Abstrak
Teknologi rekayasa genetika telah tumbuh begitu cepat dan telah diterapkan pada berbagai organisme. Gen Inhibitor of Meristem Activity (IMA) merupakan salah satu gen yang berperanan dalam proses pertumbuhan dan perkembangan yang terdapat pada meristem pucuk tanaman. Gen IMA juga dapat mengontrol proses pembungaan pada tumbuhan. Teknik rekayasa genetika telah digunakan untuk kloning gen IMA tersebut. Gen IMA telah diisolasi dari tanaman tomat (Solanum lycopersicum L.). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk kloning gen
IMA dengan menggunakan metode yang lebih terarah dan lebih cepat yaitu metode gateway. Gen IMA selanjutnya ditransformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404. Kloning gen IMA ke dalam vektor donor, vektor tujuan, dan A. tumefaciens telah berhasil dilakukan yang menghasilkan ukuran pita DNA 500 pb pada elektroforesis menggunakan 1% gel agarosa. Hasil penelitian yaitu gen IMA berhasil dimasukkan ke dalam vektor ekspresi dengan menggunakan metode gateway dan terintegrasi dalam A. tumefaciens strain LBA4404.
Pendahuluan
Bioteknologi merupakan suatu bidang ilmu dalam biologi terapan yang melibatkan penggunaan organisme hidup dan bioproses untuk menciptakan suatu produk demi kepentingan manusia. Bioteknologi modern, atau sering disebut juga rekayasa genetika, telah berkembang sangat pesat dalam dua dasawarsa terakhir ini. Teknik rekayasa genetika telah banyak diaplikasikan dalam berbagai bidang, misalnya penelitian, medis, rekayasa genetika hewan, dan rekayasa genetika tanaman (Owen-Smith dan Powell 2004).
Rekayasa genetika tanaman adalah suatu teknik untuk memindahkan gen spesies asing ke dalam suatu sel tanaman, yang diikuti dengan regenerasi dari sel- sel tanaman tersebut sehingga menjadi tanaman lengkap. Teknik ini telah diterapkan pada berbagai tanaman pangan dan nonpangan. Rekayasa genetika sebenarnya merupakan kelanjutan dari pemuliaan tanaman yang telah dilakukan oleh petani secara tradisional. Rekayasa genetika memungkinkan pemindahan satu atau beberapa gen yang dikehendaki dari satu tanaman ke tanaman lainnya yang tidak mungkin terjadi dalam pemuliaan tanaman secara tradisional.
Prinsip rekayasa genetika sama dengan pemuliaan tanaman, yaitu memperbaiki sifat-sifat tanaman dengan menambahkan sifat-sifat yang dibutuhkan maupun sifat-sifat toleransi atau ketahanan terhadap kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan. Proses rekayasa genetika telah berhasil mengembangkan berbagai spesies tanaman baru dengan ketahanan terhadap organisme pengganggu, seperti serangga, penyakit, dan gulma yang sangat merugikan tanaman. Contoh tanaman yang telah berhasil direkayasa adalah jagung, kapas, kedelai, tomat, dan kelapa sawit.
19 Gen IMA yang berasal dari tomat (Solanum lycopersicum L) merupakan gen yang dapat mengendalikan pertumbuhan dan perkembangan meristem. Upaya konstruksi vektor agar gen IMA dapat disisipkan ke dalam tanaman sebelumnya sudah pernah dilakukan dengan menggunakan metode pengklonan biasa dengan prosedur yang cukup rumit dan waktu yang cukup lama. Konstruksi gen pada penelitian ini menggunakan teknologi gateway. Teknologi gateway adalah suatu metode kloning universal yang berdasarkan rekombinasi situs spesifik pada bakteriofag lambda (Nunes-Düby et al. 1989). Teknologi gateway memungkinkan pemindahan secara cepat dan efisien sekuen DNA ke dalam beberapa vektor untuk dilakukan analisis fungsional dan ekspresi protein (Hartley et al. 2000).
Penelitian ini bertujuan mengonstruksi vektor ekspresi gen IMA dengan metode yang lebih cepat dan terarah, yaitu metode gateway. Gen IMA yang telah tersisipkan dalam vektor kloning selanjutnya ditransformasikan ke dalam A. tumefaciens. Hipotesis penelitian ini adalah gen IMA yang telah dikonstruksi pada vektor ekspresi dengan metode gateway bisa disisipkan ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404 dan selanjutnya dapat diekspresikan pada tanaman. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan A. tumefaciens LBA4404 yang membawa gen IMA sens maupun antisens, serta memberikan informasi mengenai metode gateway sebagai teknologi rekombinasi gen yang cepat dan mudah.
Gen IMA disisipkan ke dalam vektor ekspresi dengan dua orientasi yaitu sens dan antisens. Orientasi sens searah dengan promoter sedangkan orientasi antisens berlawanan arah terhadap promoter. Manfaat dari konstruksi sens dan antisens yaitu untuk membandingkan peranan ekspresi gen apabila dalam kondisi ekspresi berlebih atau peranannya dalam genom bila terjadi pembungkaman ekspresi gen melalui konstruksi antisensnya.
Bahan dan Metode Bahan
Bahan yang digunakan dalam proses amplifikasi adalah kit dari Invitrogen, gen Inhibitor of Meristem Activity (IMA), primer spesifik gateway IMA-Forward, primer spesifik Gateway IMA-reverse, larutan buffer PCR 10x, MgCl2, dNTPs,
Taq polimerase, dan molecular water (MW).
