METODOLOGI PENELITIAN
4.3 Cara Kerja
4.3.1 Penapisan Fitokimia (Skrining) a. Identifikasi golongan alkaloid
Sebanyak 5 gram serbuk dilembabkan dengan 5 ml ammonia 25% digerus dalam mortir, kemudian ditambahkan 20 ml kloroform dan digerus kembali dengan kuat. Campuran tersebut disaring dengan kertas saring, filtrat berupa larutan organik diambil (sebagai larutan A), (10 ml) diekstraksi dengan 10 ml larutan HCl 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, diambil larutan bagian atasnya (larutan B). Larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring dan disemprot atau ditetesi dengan pereaksi Dragendroff, terbentuk warna merah atau jingga pada kertas saring menunjukkan adanya senyawa alkaloid. Larutan B dibagi dalam 2 tabung reaksi, ditambahkan masing-masing pereaksi Dragendroff dan pereaksi Mayer, terbentuk endapan merah bata dengan pereaksi
Dragendroff atau endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukkan adanya senyawa alkaloid.
b. Identifikasi golongan flavonoid
Sebanyak 10 gram serbuk ditambahkan 100 ml air panas, lalu didihkan selama 5 menit kemudian disaring. Ambil 5 ml filtratnya (dalam tabung reaksi), ditambahkan serbuk Mg secukupnya dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, kocok kuat dan dibiarkan memisah. Terbentuknya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. c. Identifikasi golongan saponin
Serbuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas. Setelah dingin dikocok kuat secara vertikal selama 10 detik. Terbentuknya busa yang stabil, menunjukkan adanya saponin, bila ditambahkan 1 tetes HCl 1% busa tetap stabil.
d. Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid
Sebanyak 5 gram serbuk dimaserasi dalam 20 ml eter selama 2 jam kemudian disaring. Larutan diuapkan dalam cawan penguap sampai kering kemudian ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat ke dalam residu. Terbentuknya warna hijau atau merah menunjukkan adanya steroid/triterpenoid.
e. Identifikasi golongan tanin
Sebanyak 10 gram serbuk ditambah 100 ml air, dididihkan selama 15 menit. Setelah dingin kemudian disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh ditambahkan 1-2 tetes FeCl3 1%,
26
terbentuknya warna biru, hijau, atau hitam menunjukkan adanya seyawa golongan tanin.
f. Identifikasi golongan kuinon
Sebanyak 1 gram serbuk dipanaskan dalam air selama 5 menit, disaring. Sebanyak 5 ml filtrat yang diperoleh ditambahkan 5 ml NaOH 1 N. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya kuinon.
g. Identifikasi golongan minyak atsiri
Sebanyak 2 gram serbuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi (volume 20 ml) kemudian ditambahkan 10 ml pelarut petroleum eter. Pada mulut tabung dipasang corong yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air, kemudian disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh diuapkan pada cawan penguap, selanjutnya residu dilarutkan dengan pelarut etanol 95% sebanyak 5 ml, kemudian disaring dengan kertas saring. Filtratnya diuapkan dengan cawan penguap. Residu yang berbau aromatik menunjukkan adanya senyawa golongan minyak atsiri.
h. Identifikasi golongan kumarin
Sebanyak 2 gram serbuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml kloroform. Corong yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air dipasang pada mulut tabung, kemudian dipanaskan selama 30 menit, setelah dingin disaring. Filtrat diuapkan dengan cawan penguap hingga kering dan sisanya ditambahkan air panas 10 ml, kemudian didinginkan. Hasilnya
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,5 ml amoniak 1% dan diamati dibawah sinar UV 366 nm. Flouresensi biru atau hijau menunjukkan adanya kumarin.
4.3.2 Ekstraksi Minyak Jinten Hitam
Biji jinten hitam dibersihkan dari benda-benda asing dan zat pengotor lainnya. Sebanyak 700 gram biji jinten hitam dihaluskan hingga menjadi serbuk kemudian ditimbang. Setelah itu dimaserasi dengan pelarut n-heksana selama satu minggu sampai pelarutnya agak jernih pada suhu kamar. Minyak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dalam rotary evaporator.
4.3.3 Penapisan Fitokimia Minyak Jinten Hitam
Meliputi identifikasi alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, steroid, triterpenoid, kuinon, minyak atsiri, dan kumarin.
4.3.4 Pemeriksaan Minyak Jinten Hitam
a. Pemeriksaan organoleptik : bentuk, warna, bau b. Pemeriksaan keasaman/pH
pH minyak jinten hitam diukur dengan pH meter yang telah dikalibrasi dengan dapar standar pH 4 dan pH 7.
c. Pemeriksaan indeks bias
Indeks bias diperiksa dengan menggunakan alat refraktometer. d. Pengukuran viskositas (Martin, 1993)
28
e. Pemeriksaan kelarutan
Minyak jinten hitam dilarutkan dalam etanol (95%) P. f. Pemeriksaan bobot jenis (DepKes RI, 1995)
Piknometer ditimbang dalam keadaan bersih dan kering sebagai berat kosong. Piknometer tersebut diisi dengan air sampai penuh dan temperatur diatur hingga 25oC, lalu ditimbang. Cara yang sama dilakukan terhadap minyak jinten hitam.
