Vitamin C adalah salah satu vitamin yang dibutuhkan untuk menjaga kesehatan tubuh. Fungsi vitamin C bagi tubuh antara lain; meningkatkan sistem imunitas (daya tahan) tubuh, mempercepat proses penyembuhan serta membuat kulit lebih segar dan cerah (Aquirreand May, 2008). Bagi beberapa kaum perempuan manfaat vitamin C untuk membuat kulit cerah dan bersih menjadi daya tarik tersendiri. Secara alami vitamin C didapatkan dari makanan seperti sayuran dan buah-buahan; contohnya bayam, daun katuk, selada, jeruk, mangga, jambu biji, nanas dan lain sebagainya. Namun banyak dari mereka yang kurang menyukai buah-buahan dan sayur-sayuran, untuk memenuhi kebutuhan akan vitamin C, mereka memilih suplemen vitamin C yang dijual ditoko-toko obat.
(Anonimus, 2013a).
Saat ini untuk mendapatkan kulit cerah dan bersih dengan cara injeksi vitamin C sudah banyak ditawarkan baik oleh dokter kulit maupun oleh praktisi-praktisi kecantikan.
Harganya pun terjangkau mulai Rp 100.000 sampai Rp 200.000 perampul untuk sekali suntik. Untuk sekali injeksi vitamin C dosis yang diberikan sekitar 1000–4000 mg.
Sedangkan dosis vitamin C yang disarankan untuk menjaga kesehatan sekitar 50-75 mg/
hari (Anonimus, 2013b). Jadi dosis vitamin C yang diberikan melalui injeksi vitamin C sangat tinggi dibandingkan dengan dosis normal yang diperlukan. Vitamin C berlebih di ekskresikan terutama melalui urin, sebagian kecil di dalam tinja dan sebagian kecil di ekskresikan melalui kulit (Jackson et.al, 2002).
Dosis tinggi vitamin C yang diberikan akan membuat tubuh dan ginjal bekerja lebih berat untuk mengeluarkan kelebihan vitamin tersebut dari tubuh dan diduga pemberian dosis tinggi vitamin C dalam jangka panjang menyebabkan efek samping seperti ; pembentukan batu ginjal, menyebabkan aborsi, mens tidak teratur, menopause dini serta maag (Anonimus, 2013).
Berdasarkan hal tersebut diatas maka keutamaan (urgensi) dalam penelitian ini adalah :
- Injeksi vitamin C dosis tinggi dalam jangka waktu yang lama akan mengganggu kerja organ-organ tubuh seperti ginjal, hati dan juga sistem reproduksi.
8 - Penelitian tentang efek samping injeksi vitamin C dosis tinggi terhadap kesehatan belum pernah diujikan pada hewan coba, meskipun efeknya pada manusia sudah banyak diperdebatkan. Penelitian tentang efek injeksi vitamin C dosis tinggi juga belum ditemukan di jurnal maupun literatur.
1.4. Luaran Penelitian
Dengan melakukan penelitian ini diharapkan diperoleh data ilmiah tentang dampak injeksi vitamin C dosis tinggi dalam jangka waktu lama terhadap kesehatan tubuh.
Kalau terbukti injeksi vitamin C dosis tinggi dalam jangka waktu panjang memberikan dampak yang buruk terhadap kesehatan, maka hasil penelitian ini bisa dipakai acuan bagi praktisi kecantikan dalam dalam menentukan dosis vitamin C yang aman bagi konsumen.
Selain itu, diharapkan dapat memberikan edukasi bagi masyarakat bila ingin melakukan injeksi vitamin C dosis tinggi.
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Vitamin C
Selain memerlukan karbohidrat, lemak dan protein, tubuh juga memerlukan vitamin dan mineral. Meski diperlukan dalam jumlah yang sedikit, namun mineral dan vitamin mempunyai beberapa peran penting dalam metabolisme tubuh. Salah satu vitamin yang kita perlukan dalam tubuh adalah vitamin C. Vitamin yang larut dalam air ini, dalam nama kimianya juga dikenal dengan nama asam askorbat. Vitamin C ini termasuk dalam salah satu golongan antioksidan kuat yang dapat melawan berbagai radikal bebas ekstraseluler. Karakteristik dari vitamin ini adalah mudah teroksidasi oleh panas, cahaya maupun logam. Dengan kata lain vitamin ini mudah sekali rusak (Kim et al.
