PENGEMBANGAN TEKNIK PREDIKSI RISIKO RADIASI DENGAN TEKNIK FLUORESCENCE IN SITU HIBRIDIZATION (FISH)
II. TATA KERJA
Metode yang digunakan untuk deteksi aberasi kromosom stabil dengan tehnik FISH adalah metode IAEA tahun 2001
3
. Metode tersebut telah dimodifikasi sesuai dengan kondisi laboratorium di PTKMR, menjadi metode standar yang diterapkan di laboratorium Sitogenetik-PTKMR. Tahapan dalam metode tersebut meliputi pengambilan sampel darah, pembiakan, pemanenan, preparasi sampel, dan proses pewarnaan kromosom menggunakan teknik FISH terhadap pewarnaan kromosom single probe yang dilabel dengan fluorochrom Fluorescent
isothiocyanate [FITC] pada kromosom no. 1,
4, 5 dan 8 12 dan untuk dual probe terhadap pasangan kromosom komposisi no. 1 dan 2, 1 dan 5, 2 dan 5, 1 dan 8, 2 dan10 serta 4 dan 8
13
. Untuk pewarnaan kromosom triple probe yang dilabel dengan fluorochrom FITC dan
Texas Red dilakukan terhadap komposisi probe kromosom no 1, 2 dan 5; 1, 5 dan 10;
2, 5 dan 10; serta 5, 6 dan 10 14. Sedangkan untuk pengembangan kualitas pewranaan dengan teknik FISH untuk pewarnaan kromosom triplel probe yang dilabel dengan fluorochrome FITC dan Texas Red, dilakukan terhadap kromosom no 1, 3, dan 6 serta 1, 6, dan 8 yang dikombinasikan dengan pan centromic probe yang dilabel Fluorochrome FITC .
II.1. Pengambilan sampel darah
Sampel darah diperoleh dari pekerja radiasi dengan rentang usia antara 29 – 59 tahun. Setiap pekerja diminta mengisi formulir biodata yang meliputi riwayat penyakit dan pekerjaan yang berkaitan dengan radiasi, dan menandatangani
informed consent (kesediaan memberikan
sampel darah). Sekitar 5 mL darah tepi diambil menggunakan syringe dan segera ditambah 0,03 mL heparin sebagai anti koagulan. Sampel darah tersebut kemudian dibiakkan secara triplo. Terhadap 5 mL sampel darah yang telah diambil, selanjutnya dilakukan proses dimulai dari pembiakan, pemanenan, preparasi preparat, sampai pengamatan.
II.2. Pembiakan sel darah limfosit
Ke dalam tabung kultur, dimasukkan secara berurutan media pertumbuhan 7,5 mL RPMI-1640; 0,1 mL L-Glutamin; 1 mL
Fetal Bovine Serum; 0,2 mL Penicillin-Streptomycin; 1 mL sampel darah dan 0,25
mL Phytohaemaglutinin (PHA). Tabung
kemudian ditutup dan disimpan dalam inkubator 37 oC selama 48 jam. Pada 3 jam sebelum pemanenan, ke dalam biakan ditambahkan 0,1 mL colchisin untuk menghentikan proses pembelahan sehingga diperoleh sel pada tahap metafase.
II.3. Pemanenan sel limfosit
Sampel darah yang telah dibiakkan, disentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Pada endapan darah yang diperoleh, ditambahkan 10 mL KCl 0,56%, diaduk dengan pipet Pasteur dan disimpan pada waterbath 37 ºC selama 20 menit. Larutan selanjutnya disentrifus kembali dengan kecepatan yang sama. Pada endapan ditambahkan 4 mL larutan carnoy (metanol : asam asetat = 3 : 1), divortex, ditambahkan lagi larutan carnoy sampai volume total mencapai 10 mL, dan disentrifus. Tahap terakhir ini dilakukan beberapa kali sampai diperoleh endapan sel limfosit yang berwarna putih.
