Tahun I (2014) 3.1 Bahan Penelitian 3.1.1 Rancangan penelitian
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan perlakuan lama injeksi vitamin C dosis tinggi yang berbeda, yaitu lama injeksi 30 hari (P1), lama injeksi 50 hari (P2), dan lama injeksi 70 hari (P3), lama injeksi 90 hari (P4) dan kontrol (P0) serta ulangan 10 kali sehingga hewan model yang dipakai sebanyak 50 ekor.
Tabel 1. Pemberian perlakuan lama injeksi vitamin C dosis tinggi
Perlakuan Pada tikus I II III IV V
Kontrol 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor
Penyuntikan vitamin C selama 30 hari 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor Penyuntikan vitamin C selama 50 hari 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor Penyuntikan vitamin C selama 70 hari 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor Penyuntikan vitamin C selama 90 hari 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor 2 ekor
3.1.2 Bahan penelitian
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah vitamin C dosis tinggi (4000 mg/sekali injeksi) untuk manusia. Hewan model yang digunakan adalah tikus betina dewasa usia 3-4 bulan dengan berat badan antara 200-250 gram. Dosis yang digunakan dikonversikan dari dosis yang digunakan pada manusia ke tikus. Berat badan wanita dewasa yang diinjeksi diperkirakan kurang lebih 50 kg, sehingga dosis vitamin C yang diberikan pada tikus adalah 24 mg/sekali suntik/ ekor.
3.2 Prosedur Penelitian
3.2.1 Perlakuan pada hewan uji
Prosedur penelitian dapat dilihat pada bagan alur penelitian. Sebanyak 50 ekor tikus betina berumur 3–4 bulan diukur berat badan awalnya, diberi diet formula standar dan minum air secara ad libitum serta diaklimatisasi selama 4 minggu, kemudian hewan uji dibagi secara random menjadi 5 kelompok yaitu: P0 = kontrol, kelompok hewan tidak mendapat injeksi vitamin C; P1 = kelompok hewan yang mendapat injeksi vitamin C
16 selama 30 hari; P2 = kelompok hewan yang mendapat injeksi vitamin C selama 50 hari;
P3 = kelompok hewan yang mendapat injeksi vitamin C selama 70 hari; P4 = kelompok hewan yang mendapat injeksi vitamin C selama 90 hari. Injeksi vitamin C dilakukan secara intramuskular dengan jarum suntik ukuran 1 ml. Injeksi dilakukan 2 hari sekali sesuai lama waktu perlakuan
3.2.2. Koleksi Sampel
Setelah perlakuan injeksi vitamin C selesai, tikus dibius dengan penyuntikan xylasin (20 mg/kg) dan ketamin (10 mg/kg) secara intramuskuler. Pada keadaan terbius, darah diambil dari jantung dengan jarum 1 ml kemudian darah dimasukkan dalam tabung yang sudah diisi heparin untuk mencegah pembekuan darah. Darah disentrifuge untuk mendapatkan plasma darah dengan kecepatan 1200 rpm selama 10 menit. Plasma yang didapat dipipet dan ditaruh dalam tabung efendov dan dimasukkan ke dalam refrigenerator sampai siap untuk diuji. Sampel lain seperti kulit, tulang, hati dan ginjal yang akan dibuat sayatan histologis ataupun diuji kolagennya difiksasi terlebih dahulu dalam larutan fiksatif formalin 10%.
3.2.3 Proses pembuatan blok parafin dan preparat histologi
Potogan hati dan ginjal dimasukkan ke dalam tissue casse, kemudian dilakukan proses dehidrasi di dalam larutan etanol bertingkat 70%, 80%, 95%, dan alkohol absolut dua kali pemindahan, kemudian dilanjutkan dengan proses penjernihan (clearing) dengan larutan xilol tiga pemindahan, masing-masing tahap berlangsung selama 60 menit pada suhu kamar. Proses selanjutnya yaitu infiltrasi parafin dengan memasakkan jaringan pada parafin cair (suhu 60ºC) tiga kali pemindahan masing-masing selama 45 menit.
selanjutnya jaringan dibenamkan di dalam cetakan berisi parafin cair, kemudian didinginkan dalam suhu kamar sehingga menjadi blok parafin.
Blok parafin disayat setebal 5µm dengan menggunakan rotary microtome.
kemudian sayatan diletakkan dipermukaan air hangat dengan suhu 45ºc dan ditempelkan pada gelas obyek yang telah dilapisi gelatin. Preparat dikeringkan dengan cara diletakkan secara vertikal, kemudian diletakkan pada slide warmer sampai menempel pada objeck glass.