2002).
Sejarah penemuan vitamin C dimulai ketika Albert Szent Gyorgyi pada tahun 1928–1932 berhasil mengisolasi asam askorbat yang sekarang dikenal dengan nama vitamin C, dan menyebabkan dia dianugrahi penghargaan nobel dalam bidang fisiologi dan kedokteran tahun 1937 (Gyorgi AS. 1931.). Beberapa peran penting vitamin C dalam
9 tubuh adalah menjaga dan meningkatkan sistem imunitas sehingga mampu melawan infeksi penyakit yang masuk ke dalam tubuh (Naidu KA. 2003.)
.
Gambar 1. Rumus Kimia Vitamin C
Asam dehidroaskorbat (DHA) adalah bentuk asam askorbat (vitamin C) yang teroksidasi. Asam dehidroaskorbat dapat digunakan sebagai suplemen pangan vitamin C.
Sebagai bahan kosmetik, asam dehidroaskorbat digunakan untuk memperbaiki penampilan kulit (Kits, 2012).
Makanan yang menjadi sumber vitamin C adalah sayuran dan aneka jenis buah segar diantaranya; tomat, kentang, asparagus, cabe, stroberi, jeruk, jambu biji, mangga, nanas, kol, susu, mentega, ikan dan hati (Berhnar, 1994).
Kebutuhan setiap orang akan vitamin C bervariasi tergantung dari umur, status kesehatan dan kebiasaan setiap orang. Orang yang mempunyai kebiasaan merokok, minum alkohol, mengkonsumsi obat tertentu seperti obat anti kejang, obat tidur, obat kontrasepsi oral, berpengaruh terhadap kebutuhannya akan dosis vitamin C yang diperlukan. Selain itu, keadaan sakit, olah raga, demam akan meningkatkan kebutuhan vitamin C (Kim et.al. 2002).
Vitamin C di dalam tubuh diperlukan untuk menjaga struktur kolagen, suatu protein ekstraseluler yang menghubungkan semua serabut tubuh yang terdapat pada sel kulit, tulang, tulang rawan dan jaringan lain di dalam tubuh. Struktur kolagen yang baik membuat kulit terlihat kencang, tulang kuat, pendarahan kecil dan luka menjadi ringan.
Sebagai antioksidan, vitamin C mampu menangkal dan menetralisir semua radikal bebas di seluruh tubuh. Vitamin C juga mempercepat penyerapan zat besi dan mempertajam kesadaran. Melalui efek pencahar, vitamin C mampu mempercepat pembuangan feses atau kotoran dari tubuh.
10 Kekurangan vitamin C atau yang dikenal dengan istilah hipoascorbemia akan menyebabkan beberapa gejala seperti; pilek, bibir pecah-pecah, sariawan, kulit kasar, gigi mudah goyang dan lepas karena gusi tidak sehat, otot lemah, radang sendi, pendarahan di bawah kulit sekitar mata dan gusi serta mudah mengalami depresi. Kekurangan vitamin C pada fase remaja juga mengakibatkan pertumbuhan tulang berhenti. Sel tulang epipise terus berploriferasi namun tidak ada kolagen baru yang terbentuk sehingga tulang akan menjadi mudah rapuh. Penyakit lain yang juga berhubungan dengan kekurangan vitamin C adalah kolesterol tinggi dan jantung (Daviset.al. 1991 )
Vitamin C mudah diabsorbsi secara aktif dan mungkin pula secara difusi pada bagian atas usus halus lalu masuk ke peredaran darah melalui vena porta. Rata-rata arbsorbsi adalah 90% untuk konsumsi diantara 20-120 mg/hari. Konsumsi tinggi sampai 12 gram hanya diarbsorbsi sebanyak 16%. Vitamin C kemudian dibawa ke semua jaringan. Konsentrasi tertinggi adalah di dalam jaringan adrenal, pituitary, dan retina.
