Primer spesifik Leptospira mampu mengamplifikasi DNA Leptospira sampai konsentrasi 0,002 ng/25 µl dan amplifikasi DNA Leptopira dengan metode ii-PCR yang menggunakan DNA Leptospira, primer, dan probe spesifik menunjukkan rasio S/N 1,87 memberikan hasil positif dalam waktu 58 menit bila dibandingkan dengan metode PCR konvensional yang membutuhkan waktu 150 menit dan diperlukan analisa dengan gel elektroforesis.
5.2 Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai konsentrasi terendah dari DNA Leptospira yang masih dapat diamplifikasi oleh alat ii-PCR.
38 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR PUSTAKA
Agrawal, Suraksha. 2008. Techniques in Molecular Biology. International Book Distributing Co. : India.
Anonim. 2003. Human Leptospirosis: Guidance for Diagnosis, Surveillance and Control. WHO.
Anonim. 2011. Profil Kesehatan Indonesia 2010. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia : Jakarta.
Anonim. 2012. http://www.iipcr.com/faq.php [12 Maret 2012, pukul 12.50]. Anonim. 2013.
http://www.lifetechnologies.com/id/en/home/life-science/dna-rna- purification-analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/dna-stains/sybr-safe.html [7 Desember 2013, pukul 08.10].
Arezi, Bahram, dkk. 2003. Amplification efficiency of thermostable DNA polymerases. Analytical Biochemistry 321 (2003) 226-235.
Bal, A. E., dkk. 1994. Detection of Leptospires in Urine by PCR for Early Diagnosis of Leptospirosis. J. Clin. Microbiol, Vol. 32.
Bovet, Pascal, dkk. 1999. Factors Assosiated with Clinical Leptospirosis: a Population-Based Case-Control Study in the Seychelles (Indian Ocean). Intl. J. Epidemiol 1999; 28: 583-590.
Carson, Susan. 2006. Manipulation and Expression of Recombinant DNA A Sensitive Method to Identify Pork in Precessed and Unprocessed Food by PCR Amplification of A New Spesific DNA Fragment. J Anim Sci. (79): 2108-2112.
Collins, Richard A. 2006. Leptospirosis. The Biomedical Scientist.
Dale, Jeremy W. dan Malcom von Schantz. 2002. From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology. John Wiley & Sons, Ltd.
39
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Ernawati, Kholis. 2008. Leptospirosis Sebagai Penyakit Pasca Banjir Serta Cara pencegahannya. Fak. Kedokteran Universitas YARSI Jakarta.
Gaaffar, Shabarni. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Universitas Padjadjaran: Bandung.
Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas, Vol. 9. No.1.
Harisha, S. 2007. Biotechnology Procedures and Experimental Handbook, New Delhi, India: Infinity Science Press LLC.
Holme, David. J. dan Hazel Peck. 1998. Analytical Biocemistry, third edition, London: Pearson Education.
Jose, J dan R. Usha. 2000. Extraction of Geminiviral DNA from Highly Mucilaginous Plant (Abelmoschus esculentus). Plant Molecular Biology Reporter 18: 349-355.
K. Nishiguchi, Michele, dkk. 2002. DNA Isolation Procedures. Method and Tools in Biosciences and Medicine Technique in molecular systematic and evolution, ed . by Rob DeSalle, dkk. Birkhāuser Verlag Basel/Switzerland.
Kumari, Rajni. 2007. Meat Species Identificatin by Real Time PCR.
Levett, Paul N. 2001. Leptospirosis. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14 (2): 296. Levett, Paul N., dkk. 2001. Two Method for Rapid Serological Diagnosis of Acute
Leptospirosis. Clinical and Diagnostic Laboratorium Immunology, Vol. 8 Natarajaseenivasan, Kalimuthusamy, dkk. 2004. Human Leptospirosis in Erode, South India: Serology, Isolation, and Characterization of the Isolates by Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Fingerprinting. Jpn. J. Infect. Dis., 57, 193-197.
Purves, William K., dkk. 2003. Life, The Science of Biology Seventh Edition. Sinauer Associastes and W.H. Freeman.
40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Riyaningsih, Suharyo Hadisaputro, dan Suhartono. 2012. Faktor Risiko Lingkungan Kejadian Leptospirosis di Jawa Tengah (Studi Kasus di Kota Semarang, Kabupaten Demak, dan Pati). Jurnal Kesehatan Lingkungan Indonesia, Vol. 11, No. 1.
