupa sekresi isi granul, sintesis dan sekresi mediator lipid, serta
sintesis dan sekresi sitokin. Proses sintesis mediator lipid di antaranya
yaitu pembentukan prostaglandin dan leukotriene. Proses ini memerlukan
enzim cytosolic Phospholipase A2 (PLA2). Sedangkan dalam proses
pelepasan granul sel mast dibutuhkan PLC , PKC, dan influks Ca2+ sel
(Abbas & Lichtman, 2003).
4. Sensitisasi Hewan Coba
Terdapat beberapa spesies binatang yang digunakan sebagai binatang
model asma, di antaranya adalah tikus putih, tikus, marmut, musang,
anjing, kambing, monyet, dan kuda. Dari spesies-spesies tersebut, yang
paling banyak digunakan adalah tikus putih karena memiliki keuntungan
yang paling besar dibanding spesies lain, di antaranya adalah karena IgE
merupakan antibodi terhadap alergi yang utama pada tikus putih (Shin et
al., 2009).
Tikus putih secara tipikal meningkatkan dominasi Th2 pada respon
imun, dan menginduksi parameter respon alergi seperti IgE spesifik
alergen, Airway Hyperresponsiveness (AHR), dan meningkatkan
inflamasi eosinofilik pada jalan nafas (Shin et al., 2009).
Ovalbumin (OVA) digunakan sebagai sensitisasi, komponen OVA
utamanya adalah putih telur, secara struktural adalah serpin (sejenis
protein). OVA merupakan fosfoglikoprotein monomer dengan berat
molekul 43 hingga 45 kD dan bersifat asam pada titik isoelektrik
(Huntington & Stein, 2001). OVA memiliki peran dalam peningkatan
IgE secara spesifik. Mayoritas model yang sekarang digunakan adalah
tikus putih yang disensitisasi dengan ovalbumin secara intraperitoneal,
yang dalam penggunaannya sering bersama-sama dengan adjuvant sel
Th2, seperti alumunium hidroksida (Kips et al., 2003; Diding dkk., 2007).
Alumunium hidroksida(Al(OH)3), merupakan alumunium yang
paling stabil dalam kondisi normal. Al(OH)3 dimasukkan sebagai
adjuvant pada beberapa vaksin karena perannya dalam menginduksi
respon Th2 (Petrovsky & Aguilar, 2004).
Dalam penelitian untuk mensensitisasi hewan coba menggunakan
tikus putih diimunisasi dengan suntikan ovalbumin (OVA; 8µg)
intraperitoneal (i.p) yang diencerkan dengan jel alumunium hidroksida (1
pemaparan tikus dengan 10 µg of OVA memberikan kadar tertinggi IgE
dan IgG. Penelitian lain untuk membuat asma alergi, maka tikus putih
disensitisasi dengan menginjeksikan secara i.p. 10 µg OVA yang
dilarutkan ke dalam 2.25 mg alumunium hidroksida dalam 100 µl saline
pada hari ke-0 dan 14. Pada hari ke-35, 39, dan 42, tikus putih dipapar
dengan inhalasi OVA aerosol selama 20 menit. Aerosol menggunakan
nebulizer cairan OVA (10mg/ml) dalam saline menggunakan Pari LC
Star nebulizer (Pari Respiratory Equipment, Richmond, VA) yang
digerakkan kompresor udara dengan flow rate 6L/min. Untuk protokol
penelitian pemaparan antigen akut (kurang lebih 1 bulan) maupun kronik
(lebih dari 2 bulan), tikus putih diimunisasi secara s.c. pada hari ke-0, 7,
14, dan 21 dengan 25 µg OVA (grade V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
yang dilarutkan pada 1 mg alumunium hidroksida (Sigma-Aldrich) dalam
200 µl PBS (Phosphat Buffer Saline).
a. Tikus Putih Model Asma Alergi Akut
Sifat dari model inflamasi akut dipengaruhi oleh pilihan strain,
alergen, dan protokol sensitisasi dan paparan. Alergen yang umumnya
dipakai adalah ovalbumin (OVA), yang merupakan derivat dari telur
ayam. OVA relatif tidak mahal, tidak berbahaya, dapat dimurnikan,
dan memiliki epitop yang mendominasi respon imun (Shin et al.,
2009).