17 3.2.4. Pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE)
Potongan jaringan dalam parafin yang akan diwarnai dengan hematoxilin-eosin diatur dalam rak untuk pewarnaan, kemudian diinkubasi pada suhu 60ºC selama 45 menit, setelah itu diletakkan pada suhu ruangan sampai dingin. Selanjutnya dilakukan deparafinisasi melalui tahap-tahap pelarutan parafin dalam xilol sebanyak 3 kali, kemudian dilanjutkan dengan proses rehidrasi dalam alkohol bertingkat 100%, 95%, dan 80%, 70%m masing-masing tahap berlangsungselama 5 menit, kemudian dimasukkan dalam akuades selama 10 celup atau sampai alkohol larut.
Proses selanjutnya adalah pewarnaan dalam hematoksilin dengan merendam slide dengan larutan hematoxilin selama 5 menit kemudian dicuci pada pada air mengalir selama 5 menit, dan dilanjutkan dengan pewarnaan menggunakan eosin selama 3 menit, Setelah diwarnai dalam eosin, slide dimasukkan dalam larutan alkohol bertingkat dari 70%, 80%, 90%, sampai 100% masing-masing selama 10 celup., kemudian dilanjutkan dengan proses clearing menggunakan xilol sebanyak dua kali masing-masing selama 2 menit, setelah itu preparat ditutup dengan kaca penutup dengan media balsam kanada.
Dan preparat siap untuk diamati.
3.2.5. Penentuan kadar kolagen kulit dan Tulang
Kulit dan tulang yang akan diuji kadar kolagennya dimasukkan dalam etanol 70%
agar semua lemaknya larut, kemudian dimasukkan dalam oven suhu 70o sampai beratnya konstan. Selanjutnya kulit dan kulang dipotong-potong kecil dan digerus halus sehingga didapatkan bahan kering bebas lemak (BKBL) yang siap untuk diekstrak. Penentuan kadar kolagen dilakukan sesuai dengan yang dilakukan oleh Manalu dan Sumaryadi (1998) dalam Sudatri (2010).
1. Ekstrasi Sampel
Bahan kering bebas lemak (BLBK) dari kulit atau tulang ditimbang sebanyak 25 mg dan dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 5 ml HCl 6 N pada setiap sampel dan ditutup dengan aluminium foil. Tabung reaksi diletakkan pada penangas air 130oC selama 3 jam (air mendidih kurang lebih 5 jam) sampai larutan homogen kuning muda. Jika terjadi penguapan selama pemanasan ditambahkan lagi HCl 6 N sebanyak 5 ml. Hasil ekstrasi dituangkan ke tabung lain dan diukur pHnya. pH harus seragam (6–7)
18 dengan menambahkan NaOH 2 N jika keasaman atau HCl 6 N jika kebasaan.
Selanjutnya dilakukan pencatatan volume akhir sampel.
2. Pewarnaan dan Pengujian
Tabung reaksi diberi label untuk blank, standar dan sampel. Masing-masing tabung diisi reagen seperti pada tabel dibawah, sehingga akan berwarna kuning :
Tabung Diisi
Blank 2 ml H2O
Standar a 2 ml st 400
Standar b 2 ml st 200
.
Standar h 2 ml st 0
Sampel 1 2 ml s-1
Sampel 2 2 ml s-2
.
Sampel 50 2 ml s-50
Selanjutnya ditambahkan pada setiap tabung 1 ml Cloramin-T, dikocok (vortex) dan dibiarkan pada suhu kamar selama 20 menit. Pada setiap tabung ditambahkan lagi 1 ml PCA kemudian dikocok (vortex) dan dibiarkan selama 5 menit. Ditambahkan lagi 1 ml p-dimetilaminobenzaldehide dan dikocok (vortex) dan diletakkan pada penangas air 60oC selama 20 menit. Kemudian didinginkan pada keran air mengalir (tabung direndam dalam wadah berisi air dingin) selama 5 menit. Hasilnya dibaca dengan spektrofotometer Beckman 577 m (hendaknya dilakukan dalam waktu 1 jam). Alat sebelumnya dipanaskan 15 menit dan setiap 25 sampel distandarisasi lagi untuk blanko.
3. Perhitungan
Faktor pengenceran sampel adalah 25 mg BKBL /Vol akhir (pH 6-7) = Z BLBK/ml. Sampel yang digunakan 2 ml = 2 x Z = 3Z mg BKBL.
Misal hasil baca spektrofotometer = Y g
Jadi konsentrasi kolagen sampel = Y/3Z g/mg BKBL.