Saengjaruk, Patcharin, dkk. 2002. Diagnosis of Human Leptospirosis by Monoclonal Antibody-Based Antigen Detection in Urine. J. Clin. Microbiol, Vol. 40, No. 2.
Sambrook, J., dan Russell, D.W., 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd edition, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sambrook, J., Fritsch, E.F, dan Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press. University of Texas South Western Medical Centre, Texas.
Sauer, P., M. M ller, dan J. Kang. 1998. Quantitation DNA. Qiagen News 2: 23-26.
Setadi, Bobby, dkk. 2001. Leptospirosis. Sari Pediatri, Vol 3, No.3, Desember 2001: 163-167.
Setiawan, I Made. 2008. Pemeriksaan Laboratorium Untuk Mendiagnosis Penyakit Leptospirosis. Media Litbang Kesehatan Volume XVIII Nomor 1.
Shekatkar, Smita, Belgode Narasimha Harish, dan Subhash Chandra Parija. 2010. Diagnosis of Leptospirosis by Polymerase Chain Reaction. International Journal of Pharma and Bio Sciences, ISSN 0975-6299, Vol.1/Issue-3/Jul-Sep 2010.
Stephenson, Frank, H. 2003. Calculations in MolecularBiology and Biotechnology, A Guide to Mathematics in The Laboratory, Academic Press, California, USA.
41
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sulistyaningsih, Erma. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Biomedis, Vol. 1.
Surzycki, Stefan. 2003. Human Molecular Biology Laboratory. Blackwell Publishing : USA.
Sweeney J. Patricia dan John M. Walker. 1993. dalam Michael M. Burrell, Enzymes of Molecular Biology, New Jersey: Humana press inc.
Syafaruddin dan Tri Joko Santoso. 2011. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA yang Efisien pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperna (Blanco) Airy Shaw. Jurnal Litri Vol. 17 (1), Maret 2011 : 11-17.
Thornley, C.N, dkk. 2002. Changing Eidemiology of Human Leptospirosis in New Zealand. Epidemiol. Infect, 128, 29-36.
Tilahun, Z, D. Reta, dan K. Simenew. 2013. Global Epidemiological Overview of Leptospirosis. Intl. J. Microbiol. Res., 4 (1): 09-15, 2013
Tsai, Yun-Long, dkk. 2012. Development of TaqMan Probe-Based Insulated Isothermal PCR (iiPCR) for Sensitive and Spesific On-Site Pathogen Detection. Plos One ,Issue 9, Volume 7, September 2012.
Yersin, Claude, dkk. 1998. Human Leptospirosis in the Seychelles (Indian Ocean) a Population-Based Study. Am. J. Trop. Med. Hyg., 59(6).
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta : Penerbit Andi.
Zavitsanou, Assimina, dan Fotoula Babatsikou. 2008. Leptospirosis: Epidemiology and Preventive Measure. Health Science Journal, Volume 2, Issue 2.
42
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 1
Hasil peremajaan E.coli dan DNA Leptospira yang sudah terisolasi
Gambar 13. Hasil Peremajaan E.coli
DNA Leptospira yang sudah terisolasi yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian Vektor dan Reservoir Penyakit Salatiga
43
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 2
Hasil konsentrasi dan kemurnian DNA Leptospira dan DNA E. coli
Tabel 2. Hasil konsentrasi dan kemurnian DNA Leptospira dan DNA E.coli diukur
dengan spektrofotometer Nano Drop ND-1000 Sampel ID Konsentrasi DNA
(ng/µ L) Kemurnian DNA A260/A280 Leptospira 225.4 1.82 225.6 1,83 Rata-rata 225.5 1.825 E. coli 546.7 2.07 546.9 2.06 Rata-rata 546.8 2.065
44
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 3
Membuat Larutan induk primer dan probe
1. Membuat larutan induk primer dan probe 100 µM Jenis Nama oligo µg To make 100 µM Leptospira
Forward 479.75 Add 480 µL ddH2O Reverse 431.13 Add 431 µL ddH2O Probe 569.95 Add 570 µL ddH2O 2. Membuat larutan primer 10 µM dari larutan induk
V1 . M1 = V2 . M2
X . 100 µM = 100 µL . 10 µM X =
= 10 µL
Maka, 10 µL diambil dari masing- masing primer 100 µM dan di add 90 µL ddH2O
3. Membuat larutan probe 5 µM dari larutan induk V1 . M1 = V2 . M2
X . 100 µM = 100 µL . 5 µM X =
= 5 µL
Maka, 5 µL diambil dari masing-masing probe 100 µM dan di add 95 µL ddH2O
4. Rekomendasi konsentrasi untuk primer dipilih konsentrasi akhir 0,5 µM (Tsai, 2012) untuk tiap primer
V1 . M1 = V2 . M2
X . 10 µM = 50 µL . 0.5 µM X =
= 2.5 µL
Maka, diambil 2.5 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM
5. Rekomendasi konsentrasi untuk probe dipilih konsentrasi akhir 0,15 µM (Tsai, 2012)
V1 . M1 = V2 . M2
X . 5 µM = 50 µL . 0.15 µM X =
= 1.5 µL
45
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 4.
Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA untuk PCR konvensional Campuran reaksi master mix untuk PCR konvensional
Tabel 3. Campuran reaksi master mix PCR konvensional Konsentrasi Lar. Induk Konsenrasi Akhir Volume yang digunakan GoTaq® Green Master Mix - - 12.5 µL Primer Forward 10 µM 0,8 µM 2 µL Primer Reverse 10 µM 0,8 µM 2 µL DNA template 100 ng 8 ng 2 µL ddH2O - - 6.5 µL
46
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 5
Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA untuk ii-PCR
1. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan Taq DNA polymerase
KAPA2G™ Robust PCR Kit
Tabel 4. Campuran reaksi master mix dengan Taq DNA polymerase
KAPA2G™ Robust PCR Kit dengan ii-buffer Konsentrasi Lar. Induk Konsentrasi Akhir Volume yang digunakan KAPA2G™ Robust PCR Kit 5 U/µL 2,5 U/50 µL 0.5 µL dNTP 10 mM 0,2 mM 1 µL Primer Forward 10 µM 0,5 µM 2.5 µL Primer Reverse 10 µM 0,5 µM 2.5 µL Probe 5 µM 0,15 µM 1.5 µL DNA template 50 ng 5 ng 5 µL ii-Buffer 1X 37 µL
Total volume reaksi 50 µL
Tabel 5. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan Taq DNA
polymerase KAPA2G™ Robust PCR Kit dengan buffer dari kit Konsentrasi Lar. Induk Konsentrasi Akhir Volume yang digunakan KAPA2G™ Robust PCR Kit 5 U/µL 2,5 U/50 µL 0.5 µL dNTP 10 mM 0,2 mM 1 µL Primer Forward 10 µM 0,5 µM 2.5 µL Primer Reverse 10 µM 0,5µM 2.5 µL Probe 5 µM 0,15 µM 1.5 µL DNA template 50 ng 5 ng 5 µL Buffer A 5X - 10 µL Nuclease Free Water 27 µL
47
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan Taq DNA polymerase
Thermo Scientific™ Long PCR Master Mix
Tabel 6. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan Taq DNA
polymerase Thermo Scientific™ Long PCR Master Mix dengan
ii-buffer Konsentrasi Lar. Induk Konsentrasi Akhir Volume yang digunakan Thermo Scientific™ Long PCR Master Mix 5 U/µL 2,5 U/50 µL 0.25 µL dNTP 2.5 mM 0,2 mM 4 µL Primer Forward 10 µM 0,5 µM 2.5 µL Primer Reverse 10 µM 0,5 µM 2.5 µL Probe 5 µM 0,15 µM 1.5 µL DNA template 50 ng 5 ng 5 µL ii-Buffer 1X 34.25 µL
Total volume reaksi 50 µL
Tabel 7. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR dengan taq DNA
polymerase Thermo Scientific™Long PCR Master Mix dengan
buffer dari kit
Konsentrasi Lar. induk Volume yang digunakan Thermo Scientific™ Long PCR Master Mix 5 U/µL 2,5 U/50 µL 0.25 µL dNTP 2.5 mM 0,2 mM 4 µL Primer Forward 10 µM 0,5 µM 2.5 µL Primer Reverse 10 µM 0,5 µM 2.5 µL Probe 5 µM 0,15 µM 1.5 µL DNA template 50 ng 5 ng 5 µL Buffer with MgCl2 10X - 5 µL Nucluase Free Water - - 29.25 µL
48
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 6
Rasio S/N pada sampel hasil reaksi ii-PCR.
Tabel 8. Nilai rasio S/N pada sampel hasil reaksi ii-PCR
No. Sampel Rasio S/N
1 KAPA2G™ Robust + ii-buffer 1,8062
2 KAPA2G™ Robusrt + buffer kit 1,0014
3 Thermo scientific™ Long PCR Enzyme Mix + buffer kit 0,9799 4 Thermo scientific™ Long PCR Enzyme Mix + ii-buffer 0,9475