Protokol sensitisasi pada model inflamasi akut biasanya
membutuhkan pemberian alergen secara sistemik yang multiple
dengan penambahan adjuvant (Nials &Uddin, 2008). Adjuvant seperti
alumunium hidroksida [Al(OH)3] diketahui menginduksi
perkembangan fenotip Th2 oleh sistem imun ketika dipapar antigen
(Nials & Uddin, 2008; Shin et al., 2009).
Protokol tanpa adjuvant juga dapat dilakukan, tetapi
membutuhkan alergen dalam jumlah yang lebih banyak. Setelah
sensitisasi (14-21 hari), jalan nafas tikus putih dipapar dengan alergen,
biasanya selama beberapa hari. Alergen dapat diinhalasi menggunakan
formulasi nebulizer (aerosol), atau dengan intratrakeal (i.t) atau
intranasal (i.n) (Nials & Uddin, 2008). Paparan pada model inflamasi
akut ini disebut dengan paparan alergen primer (Shin et al., 2009).
Protokol untuk yang akut adalah pemaparan OVA secara
intranasal (20 µg dalam 50 µl PBS) diberikan pada hari ke-26, 28, 30,
dan 35, dan tikus putih dikorbankan pada hari ke-36 (Hopfenspriger et
al., 2002).
Paparan primer pada model inflamasi akut memperlihatkan
perubahan seperti asma di klinik seperti peningkatan kadar IgE,
inflamasi jalan napas, hiperplasia sel goblet, hipertrofi epitel, AHR
yang spesifik stimulus, dan -pada beberapa model- bronkokonstriksi
fase cepat dan fase lambat. Namun, karena paparan ini bersifat
paparan singkat, maka tidak dijumpai beberapa lesi yang ada pada
asma kronik pada manusia, seperti inflamasi kronik pada dinding jalan
berjalan singkat, dan pada beberapa model, inflamasi jalan nafas dan
AHR berkurang setelah beberapa minggu dari paparan alergen
terakhir. Oleh karena itu, model paparan akut lebih cocok digunakan
untuk meneliti proses yang mendasari inflamasi jalan napas akut dan
AHR (Nials & Uddin, 2008).
b. Tikus Putih Model Asma Alergi Kronik
Tujuan pembuatan model inflamasi kronik adalah untuk
memperlihatkan perubahan yang terjadi seperti pada asma di klinik,
seperti AHR yang persisten dan remodelling jalan nafas, dan juga
memungkinkan evaluasi obat baru sebagai rancangan terapi daripada
sebagai rancangan profilaksis (Nials & Uddin, 2008). Selain itu,
keuntungan dari protokol ini adalah kemampuannya untuk memonitor
perubahan parameter inflamasi (Shin et al., 2009). Paparan kronik
alergen dilakukan dengan memaparkan secara berulang jalan nafas
dengan alergen kadar rendah sampai selama 12 minggu (Nials &
Uddin, 2008). Sedangkan Shin et al. (2009) menuliskan paparan
untuk model asma kronik (paparan sekunder) diberikan 2-6 minggu
setelah paparan primer ketika eosinofilia jalan nafas dan AHR
menurun sampai baseline level. Pemaparan kronik alergen
memperlihatkan perubahan-perubahan seperti asma pada manusia,
termasuk alergen dependent sensitisasi, Th2 dependent inflamasi alergi
dengan karakteristik influks eosinofil pada mukosa jalan nafas, AHR,
remodelling jalan nafas seperti hiperplasia sel goblet, hipertrofi epitel,
dan fibrosis subepitelial atau peribronkiolar (Nials & Uddin, 2008).
Sedangkan protokol untuk yang kronik, tikus putih yang telah
mendapatkan pemaparan OVA intranasal pada hari ke-26, 28, 30
seperti pada protokol akut dan kemudian dilanjutkan dengan
pemberian pemaparan OVA intranasal dua minggu sekali. Untuk
melakukan pemberian intranasal, tikus putih diberikan anestesi dengan
isoflurane (Isosol TM; Abbott Laboratories, North Chicago, IL) (Ikeda
R.K., 2003). Sedangkan pada penelitian Cho et al., 2004, tikus putih
diimunisasi i.p. pada hari ke-0 dan 12 dengan 50 µg OVA (grade V;
Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) dilarutkan pada 1 mg alum
(Sigma-Aldrich) dalam 200 µl normal saline. Pemaparan OVA
intranasal (20 µg/ 50 µl dalam PBS) diberikan pada hari ke-26, 29,
dan 31 di bawah, anestesi dengan isoflurane (Vedco lnc., St. Joseph,
Missouri, USA) dan kemudian diulangi dua minggu sekali selama 3
bulan. Tikus putih dikorbankan 24 jam setelah akhir pemaparan OVA
terakhir (Cho J. Y., 2004).