19 3.2.6. Penentuan Kadar SGOT- SGPT Plasma
Penentuan kadar Serum glutamate oxalloacetate transaminase (SGOT) dan Serum glutamate pyruvate transaminase (SGPT) plasma dilakukan di BPVET FKH UNUD sesuai dengan standar prosedur dengan memakai kit standar (Ashoka Babu V.L et al. 2012).
3.2.7. Penentuan Kadar Kreatin Plasma
Penentuan kadar kreatinin plasma dilakukan di BPVET FKH UNUD diukur dengan spektrofotometer sistem fotometrik berdasarkan metode Daffe (Susanti dan Darmawan, 2009).
3.2.8. Alur Penelitian
Untuk lebih mempermudah dalam pelaksanaan penelitian maka dibuat alur penelitian yang ditunjukkan dengan bagan alur penelitian (gambar 2 dan 3).
Sediaan histologi hati Sediaan histologi ginjal Penentuan kadar SGOT, SGPT dan Kreatin
Kadar Kolagen kulit, tulang
Pemeliharaan hewan, aklimatisasi, berat badan awal Persiapan kandang, vitamin C, zat-zat Kimia
Injeksi vitamin C dosis tinggi sesuai lama perlakuan
Pengamatan Analisis Data
Berat badan akhir, pembedahan, plasma darah, organ hati, ginjal, kulit, tulang
Kemampuan Reproduksi Siklus estrus
Kadar Estrogen,Progesteron Perkembangan embrio Jumlah anak
Tahun I Tahun II
Pengamatan Analisis Data
Gambar 2. Diagram alir penelitian selama 2 tahun
20 Kulit :
Kadar kolagen kulit Kadar kolagen tulang
Pemeliharaan hewan, aklimatisasi, berat badan awal Persiapan kandang, vitamin C, zat-zat Kimia
Injeksi vitamin C dosis tinggi sesuai lama perlakuan
Pengamatan Analisis Data
Berat badan akhir, pembedahan, plasma darah, organ hati, ginjal, kulit, tulang
Ginjal :
Sediaan histologi ginjal Penentuan Kreatin Hati:
Sediaan histologi hati Penentuan kadar:
- SGOT - SGPT
Kadar kolagen kulit, tulang ? Histologis hati?
Kadar SGOT, SGPT plasma?
Histologis ginjal ? Kadar kreatin plasma ?
Gambar 3. Diagram alir Pelaksanaan Penelitian tahun pertama
3.3 Analisis Data
Data yang didapatkan dianalisis secara statistika dengan ANOVA menggunakan software SPSS dan bila terdapat pengaruh nyata atau sangat nyata akan dilanjutkan dengan uji Duncan pada taraf 0.05 dan 0.01.
21 Tahun ke-2 (2014)
Pada tahun ke 2 dilakukan uji profil kadar Estrogen, Progesteron, serta kemampuan reproduksi tikus betina. Hal ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan reproduksi tikus betina yang sudah diinjeksi vitamin C dosis tinggi dengan melihat panjang siklus estrusnya, melihat perkembangan embrio serta jumlah anak yang dihasilkan oleh tikus betina yang mendapatkan injeksi vitamin C dosis tinggi dalam jangka wangku yang lama.
TARGET ATAU INDIKATOR KEBERHASILAN
Dengan melakukan penelitian ini diharapkan bisa mendapatkan gambaran tentang efek samping injeksi vitamin C dosis tinggi dalam jangka waktu yang lama terhadap kesehatan tubuh. Target tahun pertama yaitu melihat gambaran histologi dari hati, ginjal, menentukan kadar SGOT, SGPT, kreatin serta kadar kolagen kulit dan tulang. Tahun kedua menentukan kemampuan reproduksi dari tikus betina tersebut melalui siklus estrus, profil estrogen, progesteron perkembangan embrio serta jumlah anak yang dihasilkan.
Adapun garis besar penelitian selama 2 tahun tercantum pada Tabel 2.
Tabel 2. Tabel indikator pencapaian
Tahun Pertama Luaran Indikator capaian
Histologi hati Kerusakan sel hati
Histologi ginjal Kerusakan sel ginjal,terbentuknya batu ginjal
Kadar SGOT, SGPT Peningkatan kadar SGOT, SGPT
Kadar Kreatin Peningkatan kadar kreatin
Kadar Kolagen Peningkatan kadar kolagen
Tahun Kedua Luaran Indikator capaian
Siklus estrus Perpanjangan Siklus estrus
Perkembangan Embrio Aborsi, cacat embrio
Jumlah Anak Penurunan jumlah anak
Profil Estrogen,
progesterone
Penurunan kadar estrogen, progesteron
22