Vitamin C di ekskresikan terutama melalui urin,sebagian kecil di dalam tinja dan sebagian kecil di ekskresikan melaului kulit (Jackson et.al, 2002).
Kelebihan vitamin C yang dikonsumsi melalui makanan tidak menimbulkan gejala yang berarti, namun mengkonsumsi vitamin C dalam bentuk suplemen dosis tinggi akan menyebabkan gejala hiperoksaluria dan meningkatkan resiko terkena batu ginjal.
Kelebihan konsumsi vitamin C juga mengakibatkan gangguan percernaan, kram perut, mual, gas lambung berlebih, dan diare (Anonim, 2013d). Parisa dan Siamak (2010) melaporkan bahwa konsumsi vitamin C (asam askorbat) dalam jangka waktu yang panjang menyebabkan tikus perlakuan mengalami hiperglikemia (diabetes) dan juga peningkatan kehilangan bobot badan.
2.2. Hati
Hati adalah salah satu organ kelenjar, yang terletak di dalam rongga perut sebelah kanan. Hati mempunyai beberapa fungsi diantaranya; sebagai organ detoksifikasi karena hati membantu ginjal karena hati memecah beberapa senyawa racun menjadi urea, amonia dan asam urat. Berbagai jenis fungsi hati dijalankan oleh sel hati yang disebut dengan sel hepatosit. Lobus hati terbentuk dari sel parenkimal dan sel non-parenkimal.Sel parenkimal pada hati disebut hepatosit, menempati sekitar 80% volume hati dan
11 melakukan berbagai fungsi utama hati. 40% sel hati terdapat pada lobus sinusoidal (Kmiec, 2001).
Lumen lobus terbentuk dari SEC dan ditempati oleh 3 jenis sel lain, seperti sel Kupffer, sel Ito, limfosit intrahepatik seperti sel pit. Sel non-parenkimal menempati sekitar 6,5% volume hati dan memproduksi berbagai substansi yang mengendalikan banyak fungsi hepatosit. Hati juga berperan dalam sistem kekebalan dengan banyaknya sel imunologis pada sistem retikuendotelial yang berfungsi sebagai tapis antigen yang terbawa ke hati melalui sistem portal hati. Perpindahan fase infeksi dari fase primer menjadi fase akut, ditandai oleh hati dengan menurunkan sekresi albumin dan menaikkan sekresi fibrinogen. Fasa akut yang berkepanjangan akan berakibat pada simtoma hipoalbuminemia dan hiperfibrinogenemia (Ballmer and Studer, 1994).
Sebagai kelenjar hati menghasilkan empedu (cairan kehijauan yang terasa pahit) yang berasal dari sel darah merah yang telah rusak atau mati. Empedu mengandung garam empedu, bilirubin dan biliverdin. Sekresi empedu ini berguna untuk pencernaan lemak. Selain empedu, hati juga menghasilkan sebagian besar asam amino, faktor koagulan (pembeku darah), albumin, angiotensinogen, IGF-1 dan banyak enzim lainnya Delarea et. al. 2010).
Kemampuan hati untuk melakukan regenerasi merupakan suatu proses yang sangat penting agar hati dapat pulih dari kerusakan yang ditimbulkan dari proses detoksifikasi dan imunologis. Regenerasi tercapai dengan interaksi yang sangat kompleks antara sel yang terdapat dalam hati, antara lain hepatosit, sel Kupffer, sel endotelial sinusoidal, sel Ito dan sel punca; dengan organ ekstra-hepatik, seperti kelenjar tiroid, kelenjar adrenal, pankreas, duodenum, hipotalamus (Galun and Axelrod, 2002).
Hati merupakan organ yang menopang kelangsungan hidup hampir seluruh organ lain di dalam tubuh. Oleh karena lokasi yang sangat strategis dan fungsi multi-dimensional, hati menjadi sangat rentan terhadap datangnya berbagai penyakit. Hati akan merespon berbagai penyakit tersebut dengan meradang, yang disebut hepatitis. Seringkali hepatitis dimulai dengan reaksi radang patobiokimiawi yang disebut fibrosis hati.(Sebastiana, 2009). Untuk mengetahui adanya kerusakan hati dilakukan beberapa tes darah sederhana seperti uji kadar spartate aminotransferase (AST atau SGOT) dan alanine aminotransferase (ALT atau SGPT). Enzim-enzim ini biasanya terkandung
12 dalam sel-sel hati. Jika hati terluka, sel-sel hati menumpahkan enzim-enzim kedalam darah, menaikan tingkat-tingkat enzim dalam darah dan menandai kerusakan hati.(Ashoka Babu et al., 2012).