B. Kerangka Pemikiran 1. Kerangka Konsep
Gambar 4. Kerangka Konsep Penelitian
Keterangan :
: merangsang : menghambat
2. Kerangka Pikiran Teoritis
Ovalbumin sebagai alergen masuk ke tubuh, ditangkap oleh Antigen
Presenting Cell (APCs). Kemudian diproses dan dipresentasikan ke sel T
CD4+ atau sel Th0. Sel Th0 akan berdiferensiasi menjadi sel CD4+ Th1 dan
sel CD4+ Th2. Kerja dua sel tersebut bersinergi, dimana sel CD4+ Th2
berperan sebagai respon imun humoral yang akan mensekresikan antibodi
(IgE). Sedangkan sel CD4+ Th1 berperan dalam respon imun seluler, yang
akan menghasilkan sitokin-sitokin proinflamasi seperti IL-1β, IL-2, IL-6,
dan TNF-α. TNF-α bersifat proteolitik, sehingga akan melisiskan
sejumlah sel-sel termasuk sel saluran nafas. Debris lisis sel ini akan
menimbulkan stres oksidatif (Reactive Oxygen Species/ROS), yang akan
menambah beratnya reaksi asma alergi.
Ovalbumin melalui sel CD4+ Th2 memicu produksi sel mast, paparan
ovalbumin berikutnya akan menimbulkan degranulasi sel mast yang akan
memproduksi lipid mediator (termasuk histamin) sehingga timbul alergi
inflamasi pada saluran nafas yang akan bermanifestasi sebagai asma
alergi.
Propolis mengandung CAPE yang memiliki aktivitas biologis sebagai
Ca-antagonis yang akan menghambat degranulasi sel mast. Kuersetin
yang terkandung dalam propolis memiliki aktivitas biologis yang akan
memperkuat membran sel mast sehingga membran sel mast tidak mudah
terdegranulasi. Selain itu CAPE memiliki aktivitas biologis sebagai anti
oksidan, kandungan ini dapat menghambat stres oksidatif yang akan
mengurangi terjadinya reaksi inflamasi pada asma alergi.
C. Hipotesis
Ekstrak etanol propolis menurunkan hitung sel mast intestinal pada
tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi.
29 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian yang akan dilakukan ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan rancangan penelitian the post test only control group
design.
B. Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran
Universitas Sebelas Maret. Pada bulan Mei sampai dengan September 2011.
C. Subjek Penelitian
Subjek penelitian berupa tikus putih (Rattus norvegicus) jantan dengan
berat badan ± 150 - 200 gram, dan berumur 4 - 6 minggu. Tikus putih
diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Coba Universitas Setia Budi
Surakarta.
D. Teknik Sampling
Pengambilan sampel dilakukan dengan cara incidental sampling. Dimana
jumlah sampel ditentukan menggunakan rumus Federer (Purawisastra, 2001),
yaitu :
(k-1) (n-1) > 15
Keterangan:
k : jumlah kelompok
n : jumlah sampel dalam tiap kelompok
Dalam penelitian ini, subjek dibagi menjadi 5 kelompok. Berdasarkan
rumus Federer di atas, didapatkan jumlah subjek masing-masing kelompok
sebagai berikut:
( k-1) (n-1) ≥ 15
(5-1) (n-1) ≥ 15
4 (n-1) ≥ 15
4n ≥ 19
n ≥ 4,75≈ 5
Jadi tiap kelompok minimal terdiri dari 5 ekor tikus putih. Pada penelitian
kali ini kami menggunakan 7 ekor tikus putih.