Perhitungan : Berat piknometer berisi air dan minyak jinten hitam masing-masing dikurangkan dengan berat piknometer kosong. Bobot jenis minyak jinten hitam adalah hasil bagi berat minyak jinten hitam dengan berat air, dalam piknometer kemudian dikalikan dengan berat jenis air.
g. Pengukuran panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang ditentukan pada konsentrasi 1 ppm minyak jinten hitam (Nigella sativa L.) dalam larutan etanol 95%. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang UV yaitu 200 –
400 nm. Kemudian dibuat kurva hubungan antara panjang gelombang terhadap serapanya.
h. Penentuan kurva kalibrasi minyak biji jinten hitam
Larutan minyak jinten hitam dalam etanol 95% dengan konsentrasi 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ppm ditentukan serapannya pada panjang gelombang maksimum minyak jinten hitam (Nigella sativa L.).
4.3.5 Pembuatan Formula gel
Tabel 1. Formula gel minyak jinten hitam Komposisi Bahan
Formula
I II III IV V VI
Minyak jinten hitam Karbopol 940 HPMC Na CMC Propilenglikol Nipagin TEA Asam sitrat BHT Air suling ad 2 % - - 4% 15 % 1 % - 0,5% 0,008% 100% 2 % - - 5% 15 % 1 % - 0,5% 0,008% 100% 2 % - 3% - 15 % 1 % - 1% 0,008% 100% 2 % - 4% - 15% 1 % - 1% 0,008% 100% 2 % 0,5% - - 15 % 1 % 1% - 0,008% 100% 2 % 1% - - 15 % 1 % 1% - 0,008% 100%
Cara pembuatan gel :
a. Gelling agent (Na CMC/HPMC/Karbopol) dikembangkan di dalam
lumpang dengan air suling panas sejumlah 10 kali bobotnya selama setengah jam, kemudian gerus kuat sehingga terdispersi sempurna dan terbentuk basis gel. (M1).
b. Zat Aktif (minyak jinten hitam), nipagin, propilenglikol, TEA (khusus formula dengan basis karbopol) dan BHT dilarutkan di dalam lumpang (M2). Kemudian M2 di campurkan dengan M1 dan tambahkan sisa air suling ke dalam lumpang sedikit demi sedikit dan tambahkan asam sitrat (khusus formula dengan basis Na CMC dan HPMC) sedikit demi sedikit. Setelah tercampur lalu digerus
30
dalam lumpang sampai terbentuk massa gel. Penggerusan dilakukan pada suhu kamar.
4.3.6 Evaluasi Gel
a. Pemeriksaan Organoleptik
Pemeriksaan meliputi penampilan sediaan, warna, bau, dan tekstur. b. Pemeriksaan pH
Gel dimasukkan ke dalam wadah, lalu diukur pHnya dengan pHmeter yang telah dikalibrasi dengan dapar standar pH 4 dan pH 7.
c. Pemeriksaan Homogenitas
Gel dioleskan diatas kaca objek, kemudian dikatupkan dengan kaca objek lain, lalu diamati kehomogenan gel tersebut.
d. Pemeriksaan viskositas
Sediaan gel disiapkan dalam becker glass 100 ml. Kemudian dipilih nomor spindel 7. Pemeriksaan ini menggunakan viskometer Brookfield.
e. Uji stabilitas fisik dengan metode cycling test
Gel disimpan pada suhu 4oC selama 24 jam lalu dikeluarkan dan ditempatkan pada suhu 40oC selama 24 jam. Perlakuan ini adalah satu siklus. Percobaan diulang sebanyak 6 siklus. Kondisi fisik sediaan dibandingkan dengan kondisi fisik sebelumnya selama percobaan. Uji stabilitas dengan metode cycling test bertujuan untuk mengetahui apakah terjadi sineresis pada gel.
f. Uji difusi (Martin, 1993) Pembuatan membran difusi
Membran yang digunakan adalah kertas Whatman no 1 yang diimpregnasi pada cairan spangler. Komposisi cairan spangler : Asam palmitat 10 g Asam oleat 15 g Asam stearat 5 g Minyak kelapa 15 g Parafin 10 g Kolesterol 5 g Lilin putih 15 g
Cara pembuatan : Semua bahan dilebur dalam cawan petri. Setelah itu kertas Whatman dicelupkan atau direndam dalam cairan spangler selama 15 menit. Kemudian diangkat dan dikeringkan dengan kertas tissue.
Bobot membran sebelum dan sesudah impregnasi ditimbang untuk mendapatkan kondisi yang sama pada setiap membran. Persentasi impregnasi membran dapat dihitung berdasarkan rumus:
Presentase impregnasi = X 100 %
Dimana Bt adalah berat membran sesudah impregnasi dan Bo adalah berat membran sebelum impregnasi.
32
Uji difusi
Alat difusi terdiri dari sel difusi (mini pump variable flow, membran difusi, termometer), pompa peristaltik, alat penghilang gelembung udara, dan gelas kimia sebagai wadah cairan penerima. Sebanyak enam formula uji ditimbang 1 gram kemudian diratakan di atas membran dengan diameter 1,5 cm. Suhu sistem 37±0,5oC dengan cairan sirkulasi hydroalcoholic (etanol:air 40:60) sebanyak 300 ml. Pompa peristaltik menghisap cairan reseptor dari gelas kimia kemudian dipompa ke sel difusi melewati penghilang gelembung sehingga aliran terjadi secara hidrodinamis. Kemudian cairan dialirkan kembali ke reseptor. Proses dilakukan selama 3 jam. (Alessandro et al, 2007).
Cuplikan diambil dari cairan reseptor dalam gelas kimia sebanyak 5 ml. Setiap pengambilan selalu diganti dengan cairan hydroalcoholic sebanyak 5 ml. Pengambilan cuplikan dilakukan pada menit ke 5, 15, 25, 35, 45, 60, 80, 100, 160, dan 180 menit kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum.
33 BAB V