II.4.1. Pembuatan preparat dan pengecatan kromosom dengan teknik FISH single probe
Endapan sel limfosit diteteskan di atas gelas preparat pada tiga tempat yang berbeda dan dikeringkan di atas hot plate 65º C selama 1½ jam. Dengan mikroskop, dilakukan seleksi terhadap preparat yang mempunyai sebaran kromosom yang baik pada sel tahap metafase. Preparat tersebut didehidrasi dengan dimasukkan ke dalam seri
Seminar Nasional Keselamatan Kesehatan dan Lingkungan VI Jakarta, 15-16 Juni 2010
2x masing-masing selama 2 menit, etanol 90% 2x selama 2 menit dan etanol 100% sebanyak 1x selama 5 menit. Preparat kemudian dikeringkan di atas hot plate 65ºC selama 1½ jam. Kromosom pada preparat selanjutnya di denaturasi dengan dimasukkan ke dalam larutan formamida dan diinkubasi pada waterbarh 65ºC selama 1½ menit. Preparat dicuci secara berturutan dengan alkohol 70% dingin selama 4 menit, 70% selama 2 menit, 90% sebanyak 2 x masing-masing selama 2 menit dan 100% selama 5 menit. Kromosom pada preparat telah siap untuk dilakukan hibridisasi dengan whole
chromosome probe (WCP) nomor 1, 2, 4, 5,
atau 8. WCP yang digunakan merupakan produksi ID Labs. USA.
Dibuat campuran 1 µl WPC berlabel
Fluorescent isothiocyanate (FITC) dengan 4
µl buffer, disentrifus selama 1-3 detik, didenaturasi pada suhu 65º C selama 10 menit, dan kemudian diinkubasi pada
waterbath 37 ºC selama 45 menit. Proses
hibridisasi (pengecatan) dilakukan dengan meneteskan larutan probe pada preparat yang telah di denaturasi, kemudian ditutup dengan
coverslip dan dilem untuk mencegah terjadi
penguapan. Preparat diletakkan dalam wadah plastik dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 16 jam. Setelah proses hibridisasi
coverslip dibuka, secara berturutan preparat
direndam dalam seri coplin jar yang berisi larutan pencuci stringency 45 ºC sebanyak 2x masing-masing selama 5 menit, larutan 1 x SSC sebanyak 2 x selama 5 menit, dan
larutan detergen sebanyak 1x selama 4 menit. Preparat dikeringkan, diteteskan 10 µl 4,6
diamidino-2-phenylindole (DAPI), ditutup,
dan didiamkan selama 10 menit. DAPI yang merupakan counterstain terhadap kromosom yang tidak dihibridisasi dengan WCP, diperoleh dari VYSIS (VX-32804830). Preparat segera diamati dengan mikroskop
epi-fluorescent yang dilengkapi dengan filter
biru, dan dilakukan pemotretan terhadap kromosom yang memiliki pendaran probe kromosom.
II.4.2. Pembuatan preparat dan pengecatan kromosom dengan teknik FISH dual probe
Endapan sel limfosit diteteskan di atas gelas preparat pada tiga tempat yang berbeda dan dikeringkan di atas hot plate 65º C selama 1½ jam. Dengan mikroskop, dilakukan seleksi terhadap preparat yang mempunyai sebaran kromosom yang baik pada sel tahap metafase. Preparat tersebut didehidrasi dengan dimasukkan ke dalam seri
coplin jar yang berisi etanol 70% sebanyak
2x masing-masing selama 2 menit, etanol 90% 2x selama 2 menit dan etanol 100% sebanyak 1x selama 5 menit. Preparat kemudian dikeringkan di atas hot plate 65ºC selama 1½ jam. Kromosom pada preparat selanjutnya di denaturasi dengan dimasukkan ke dalam larutan formamida dan diinkubasi pada waterbarh 65ºC selama 1½ menit. Preparat dicuci secara berturutan dengan alkohol 70% dingin selama 4 menit, 70% selama 2 menit, 90% sebanyak 2 x
masing-masing selama 2 menit dan 100% selama 5 menit. Kromosom pada preparat telah siap untuk dilakukan hibridisasi dengan whole
chromosome probe (WCP) nomor 1, 2, 5, 8
dan 10. WCP dari ID Labs. USA, variasi
dual probe yang dilakukan adalah kromosom no.1 dan 2, 1 dan 5, 1 dan 8, 2 dan 5, 2 dan 10 serta 4 dan 8.