E. Penentuan Dosis Perlakuan
1. Pemberian anti histamin generasi III
Antihistamin generasi III yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Telfast® 120 mg yang mengandung Fexofenadine. Faktor konversi
manusia (dengan berat badan ±70 kg) ke tikus putih (dengan berat badan ±
200 gr) adalah 0,018 (Suhardjono, 1995). Sehingga dosis yang diberikan
kepada tikus putih :
120 x 0,018 = 2,16 mg ≈ 2 mg
Dalam penelitian ini dosis anti histamin yang diberikan ialah 1
ml/tikus putih/hari, sehingga pelarut yang diperlukan :
2. Pemberian propolis
Dosis propolis yang diberikan pada tikus putih adalah 100 mg/kg
BB/hari/oral (Lotfy, 2006). Oleh karena tikus putih yang digunakan dalam
penelitian ini mempunyai berat badan ±200 mg, maka didapatkan
perhitungan sebagai berikut :
Untuk mengetahui berapa banyak dosis per oral yang diberikan untuk tiap
tikus, maka dapat dihitung sebagai berikut :
v = 0,5 ml
Sehingga untuk dosis 100 mg/kg BB/hari setiap tikus mendapatkan dosis
per oral 0,5 ml. Sedangkan untuk dosis 200 mg/kg BB/hari setiap tikus
mendapatkan dosis per oral 1 ml.
F. Rancangan Penelitian
Gambar 5. Rancangan Penelitian Keterangan :
S : Jumlah tikus putih yang digunakan K1 : Kelompok kontrol
K2 : Kelompok asma alergi
K3 : Kelompok asma alergi + antihistamin 2 mg/tikus putih/hari per oral
K4 : Kelompok asma alergi + ekstrak propolis dengan dosis 100mg/kg BB/tikus putih/oral
K5 : Kelompok asma alergi + ekstrak propolis dengan dosis 200mg/kg BB/tikus putih/oral
1. Variabel Bebas : ekstrak etanol propolis
2. Variabel Terikat : hitung sel mast
3. Variabel Luar
a. dapat dikendalikan : gizi, makanan dan minuman, galur, umur, dan
jenis kelamin hewan coba.
b. tidak dapat dikendalikan : kondisi psikologis, sistem kekebalan tubuh
H. Skala Variabel
1. Ekstrak etanol propolis : skala nominal
2. Hitung sel mast : skala rasio
I. Definisi Operasional Variabel 1. Ekstrak etanol propolis
Propolis lebah pada penelitian ini diperoleh dari peternak lebah di
daerah Kecamatan Kerjo, Kabupaten Karanganyar, Surakarta, Jawa
Tengah. Ekstraksi dilakukan dengan metode perkolasi, dengan cairan
penyari etanol 80%. Sekitar 1 gram (akurasi penimbangan sampai 0,0001
gram) bubuk propolis mentah diekstraksi dengan 10 mL etanol 80% di
shaker dengan kecepatan 200 rpm pada suhu kamar selama 24 jam. Setelah
penyaringan melalui kertas saring, filtrat dibuat hingga 25 mL dengan 80%
etanol dan disimpan dalam botol sampai analisis (Fu et al., 2005).
Ekstrak Etanol Propolis (EEP) menunjukkan aktivias anti-inflamasi
baik akut ataupun kronik. EEP dosis 50 mg/kg BB/hari/oral dan 100 mg/kg
BB/hari/oral menunjukkan aktivitas anti-inflamasi kronik, sedangkan dosis
200 mg/kg BB/hari/oral menunjukkan aktivitas anti-inflamasi akut pada
hewan coba model.
2. Hitung Sel Mast
Tikus putih dikorbankan dengan pentobarbital-Na 100mg/kg BB/i.p.
24 jam setelah akhir pemaparan OVA untuk diambil jaringan intestinal,
setelah itu dibuat blok parafin. Selanjutnya dilakukan potongan serial
terhadap blok parafin tersebut untuk dibuat slide dengan pewarnaan
Toluidine Blue untuk hitung sel mast. Hitung sel mast diidentifikasi
menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 40 kali, pada tiga lapang
pandang yang berbeda.
3. Sensitisasi Hewan Coba
Tikus putih diadaptasikan selama satu minggu. Kemudian dilakukan
penimbangan untuk menentukan dosis dan dilakukan perlakuan. Untuk
membuat model tikus putih asma alergi maka tikus disensitisasi pada hari
ke-1 dengan 2,5 cc ovalbumin (OVA)/tikus putih/i.p dari 2,5 mg OVA
yang dilarutkan pada 7,75 ml Alumunium hidroksida. Hari ke-14
disensitisasi ulang menggunakan 2,5 cc OVA/tikus putih/i.p dari 2,5 mg
OVA yang dilarutkan pada 10 ml PBS. Pemaparan OVA aerosol dalam
PBS (10:1) selama 20 menit dengan nebulizer kecepatan 6 L/menit
diberikan pada hari ke-21, 23, 25 dan 27. Hari ke-28 tikus putih
dikorbankan, jaringan intestinal dan serum dikoleksi.