2.3. Ginjal
Ginjal adalah organ ekskresi dalam vertebrata yang berbentuk mirip kacang.
Sebagai bagian dari sistem urin, ginjal berfungsi menyaring kotoran (terutama urea) dari darah dan membuangnya bersama dengan air dalam bentuk urin. Ginjal adalah sepasang organ saluran kemih yang terletak di rongga retroperitoneal bagian atas. Bentuknya menyerupai kacang dengan sisi cekungnya menghadap ke medial.
Bagian paling luar dari ginjal disebut korteks, bagian lebih dalam lagi disebut medulla. Bagian paling dalam disebut pelvis. Pada bagian medulla ginjal manusia dapat pula dilihat adanya piramida yang merupakan bukaan saluran pengumpul. Ginjal dibungkus oleh jaringan fibros tipis dan mengkilap yang disebut kapsula fibrosa ginjal dan diluar kapsul ini terdapat jaringan lemak perirenal. Di sebelah atas ginjal terdapat kelenjar adrenal. Ginjal dan kelenjar adrenal dibungkus oleh fasia gerota. Unit fungsional dasar dari ginjal adalah nefron yang dapat berjumlah lebih dari satu juta buah dalam satu ginjal normal manusia dewasa. Nefron berfungsi sebagai regulator air dan zat terlarut (terutama elektrolit) dalam tubuh dengan cara menyaring darah, kemudian mereabsorpsi cairan dan molekul yang masih diperlukan tubuh. Molekul dan sisa cairan lainnya akan dibuang. Reabsorpsi dan pembuangan dilakukan menggunakan mekanisme pertukaran lawan arus dan kotranspor. Hasil akhir yang kemudian diekskresikan disebut urine.
Sebuah nefron terdiri dari sebuah komponen penyaring yang disebut korpuskula (atau badan Malphigi) yang dilanjutkan oleh saluran-saluran (tubulus). Setiap korpuskula mengandung gulungan kapiler darah yang disebut glomerulus yang berada dalam kapsula Bowman. Setiap glomerulus mendapat aliran darah dari arteri aferen. Dinding kapiler dari glomerulus memiliki pori-pori untuk filtrasi atau penyaringan. Darah dapat disaring melalui dinding epitelium tipis yang berpori dari glomerulus dan kapsula Bowman karena adanya tekanan dari darah yang mendorong plasma darah. Filtrat yang dihasilkan akan masuk ke dalan tubulus ginjal.
13 Seperti yang kita ketahui bahwa Ginjal termasuk organ penting yang memiliki fungsi , yaitu menyaring dan mengeluarkan racun maupun kelebihan mineral dari dalam tubuh melalui urin. Jika fungsi ginjal terganggu akibat peradangan atau karena penyakit batu ginjal maka dengan sendirinya tubuh akan mengalami keracunan. Dalam dunia kedokteran, kasus penyakit batu ginjal merupakan penyakit yang relatif tinggi jumlah penderitanya khususnya di Indonesia. Batu ginjal sering disebut nephrolithiasis atau renal calculi merupakan massa keras yang mengkristal seperti batu batu kecil yang dapat terbentuk pada bagian saluran kencing dimana saja termasuk pada kandung kemih, dalam ginjal yaitu di renal pelvis dan calix renalis. Terbentuknya kristalisasi itu karena kadar urine yang terlalu pekat karena kurangnya mengkonsusmsi air putih setiap hari sehingga zat-zat yang ada di dalam urine membentuk kristal batu. Hal-hal lain yang dapat menjadi penyebab batu ginjal adalah adanya infeksi, obstruksi, kelebihan sekresi hormon paratiroid, peningkatan kadar asam urat, terlalu banyak menkonsumsi vitamin D atau kalsium yang tidak larut dengan sempurna (Multaram, 2013).
