BAB III METODE PENELITIAN
3.4 Cara Kerja
3.4.1 Peremajaan Isolat Pseudomonas fluorescens
Peremajaan isolat P. fluorescens dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada media NB 100 mL yang diinkubasi pada shaker selama 24 jam, kemudian 1 µL isolat diinokulasikan pada media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada inkubator suhu ruang. Setelah itu, isolat dari media NA yang telah diinkubasi diambil 1 ose dan diinokulasikan pada media NA untuk mendapatkan koloni tunggal P. fluorescens. Metode pembuatan media NB dan NA dapat dilihat pada lampiran 4.
3.4.2 Analisis Kemampuan Pseudomonas fluorescens sebagai Agen Pupuk Hayati 3.4.2.1 Kemampuan Selulolitik
Analisis aktivitas selulolitik dilakukan dengan metode pewarnaan dengan kongo merah 0,1% yang berperan sebagai indikator degradasi selulosa. Media yang digunakan adalah media Mandels & Reese. Metode pembuatan media tersebut dapat dilihat pada lampiran 4. Koloni tunggal dari isolat murni diambil sebanyak satu ujung ose, kemudian ditotol pada permukaan media padat 1% CMC pada cawan. Isolat diinkubasi pada suhu ruang selama 6 hari. Selanjutnya, kultur ditambahkan kongo merah 0,1% selama 15-30 menit kemudian dibilas dengan 1 M NaCl sebanyak 2-3 kali selama 10 menit. Adanya aktivitas selulolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening pada media. Zona bening yang terbentuk menunjukkan daerah yang selulosanya sudah terdegradasi. Daerah yang terwarnai pada media agar menunjukkan selulosa yang tidak terdegradasi oleh isolat. (Mandels & Reese, 1957; Teather & Wood, 1982).
3.4.2.2 Kemampuan Pelarut Fosfat (P)
Analisis kemampuan pelarutan P dilakukan menggunakan media padat Pikovskaya dengan sumber P CaHPO4. 2H2O, untuk mengetahui kemampuan isolat dalam melarutkan fosfat. Metode pembuatan media tersebut dapat dilihat pada lampiran 4. Koloni tunggal isolat murni sebanyak satu ujung ose ditotol pada permukaan media Pikovsykaya. Isolat diinkubasi selama 3-6 hari. Zona bening yang terbentuk menunjukkan aktivitas isolat dalam melarutan P (Gupta et al., 1994).
17
3.4.2.3 Kemampuan Pelarut Kalium (K)
Analisis kemampuan pelarutan K dilakukan menggunakan media padat Aleksandrov dengan sumber K yang digunakan adalah KCl, untuk mengetahui kemampuan isolat dalam melarutkan K. Metode pembuatan media tersebut dapat dilihat pada lampiran 4. Koloni tunggal isolat murni sebanyak satu ujung ose ditotol pada permukaan media Aleksandrov. Isolat diinkubasi selama 3-6 hari.
Zona bening yang terbentuk menunjukkan aktivitas isolat dalam melarutan K (Shanware et al., 2014).
3.4.2.4 Kemampuan Produksi Auksin
Kemampuan mikroba dalam menghasilkan IAA dianalisis secara kualitatif menggunakan media NB dengan penambahan L-triptofan 0,1%. Media diinokulasikan dengan 1 µL isolat murni yang diperoleh dari kultur cair isolat yang berumur 24 jam. Kemudian, kultur diinkubasi selama 72 jam pada suhu 30°C di tempat gelap. Inokulan diambil sebanyak 1 mL untuk disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit. Supernatan masing-masing 75 µL dihomogenkan dengan 150 µL pereaksi Salkowski, lalu diinkubasi di ruang gelap selama 25-30 menit. Perubahan warna suspensi menjadi merah mawar menunjukkan adanya produksi auksin (Gordon & Weber, 1951). Metode pembuatan pereaksi Salkowski dapat dilihat pada lampiran 5.