J. Instrumentasi Penelitian 1. Alat penelitian
a. Kandang hewan percobaan (20 cm x 30 cm x 15 cm)
b. Timbangan digital
c. Spuit injeksi 0,1 ml
d. Sonde tikus putih 0,1 ml
e. Labu ukur 5 ml
f. Beaker glass 5 ml
g. Minor set
h. Deck glass
i. Nebulizer
j. Mikroskop
2. Bahan penelitian
a. Ekstrak propolis
b. Intestinal hewan coba
c. Aquades
d. Pakan tikus putih BR I
e. OVA
f. Antihistamin generasi III
g. Formalin buffer 10%
h. Al(OH)3
i. Blok paraffin
j. Pewarna Toluidine Blue
K. Cara Kerja
1. Sebelum perlakuan
a. Hewan uji diadaptasi dengan kondisi laboratorium tempat penelitian
selama kurang lebih 1 minggu.
b. Hewan uji dikelompokkan secara incidental sampling menjadi 5
kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 7 ekor tikus putih.
2. Pemberian Perlakuan
a. Sejak hari ke-1 sampai hari ke-7 kelompok K1, K2, K3, K4 dan K5
diberi diet standar. Masing-masing diberi perlakuan yang berbeda.
b. Antihistamin untuk kelompok 3 dan ekstrak propolis untuk kelompok 4
dan 5 diberikan setiap hari.
c. Sensitisasi OVA dalam Al (OH)3/tikus putih dari 2,5 mg ovalbumin
yang dilarutkan pada 7,75 ml Al (OH)3. intraperitoneal (i.p.) dilakukan
pada hari ke-0 dan 14 dengan dosis 0,15 ml/tikus putih.
d. Hari ke-21, ke-23, ke-25 dan ke-27 tikus putih dipapar dengan
ovalbumin aerosol dari 50 mg ovalbumin dalam 5 ml PBS dengan alat
nebulizer kecepatan 6 L/menit selama 20 menit.
3. Setelah perlakuan
Dua puluh empat jam setelah paparan terakhir, semua tikus putih
dikorbankan menggunakan teknik cervical dislocation. Jaringan intestinal
diambil untuk dibuat preparat imunohistokimia dan dicat dengan Toluidine
Blue. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran
1000 kali.
L. Teknik Analisis Data
Data yang diperoleh akan dianalisis secara statistik dengan menggunakan
perbedaan mean antarkelompok. Jika data tidak memenuhi syarat untuk uji
Anova, sebaran data tidak normal (p < 0,05) dan varians data tidak sama
meskipun sudah ditransformasi, digunakan uji alternatifnya yaitu uji
Kruskal-Wallis untuk membandingkan perbedaan mean lebih dari dua kelompok.
Dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney, untuk membandingkan perbedaan
mean antar kelompok menggunakan program SPSS for Windows Release
17.0.
38 BAB IV
HASIL PENELITIAN
A. Hitung Sel Mast
Penelitian ini menggunakan 35 ekor tikus putih (Rattus norvegicus),
galur Wistar, jenis kelamin jantan, usia 4 - 6 minggu, berat badan ± 150 - 200
gram. Tikus-tikus tersebut dibagi secara acak menjadi lima kelompok yaitu
kelompok I yang menjadi kelompok kontrol, kelompok II yaitu kelompok
asma alergi, kelompok III yang dibuat asma dan diberi antihistamin,
kelompok IV yang dibuat asma dan diberi ekstrak propolis dosis 100 mg/kg
BB/tikus putih/oral, dan kelompok V yang dibuat asma dan diberi ekstrak
propolis dosis 200 mg/kg BB/tikus putih/oral.
Sebelum pemberian perlakuan, kelima kelompok tikus diadaptasikan
terlebih dahulu dan diukur berat badannya. Rerata berat badan tikus adalah
150 gram. Pada hari ke-28 kelima kelompok tikus dikorbankan, dan diambil
jaringan intestinalnya untuk dibuat preparat.