Dibuat campuran masing –masing untuk probe kromosom berbeda sebanyak 3 µl WPC berlabel Fluorescent isothiocyanate (FITC) dengan 4 µl buffer, disentrifus selama 1-3 detik, didenaturasi pada suhu 65 ºC selama 10 menit, dan kemudian diinkubasi pada waterbath 37 ºC selama 45 menit. Proses hibridisasi dilakukan dengan meneteskan larutan probe pada preparat yang telah di denaturasi, preparat ditutup dengan
coverslip dan dilem untuk mencegah penguapan. Preparat diletakkan dalam wadah plastik dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 16 jam. Setelah proses hibridisasi
coverslip dibuka, secara berturutan preparat
direndam dalam seri coplin jar yang berisi larutan pencuci stringency 45 ºC sebanyak 2x masing-masing selama 5 menit, larutan 1 x SSC sebanyak 2 x selama 5 menit, dan larutan deterjen sebanyak 1x selama 4 menit. Preparat dikeringkan, diteteskan 10 µl 4,6
diamidino-2-phenylindole (DAPI), ditutup,
dan didiamkan selama 10 menit. DAPI yang merupakan counterstain terhadap kromosom yang tidak dihibridisasi dengan WCP, diperoleh dari VYSIS (VX-32804830). Preparat segera diamati dengan mikroskop
epi-fluorescent yang dilengkapi dengan filter
biru, dan dilakukan pemotretan terhadap kromosom yang memiliki pendaran probe kromosom.
II.4.3. Pembuatan preparat dan pengecatan kromosom dengan teknik FISH triple probe
Endapan sel limfosit diteteskan di atas gelas preparat pada 1-2 tempat yang berbeda. Dengan menggunakan mikroskop cahaya, dilakukan seleksi terhadap preparat yang mempunyai sebaran kromosom yang baik pada sel tahap metafase. Preparat kemudian dikeringkan di atas hot plate 65ºC selama 1½ jam.. Preparat tersebut didehidrasi dengan memasukkannya ke dalam seri coplin
jar yang berisi etanol 70% sebanyak 2x
masing-masing selama 2 menit, etanol 90% 2x selama 2 menit dan etanol 100% sebanyak 1x selama 5 menit. Kromosom pada preparat selanjutnya didenaturasi dengan dimasukkan ke dalam larutan formamida dan diinkubasi pada waterbarh 65ºC selama 1½ menit. Preparat dicuci secara berturutan dengan alkohol 70% dingin selama 4 menit, 70% selama 2 menit, 90% sebanyak 2 x masing-masing selama 2 menit dan 100% selama 5 menit. Pada tahap ini, kromosom pada preparat telah siap untuk dilakukan hibridisasi dengan campuran whole
chromosome probe (WCP) dengan fluorochrom Fluorescent isothiocyanate
(FITC) nomor 1, 2, 5, 6, dan 10 dan WCP dengan fluorochrome texas red nomor 1 dan 5 (ID Labs. USA).