3.4.3 Analisis Pertumbuhan dan Aktivitas Pseudomonas fluorescens sebagai Agen Pupuk Hayati
Penelitian ini merupakan penelitian awal untuk menganalisis kemampuan tumbuh dan aktivitas P. fluorescens sebagai agen pupuk hayati. Analisis ini dilakukan dengan melakukan modifikasi media Mandels & Reese (1957) terhadap jenis sumber karbon dan sumber nitrogen. Sumber karbon yang digunakan pada penelitian ini adalah LIA, dengan variasi konsentrasi 1%, 2% dan 3%. Sumber nitrogen yang digunakan pada penelitian ini adalah tepung ikan, dengan variasi konsentrasi 0,1%, 0,2% dan 0,3%. L-triptofan ditambahkan pula pada media, berperan sebagai prekursor dalam produksi auksin.
Media Mandels dan Reese yang telah dimodifikasi dibuat dengan penambahan berbagai bahan berikut; 45 mL akuades, LIA 1%, tepung ikan 0,1%,
KH2PO4 0,03 g, MgSO4 0,015 g, NaCl 0,03 g, FeSO4 0,3 mg, MnSO4 0,3 mg,
NH4NO3 9 mg, glukosa 0,03 g, CaCl2 1,2 mg ke dalam erlenmeyer. Kemudian dilakukan sterilisasi. Selanjutnya, media yang sudah steril ditambahkan dengan 5 mL L-triptofan 0,1% dan 5 mL isolat murni P. fluorescens. Terakhir, media dikocok perlahan agar homogen. Pembuatan media untuk konsentrasi LIA 2% dan 3% serta tepung ikan 0,2% dan 0,3% dilakukan dengan tahapan yang sama.
Analisis diawali dengan menyegarkan isolat murni P. fluorescens pada media NB 50 mL selama ±24 jam menggunakan shaking incubator. Kemudian isolat dengan umur ±24 jam diinokulasi ke dalam setiap media perlakuan sebanyak 10% dari total volume media, yaitu 5 mL isolat dalam 50 mL setiap media perlakuan. Setelah itu, media dibungkus dengan plastik hitam untuk menghindari media dari kontak langsung terhadap cahaya. Selanjutnya, media diinkubasi dalam shaking incubator pada suhu 35⁰ C dengan kecepatan medium.
Analisis sampel pada setiap media perlakuan dilakukan pada hari ke 1,3,5,7,9 dan 11 terhadap beberapa parameter, diantaranya derajat keasaman (pH), kepadatan populasi P. fluorescens, aktivitas enzim selulase dan kadar glukosa, serta produksi IAA. Analisis dilakukan secara aseptis dengan pengambilan 3 mL dari setiap media perlakuan dan ±50 µL untuk pengukuran pH. Sebanyak 1 mL digunakan untuk analisis kepadatan populasi P. fluorescens dengan pengenceran ber-seri. Kemudian dihitung dengan metode Total Plate Count (TPC) pada media PCA. Sebanyak 2 mL sisanya disentrifugasi pada suhu 4⁰ C selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan yang diperoleh digunakan untuk analisis aktivitas selulase dan produksi auksin. Cara kerja yang dilakukan untuk analisis setiap parameter sebagai berikut.
3.4.3.1 Derajat Keasaman (pH)
Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH indikator. Sampel diambil dari setiap media ±50 µL, kemudian diteteskan pada pH indikator, lalu dilihat perubahan warna pada pH indikator.
3.4.3.2 Kepadatan Populasi
Kepadatan populasi isolat P. fluorescens diukur dengan metode Total Plate Count (TPC) untuk memperkirakan jumlah sel bakteri setiap 48 jam selama
19
12 hari masa inkubasi. Perhitungan dengan metode TPC dilakukan dengan pengambilan 1 ml inokulum mikroba untuk diencerkan dalam 9 mL NaCl fisiologis (0,9%) steril, yang disebut dengan pengenceran ke 10-1. Kemudian hasil pengenceran tersebut dimasukkan ke dalam 9 ml NaCl fisiologis (0,9%) steril, yang disebut dengan pengenceran ke 10-2. Pengenceran dilakukan hingga 10-7 dengan cara yang sama. Setelah itu, dilakukan pencawanan 3 pengenceran terakhir (10-5,10-6, 10-7) dengan tujuan untuk menghitung jumlah koloni bakteri dengan menggunakan metode sebar pada media PCA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. selanjutnya, koloni yang tumbuh diamati dan dihitung menggunakan colony counter. Jumlah koloni yang memenuhi persyaratan perhitungan mikroorganisme adalah 30-300 koloni. Persamaan yang digunakan untuk menghitung kepadatan populasi isolat P.fluorescens adalah sebagai berikut (Chasanah et al., 2013).