Selain itu, indikasi adanya kerusakan atau penurunan fungsi ginjal bisa dilihat dari kadar kreatinin plasma yang meningkat. Hal ini sebagai akibat ketidakmampuan ginjal mengeluarkan kreatinin ke dalam urin dan dalam jumlah besar kreatinin masuk kembali ke dalam darah hingga kadarnya dalam plasma meningkat di atas batas normal (Soesanti dan Darmawan, 2009).
2.4. Kolagen
Kolagen adalah salah satu protein yang menyusun tubuh manusia. Keberadaannya adalah kurang lebih mencapai 30% dari seluruh protein yang terdapat di tubuh. Kolagen adalah struktur organik pembangun tulang, gigi, sendi, otot, dan kulit. Serat kolagen memiliki daya tahan yang kuat terhadap tekanan ( Katili, 2009).
Kolagen biasanya di sintesa oleh sel fibroblas, dimana dalam sintesa kolagen tersebut diperlukan vitamin C sebagai koenzim.
Terdapat 29 jenis kolagen namun 90% adalah dari jenis kolagen I, II, III dan 1V.
Kolagen I terdapat pada kulit, tendon, pembuluh darah, ligamen, organ, tulang (komponen utama tulang) dan gigi. Kolagen II: tulang rawan (komponen utama tulang rawan) , mata. Kolagen III: jaringan retikular. Kolagen IV: membentuk jaringan epithel
14 (serat yang melapisi permukaan rongga dan organ seperti ginjal, kantung mata, atau endothelium yang melapisi permukaan dalam pembuluh darah.
Produksi kolagen berkurang sekitar 1.5% setiap tahun setelah usia 25 tahun .Tanda-tanda berkurangnya kolagen dirasakan 10 tahun kemudian. Setelah usia 45-50 tahun, tubuh kita akan kehilangan hampir separuh dari kolagen yang ada. Jadi, semakin tua, semakin berkurang kolagen dalam tubuh . Untuk memenuhi kebutuhan tubuh akan kolagen dapat diperoleh dari makanan untuk mencegah berbagai penyakit seperti osteoarthritis (sakit sendi), osteoporosis, arteriosclerosis selain untuk kegunaan kolagen untuk kosmetik dan pelembab kulit (Anonimus. 2013e).
2.5. Organ Reproduksi Betina
Organ reproduksi betina terdiri atas organ reproduksi primer dan organ reproduksi sekunder. Organ reproduksi primer adalah ovarium sedangkan organ reproduksi sekunder adalah saluran reproduksi yang terdiri dari tuba fallopi (oviduct), uterus, serviks, vagina dan vulva. Fungsi organ sekunder ini adalah menerima dan menyalurkan sel-sel kelamin jantan dan betina, memberi makan dan melahirkan individu baru (Toelihere 1985) .
Ovarium adalah alat reproduksi primer karena berfungsi sebagai penghasil sel telur (ovum) dan hormon. Ukurannya sangat bergantung pada umur dan status reproduksi betina sedangkan bentuknya bervariasi sesuai dengan spesies. Dua komponen pada ovarium yang sangat penting adalah follikel dan korpus luteum (Adelien, 2001).
Hormon yang dihasilkan oleh ovarium adalah estrogen dari sel-sel folikel dan progesteron dari sel-sel korpus luteum. Hormon ini berperan penting dalam menyiapkan alat-alat reproduksi untuk kebuntingan dan memelihara kandungan sampai melahirkan anak. Proses produksi hormon ovarium dikendalikan oleh hormon gonadotrofin dari hipofise seperti : FSH, LH.LTH atau prolaktin yang merangsang pertumbuhan follikel, menyebabkan ovulasi dan pembentukan korpus luteum serta menyebabkan korpus luteum bersekresi (Djanuar 1985).
15 BAB III. METODE PENELITIAN
Tahun I (2014) 3.1 Bahan Penelitian 3.1.1 Rancangan penelitian
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan perlakuan lama injeksi vitamin C dosis tinggi yang berbeda, yaitu lama injeksi 30 hari (P1), lama injeksi 50 hari (P2), dan lama injeksi 70 hari (P3), lama injeksi 90 hari (P4) dan kontrol (P0) serta ulangan 10 kali sehingga hewan model yang dipakai sebanyak 50 ekor.