Preparat intestinal masing-masing kelompok diamati menggunakan
mikroskop dengan pengecatan toluidine blue. Pengamatan sel mast jaringan
intestinal dengan mikroskop perbesaran 10 x 100 dan dihitung dalam tiga
lapang pandang. Data selengkapnya disajikan pada tabel 4.1 :
Tabel 3. Hitung Sel Mast (Jumlah Sel/Lapang Pandang) Masing-Masing Kelompok Perlakuan
Kelompok Median (min-max)
K1 = Kontrol 1(1-5)
K2 = Asma Alergi 3(1-5)
K3 = Asma alergi + Antihistamin generasi III 3(1-5)
K4 = Asma Alergi + Propolis I 2(2-3)
K5 = Asma Alergi + Propolis II 2(2-3)
Sumber: Data primer, 2011
Hasil hitung sel mast masing-masing kelompok disajikan pada gambar
berikut ini :
Gambar 6. Histogram Hitung Sel Mast Intestinal Tikus Masing-Masing Kelompok Perlakuan
B. Analisis Hasil
Data yang diperoleh dari hasil penelitian, pertama kali diuji apakah data
yang ada memenuhi syarat uji parametrik One-Way ANOVA. Analisis data
dilakukan dengan menggunakan program komputer Statistical Product and
Service Solution (SPSS)17.0 for Windows.
Syarat menggunakan uji parametrik One-Way ANOVA:
1. Hanya dapat digunakan dengan masalah skala pengukuran numerik. 1
3 3
2 2
Jumlah Sel Mast
2. Skala variabel numerik harus memiliki sebaran data normal, yang
dibuktikan dengan uji normalitas data metode analitik yaitu uji
Kolmogorov-Smirnov atau Saphiro-Wilk. Pada sebaran data normal, nilai
p lebih besar daripada nilai α. Misal, α = 0,200 maka nilai p untuk uji
sebaran data normal harus p > 0,200.
3. Varians data, untuk jumlah kelompok lebih dari dua, harus sama. Hal ini
dapat diketahui dengan menggunakan uji homogenitas varians yaitu
Levene’s Test of Varians. Varians data yang sama akan memiliki nilai p
lebih besar daripada nilai α. Misal, α = 0,05 maka nilai p untuk uji varians
data normal harus p > 0,05.
4. Jika salah satu dari ketiga syarat di atas tidak terpenuhi, dilakukan
transformasi data untuk menormalkan data. Apabila hasil transformasi
data tidak berhasil menormalkan data maka digunakan uji hipotesis
alternatifnya yaitu uji non parametrik Kruskall-Wallis.
Uji normalitas data metode analitik yang dapat digunakan untuk
menentukan sebaran data normal atau tidak adalah uji Kolmogorov-Smirnov
(sampel > 50) atau uji Saphiro-Wilk (sampel ≤ 50) (Dahlan, 2007). Penelitian
ini menggunakan 35 sampel, maka digunakan uji Saphiro-Wilk untuk
menentukan apakah sebaran data normal atau tidak.
Hasil uji Saphiro-Wilk menunjukkan distribusi data tidak normal karena
ada nilai p = 0,032 dan p = 0,150. Syarat kedua untuk menggunakan uji
One-Way ANOVA tidak terpenuhi sehingga perlu dilakukan normalisasi data
dengan cara transformasi data.
Setelah dilakukan transformasi data, ternyata data tetap tidak memenuhi
syarat untuk uji Anovakarena meskipun varians data sama tetapi sebaran data
tidak normal (p < 0,05), sehingga data dianalisis menggunakan uji
alternatifnya, yaitu Kruskal-Wallis untuk membandingkan perbedaan mean
lebih dari dua kelompok, dilanjutkan uji Mann-Witney untuk
membandingkan perbedaan mean antar kelompok menggunakan program
SPSS for Windows Release 17.0.
Hasil uji Kruskal-Wallis diperoleh nilai 0,371. Jadi nilai tidak signifikan,
tidak terdapat perbedaan bermakna antar kelompok. Hasil perhitungan uji
sebaran data, uji varians, dan uji Kruskal-Wallis selengkapnya dilihat pada
lampiran 1.
Gambar 7. Sel Mast pada Kelompok Kontrol dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 8. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 9. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Antihistamin Generasi III dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 10. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Ekstrak Propolis Dosis 100 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
Gambar 11. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi Ekstrak Propolis Dosis 200 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x
43 BAB V PEMBAHASAN
Menurut Zukesti (2003), alergi merupakan reaksi imunologik spesifik yang
ditimbulkan oleh alergen baik berupa pertahanan selular maupun humoral dari
organisme terhadap benda asing.