epadatan Sel ( m umlah koloni 1 Keterangan:
CFU /mL: Colony Forming Unit per millilitre (satuan internasional penghitungan kepadatan sel bakteri
F1: Faktor seri pengenceran FP: Faktor pengenceran pertama
3.4.3.3 Aktivitas Enzim Selulase dan Kadar Glukosa
Sebelum melakukan pengukuran aktivitas enzim selulase dilakukan pembuatan kurva standar glukosa dengan interval konsentrasi 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, dan 1000 mM. Masing-masing konsentrasi diambil 1 mL dan ditambahkan dalam 1 mL pereaksi DNS (Lampiran 5), kemudian dihomogenkan, lalu dipanaskan menggunakan thermoblock dengan suhu 95ºC selama 15 menit, selanjutnya didinginkan dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar yang terbentuk dapat dilihat pada lampiran 6.
Pengamatan aktivitas enzim selulase dilakukan dengan metode Miller (1959) yang telah dimodifikasi. Inokulan diambil sebanyak sebanyak 1 mL untuk disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit.
Kemudian, supernatan yang diperoleh diambil sebanyak 100 µL dan dilarutkan
dalam 100 µL CMC 1%, dikocok kuat dengan vorteks, dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30°C dan ditambahkan dengan 200 µL DNS. Penghentian reaksi enzim dilakukan dengan pemanasan pada thermoblock pada suhu 100°C selama 15 menit, kemudian didinginkan. Selanjutnya, larutan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540 nm.
Perlakuan kontrol dan blanko dilakukan secara bersamaan dengan prosedur yang sama. Enzim pada kontrol yang akan direaksikan dengan sampel telah diinaktivasi dengan pemanasan pada thermoblock selama 15 menit. Enzim pada blanko, dilakukan penggantian antara larutan enzim dengan akuades untuk direaksikan dengan sampel. Aktivitas enzim diukur pada setiap pengambilan sampel yang dilakukan, sehingga dapat diketahui waktu yang tepat untuk memproduksi enzim selulase.
Aktivitas selulase dinyatakan dalam satuan U/mL. Satu unit diasumsikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk memecah 1 µmoL selulosa menjadi gula pereduksi per menit pada kondisi pengujian. Kadar glukosa yang dihasilkan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 575 nm.
Absorbansi= ((As-Ab)-(Ak-Ab))
Nilai absorbansi yang diperoleh dimasukkan ke dalam persamaan yang diperoleh dari kurva standar glukosa. Selanjutnya, aktivitas selulase dihitung berdasarkan rumus berikut.
Aktivitas selulase(U ⁄mL)=
Keterangan:
As: Absorbansi sampel Ab: Absorbansi blanko Ak: Absorbansi kontrol V: volume enzim (0,1 mL) t: waktu inkubasi (30 menit)
BM: Bobot Molekul glukosa (180 Dalton).
3.4.3.4 Produksi Auksin
Sebelum melakukan pengukuran produksi auksin dilakukan pembuatan kurva standar auksin dengan interval konsentrasi 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, dan 100 ppm. Masing-masing konsentrasi diambil 1 mL dan ditambahkan dalam 1
kadar glukosa (mg/L) x1000 Vxtx BM glukosa
21
mL reagen Salkowski, kemudian dihomogenkan, lalu diinkubasi dalam ruang gelap selama 25-30 menit, selanjutnya diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 535 nm. Kurva standar yang terbentuk dapat dilihat pada lampiran 7.
Pengukuran produksi auksin dilakukan dengan mengambil inokulan sebanyak 1 mL untuk disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit. Supernatan masing-masing 75 µL dihomogenkan dengan 150 µL reagen Salkowski, lalu diinkubasi di ruang gelap selama 25-30 menit.
Suspensi kemudian diukur nilai absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 535 nm (Gordon &Weber, 1951).