Tabel 1. Pemberian perlakuan lama injeksi vitamin C dosis tinggi
Perlakuan Pada tikus I II III IV V
Kontrol 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor
Penyuntikan vitamin C selama 30 hari 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor Penyuntikan vitamin C selama 50 hari 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor Penyuntikan vitamin C selama 70 hari 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor Penyuntikan vitamin C selama 90 hari 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor
3.1.2 Bahan penelitian
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah vitamin C dosis tinggi (4000 mg/sekali injeksi) untuk manusia. Hewan model yang digunakan adalah tikus betina dewasa usia 3-4 bulan dengan berat badan antara 200-250 gram. Dosis yang digunakan dikonversikan dari dosis yang digunakan pada manusia ke tikus. Berat badan wanita dewasa yang diinjeksi diperkirakan kurang lebih 50 kg, sehingga dosis vitamin C yang diberikan pada tikus adalah 24 mg/sekali suntik/ ekor.
3.2 Prosedur Penelitian
3.2.1 Perlakuan pada hewan uji
Prosedur penelitian dapat dilihat pada bagan alur penelitian. Sebanyak 50 ekor tikus betina berumur 3–4 bulan diukur berat badan awalnya, diberi diet formula standar dan minum air secara ad libitum serta diaklimatisasi selama 4 minggu, kemudian hewan uji dibagi secara random menjadi 5 kelompok yaitu: P0 = kontrol, kelompok hewan tidak mendapat injeksi vitamin C; P1 = kelompok hewan yang mendapat injeksi vitamin C
16 selama 30 hari; P2 = kelompok hewan yang mendapat injeksi vitamin C selama 50 hari;
P3 = kelompok hewan yang mendapat injeksi vitamin C selama 70 hari; P4 = kelompok hewan yang mendapat injeksi vitamin C selama 90 hari. Injeksi vitamin C dilakukan secara intramuskular dengan jarum suntik ukuran 1 ml. Injeksi dilakukan 2 hari sekali sesuai lama waktu perlakuan
3.2.2. Koleksi Sampel
Setelah perlakuan injeksi vitamin C selesai, tikus dibius dengan penyuntikan xylasin (20 mg/kg) dan ketamin (10 mg/kg) secara intramuskuler. Pada keadaan terbius, darah diambil dari jantung dengan jarum 1 ml kemudian darah dimasukkan dalam tabung yang sudah diisi heparin untuk mencegah pembekuan darah. Darah disentrifuge untuk mendapatkan plasma darah dengan kecepatan 1200 rpm selama 10 menit. Plasma yang didapat dipipet dan ditaruh dalam tabung efendov dan dimasukkan ke dalam refrigenerator sampai siap untuk diuji. Sampel lain seperti kulit, tulang, hati dan ginjal yang akan dibuat sayatan histologis ataupun diuji kolagennya difiksasi terlebih dahulu dalam larutan fiksatif formalin 10%.
3.2.3 Proses pembuatan blok parafin dan preparat histologi
Potogan hati dan ginjal dimasukkan ke dalam tissue casse, kemudian dilakukan proses dehidrasi di dalam larutan etanol bertingkat 70%, 80%, 95%, dan alkohol absolut dua kali pemindahan, kemudian dilanjutkan dengan proses penjernihan (clearing) dengan larutan xilol tiga pemindahan, masing-masing tahap berlangsung selama 60 menit pada suhu kamar. Proses selanjutnya yaitu infiltrasi parafin dengan memasakkan jaringan pada parafin cair (suhu 60ºC) tiga kali pemindahan masing-masing selama 45 menit.
selanjutnya jaringan dibenamkan di dalam cetakan berisi parafin cair, kemudian didinginkan dalam suhu kamar sehingga menjadi blok parafin.
Blok parafin disayat setebal 5µm dengan menggunakan rotary microtome.
kemudian sayatan diletakkan dipermukaan air hangat dengan suhu 45ºc dan ditempelkan pada gelas obyek yang telah dilapisi gelatin. Preparat dikeringkan dengan cara diletakkan secara vertikal, kemudian diletakkan pada slide warmer sampai menempel pada objeck glass.