Seminar Nasional Keselamatan Kesehatan dan Lingkungan VI Jakarta, 15-16 Juni 2010
Dibuat campuran masing-masing 2 µl WPC FITC dan 2 µl WPC texas red dengan 6 µl buffer, disentrifus selama 1-3 detik, didenaturasi pada suhu 65º C selama 10 menit, dan kemudian diinkubasi pada waterbath 37ºC selama 45 menit. Proses hibridisasi (pengecatan) dilakukan dengan meneteskan larutan probe pada preparat yang telah di denaturasi, kemudian ditutup dengan
coverslip dan dilem untuk mencegah terjadi
penguapan. Preparat diletakkan dalam wadah plastik dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 16 jam. Setelah proses hibridisasi, coverslip dibuka dan dilakukan pencucian dengan merendam preparat secara berurutan dalam seri coplin jar yang berisi larutan stringency 45ºC sebanyak 2x masing-masing selama 5 menit, larutan 1 x SSC sebanyak 2x selama 5 menit, dan larutan detergen sebanyak 1x selama 4 menit. Pencucian dilakukan kembali untuk WCP fluorochrome texas red dengan melakukan inkubasi preparat dengan reagen campuran biotinylated Anti Avidin pada larutan pencuci detergen. Preoparat diteteskan 10 µl 4,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI), ditutup, dan didiamkan
selama 10 menit. DAPI yang merupakan
counterstain terhadap kromosom yang tidak
dihibridisasi dengan WCP, diperoleh dari VYSIS (VX-32804830). Preparat segera diamati dengan mikroskop epifluorescent yang dilengkapi dengan dual filter dan dilakukan pemotretan terhadap kromosom yang memiliki pendaran probe kromosom.
II.4.4. Pembuatan preparat dan pewarnaan kromosom dengan teknik FISH triple probe kombinasi dengan pan centromic probe.
Proses pewarnaan untuk FISH multiprobe pada prinsipnya hampir sama dengan teknik yang telah dilakukan sebelumnya. Segera setelah melakukan proses denaturasi pada slide, kemudian segera disiapkan campuran probe kromosom (cocktail) dari probe kromosom yang telah dilabell dengan warna berbeda. Hibridisasi slide diikuti dengan deteksi immunofluorescence dan amplifikasi oleh kromosom spesifik yang dilabelle biotin dan FITC serta amplifikasi dari pan centromic probe kromosom spesifik yang telah dilabel FITC, dengan menggunakan 3 lapisa antibody yaitu lapis pertama : Texas Red Avidin (1:500) (B3), Lapis kedua adalah biotin yang dilabel goat anti avidin (1:250) (B4) dan rabit anti FITC (1:400) (F1), Lapisa ketiga terdiri dari lapisan (B3) dan FITC yang dilengkapi dengan Goat anti rrabit IgG (1:100) (F2). Kemudian slide diinkubasi dengan 100 mikro pada setiap pelapis antibody pada 37 C selama 25 menit. Selanjtnya pada slide dilakukan pencucian dengan larutan buffer selama masing2 3 x 5 menit lalu dilakukan dehyrasi dengan larutan etanol bertingkat. Selanjutnya slide ditutup denagn 25 mikroliter larutan Vectashield, yang terdiri dari 0,15 mikroliter mikrogram/ml DAPI counterstain.
III.5. Pengamatan
Pengamatan terhadap aberasi kromosom stabil dilakukan pada sel metafase dengan mikroskop epifluorescent yang
dilengkapi dengan filter tunggal biru, untuk pengamatan pada probe kromosom yang dilabel dengan fluorochrome FITC.
Kemudian segera dilakukan pemotretan terhadap kromosom yang memilki pendaran
probe kromosom. Sedangkan pengamatan
untuk probe kromosom yang dilabel
fluorochrom FITC dan Texas Red.
Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop epifluorescent yang telah dilengkapi filter triple band pass, yaitu filter yang mampu memvisualisasikan pendaran
probe dengan fluorochrom FITC, Texas Red
dan DAPI secara bersamaaan. Selain itu mikroskop telah dilengkapi komputer yang telah dilengkapi dengan Applied Imaging
System menggunakan program software Cytovision Dengan program tersebut
pemotretan dapat dilakukan dengan lebih baik, dan data pemotretan kromosom dapat disimpan, dianalisis dan dibuat pemetaan kromosom (kariotyping).