Penelitian ini menggunakan ovalbumin (OVA) sebagai alergen. Hasil
penelitian didapatkan peningkatan jumlah sel mast pada kelompok asma (tabel 3),
tetapi tidak bermakna dibandingkan kelompok kontrol (p = 0,337), sedangkan
pada penelitian Prihantiny (2010) dengan petanda asma hitung sel mast
didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dan asma (p < 0.001).
Hal ini sesuai dengan pernyataan Busse dan Lemanske (2001) bahwa OVA akan
mengaktivasi sel mast serta sel CD4+ Th2 sebagai reaksi terhadap alergi. Sel CD4+
Th2 yang teraktivasi akan memproduksi mediator-mediator inflamasi seperti
histamin, leukotriene, serta sitokin-sitokin seperti IL-4, IL-5 (Busse dan
Lemanske, 2001), IL-10, dan IL-13 (Abbas dan Lichtman, 2003). IL-4 dan IL-10
dapat merangsang pertumbuhan sel mast (Li-Weber dan Krammer, 2003).
Sitokin-sitokin yang dihasilkan oleh sel CD4+ Th2 berperan dalam hiperplasi sel
mast (Blease et al., 2000; Temann, 2002; Abbas dan Lichtman, 2003) dan sangat
berpengaruh pada respon alergi (Hohlfeld, 2001). Tidak didapatkannya perbedaan
yang bermakna antara kelompok kontrol dan kelompok asma pada penelitian ini
kemungkinan disebabkan oleh sistem kekebalan tubuh setiap individu bervariasi,
Pemberian antihistamin generasi III (fexofenadine) pada tikus model asma
alergi diharapkan dapat menekan reaksi inflamasi akibat alergi pada kelompok K2
(kelompok asma alergi) sebagai kontrol positif, sehingga dapat menurunkan
hitung sel mast. Dari hasil penelitian, antihistamin generasi III (fexofenadine)
tidak dapat menurunkan hitung sel mast. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh
efek obat yang belum mencapai jaringan intestinal.
Propolis mengandung flavonoid, kandungannya antara lain Cafeic-Acid
Phenethyl Ester (CAPE), chrysin, galangin dan kuersetin. Flavonoid yang
berpengaruh dalam penurunan hitung sel mast pada penelitian ini yaitu CAPE,
dan kuersetin. Menurut Fitzpatrick et al. (2001) CAPE memiliki aktivitas biologis
sebagai penghambat poten dan spesifik terhadap aktivasi NF-kB, sehingga
sebagai Ca-antagonis yang akan menghambat degranulasi sel mast. Menurut
Kimata et al. (2000) dan Kempuraj et al. (2005) kuersetin memiliki aktivitas
biologis yang akan memperkuat membran sel mast sehingga membran sel mast
tidak mudah terdegranulasi dan menghambat pelepasan histamin, TNF-α dan
IL-6. Selain itu propolis juga memiliki efek antileukotrien, antihistamin, dan
antiprostaglandin sehingga dapat mencegah stres oksidatif yang dapat
menimbulkan reaksi inflamasi. Pada penelitian ini propolis dosis 100 dan 200
mg/kgBB/hari dapat menurunkan hitung sel mast pada intestinal tikus putih tetapi
penurunannya tidak bermakna. Saat tikus diberi dosis propolis yang lebih tinggi
(200 mg/kg BB/hari) efek terapinya sama dengan propolis dosis 100 mg/kg
BB/hari. Hal ini dapat disebabkan oleh dosis yang diberikan belum mencapai
Penelitian ini juga tidak terlepas dari adanya kekurangan yang bisa
mempengaruhi hasil penelitian. Dosis ekstrak propolis yang diberikan
kemungkinan belum mencapai kadar optimal sehingga tidak menimbulkan efek
yang diharapkan.
46 A. Simpulan
Hasil penelitian ini menunjukkan pemberian ekstrak propolis dosis 100 dan 200
mg/kg BB/hari dapat menurunkan hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus
norvegicus) model asma alergi namun secara statistik penurunannya tidak bermakna.
B. Saran
Penelitian lebih lanjut dalam pengembangan terapi untuk asma alergi dengan
menggunakan propolis dapat dilakukan dengan memberikan dosis yang berbeda
sehingga didapatkan dosis yang optimal untuk digunakan dalam terapi.