17 3.2.4. Pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE)
Potongan jaringan dalam parafin yang akan diwarnai dengan hematoxilin-eosin diatur dalam rak untuk pewarnaan, kemudian diinkubasi pada suhu 60ºC selama 45 menit, setelah itu diletakkan pada suhu ruangan sampai dingin. Selanjutnya dilakukan deparafinisasi melalui tahap-tahap pelarutan parafin dalam xilol sebanyak 3 kali, kemudian dilanjutkan dengan proses rehidrasi dalam alkohol bertingkat 100%, 95%, dan 80%, 70%m masing-masing tahap berlangsungselama 5 menit, kemudian dimasukkan dalam akuades selama 10 celup atau sampai alkohol larut.
Proses selanjutnya adalah pewarnaan dalam hematoksilin dengan merendam slide dengan larutan hematoxilin selama 5 menit kemudian dicuci pada pada air mengalir selama 5 menit, dan dilanjutkan dengan pewarnaan menggunakan eosin selama 3 menit, Setelah diwarnai dalam eosin, slide dimasukkan dalam larutan alkohol bertingkat dari 70%, 80%, 90%, sampai 100% masing-masing selama 10 celup., kemudian dilanjutkan dengan proses clearing menggunakan xilol sebanyak dua kali masing-masing selama 2 menit, setelah itu preparat ditutup dengan kaca penutup dengan media balsam kanada.
Dan preparat siap untuk diamati.
3.2.5. Penentuan kadar kolagen kulit dan Tulang
Kulit dan tulang yang akan diuji kadar kolagennya dimasukkan dalam etanol 70%
agar semua lemaknya larut, kemudian dimasukkan dalam oven suhu 70o sampai beratnya konstan. Selanjutnya kulit dan kulang dipotong-potong kecil dan digerus halus sehingga didapatkan bahan kering bebas lemak (BKBL) yang siap untuk diekstrak. Penentuan kadar kolagen dilakukan sesuai dengan yang dilakukan oleh Manalu dan Sumaryadi (1998) dalam Sudatri (2010).
1. Ekstrasi Sampel
Bahan kering bebas lemak (BLBK) dari kulit atau tulang ditimbang sebanyak 25 mg dan dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 5 ml HCl 6 N pada setiap sampel dan ditutup dengan aluminium foil. Tabung reaksi diletakkan pada penangas air 130oC selama 3 jam (air mendidih kurang lebih 5 jam) sampai larutan homogen kuning muda. Jika terjadi penguapan selama pemanasan ditambahkan lagi HCl 6 N sebanyak 5 ml. Hasil ekstrasi dituangkan ke tabung lain dan diukur pHnya. pH harus seragam (6–7)
18 dengan menambahkan NaOH 2 N jika keasaman atau HCl 6 N jika kebasaan.
Selanjutnya dilakukan pencatatan volume akhir sampel.
2. Pewarnaan dan Pengujian
Tabung reaksi diberi label untuk blank, standar dan sampel. Masing-masing tabung diisi reagen seperti pada tabel dibawah, sehingga akan berwarna kuning :
Tabung Diisi
Blank 2 ml H2O
Standar a 2 ml st 400
Standar b 2 ml st 200
.
Standar h 2 ml st 0
Sampel 1 2 ml s-1
Sampel 2 2 ml s-2
.
Sampel 50 2 ml s-50
Selanjutnya ditambahkan pada setiap tabung 1 ml Cloramin-T, dikocok (vortex) dan dibiarkan pada suhu kamar selama 20 menit. Pada setiap tabung ditambahkan lagi 1 ml PCA kemudian dikocok (vortex) dan dibiarkan selama 5 menit. Ditambahkan lagi 1 ml
Selanjutnya ditambahkan pada setiap tabung 1 ml Cloramin-T, dikocok (vortex) dan dibiarkan pada suhu kamar selama 20 menit. Pada setiap tabung ditambahkan lagi 1 ml PCA kemudian dikocok (vortex) dan dibiarkan selama 5 menit. Ditambahkan lagi 1 ml