Bahan yang digunakan dalam elektroforesis yaitu gel agarosa (Fermentas), larutan bufer Tris-Borat-EDTA (TBE) 0.5x, etidium bromida (EtBr) 5 L/100 mL, loading buffer (bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Ekstraksi dan purifikasi gel menggunakan kit dari Invitrogen (PureLinkTM Quick Gel Extraction).
Bahan yang digunakan dalam proses rekombinasi adalah kit Gateway® Technology dari Invitrogen (vektor pDONRTM, vektor destinasi, enzim BP ClonaseTM
, enzim proteinase K, enzim LR ClonaseTM). Tahap transformasi ke
dalam sel kompeten menggunakan sel kompeten Escherichia coli DH5α dan media Luria Agar (LA). Isolasi DNA plasmid menggunakan kit dari Fermentas (Gene JETTM Plasmid MiniPrep Kit).
Tahap transformasi ke dalam Agrobacterium menggunakan sel kompeten A. tumefaciens galur LBA4404 dan media Yeast Extract Pepton (YEP). Bahan lainnya yang digunakan adalah primer M13-F, primer M13-R, larutan buffer 10x.
20
Metode
Amplifikasi Fragmen Gen IMA
Gen IMA yang telah diisolasi dari tanaman tomat (Solanum lycopersicum
L.) pada penelitian sebelumnya diamplifikasi menggunakan alat PCR dan kit dari Invitrogen. Amplifikasi tersebut menggunakan sepasang primer spesifik gateway
(gateway IMA-forward dan gateway IMA-reverse)agar dapat disisipkan pada situs pengklonan pDONR. Primer Gateway IMA sens forward (5‟-GGGGAG- CAGGCTAGATGAGAGGAGAAATGATTACTC-3‟) dan primer Gateway IMA
sens reverse adalah (5‟-GGGGAGAAAGCTGGGTATCATTTAGTAGAAGAA-
CGAAG-3‟). Primer Gateway IMA antisens forward (5‟-GGGGAGCAGGCTA- GTCATTAGTAGAAGAAGCGGAAG-3‟) dan primer gateway IMA antisens
reverse (5‟-GGGGAGAAAGCTGGGTAATGAAGAGCAGAAATGATTACTC-
3‟). Selanjutnya produk PCR dielektroforesis pada agarosa 1% (b/v) dan dipurifikasi dengan Gel DNA fragments extraction Kit-Geneaid.
Penyisipan Fragmen Gen IMA ke Dalam Vektor pDONR
Fragmen gen IMA direaksikan dengan plasmid pDONR sesuai dengan protokol dari Invitrogen (USA) (Gambar 9). Rekombinasi gen IMA pada vektor donor dimulai dengan menyiapkan sebanyak 2 µL (150 ng/µ L) DNA hasil purifikasi, 1 µL vektor donor (150 ng/µl pDONRTM 221), dan ditambahkan larutan buffer Tris-EDTA (TE, pH 8.0) sampai volumenya menjadi 8 µL. Enzim
BP clonaseTM ditambahkan terakhir sebanyak 2 µL, kemudian diinkubasi pada suhu 25 oC selama 2 jam. Setelah inkubasi selesai ditambahkan 1 µL enzim
proteinase K (2 µg/µ L), lalu diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15 menit. Hasil rekombinasi pada vektor donor tersebut diambil sebanyak 5 µL kemudian ditransformasikan ke E.coli dengan metode kejut panas (heat shock) untuk menggandakan plasmid yang telah membawa gen IMA. Metode kejut panas dimulai dengan melakukan proses sub kultur bakteri yaitu mengkulturkan satu koloni bakteri E. coliDH5α menggunakan tusuk gigi steril ke dalam tabung reaksi
berisi 2 ml media LB cair tanpa antibiotik (lampiran 1). Selanjutnya bakteri diinkubasi 12-16 jam pada suhu 37 °C dengan penggoyangan pada 200-250 rpm. Kemudian 100 µl biakan bakteri ditumbuhkan pada 10 ml LB pada suhu 37 °C selama 2-3 jam hingga mencapai OD600 = 0.4-0.5. Kemudian dimasukkan ke
dalam es selama 10 menit.
Selanjutnya sebanyak 1.5 ml biakan bakteri dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm, 4 °C selama 10 menit. Cairan dibuang dan endapan bakteri disuspensikan dengan perlahan dalam 495 µl Transformation Buffer (TFB) mengandung (3 g pipes 10 mM, 2.2 g CaCl2.H2O, 18.2 g KCL 250 mM, 10.9 g MnCl2.4H2O 55 mM, 950 ml H2O, pH
6.7 dengan penambahan KOH dan ditambah H2O). Suspensi bakteri disimpan
dalam es selama 10 menit kemudian disentrifugasi pada 5000 rpm, 4 °Cselama 10 menit. Cairan dibuang, lalu endapannya disuspensikan dalam 125 µl TFB di dalam tabung eppendorf. Kemudian ditambahkan 88 µl DMSO dan segera disimpan dalam es selama 10 menit. Sebanyak 10 µl mix ligasi ditambah dengan 50 µl sel kompeten dicampur dan dibolak-balik secara perlahan, kemudian diinkubasi 30 detik di dalam es dan dengan cepat langsung dimasukkan ke dalam
21 suhu 42 °C selama 45 detik kemudian dimasukkan kembali ke dalam es selama 5 menit. Setelah itu, ditambah 100 µl medium 2YT kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C dengan penggoyangan. Sel bakteri tersebut kemudian disebar pada media LA yang mengandung antibiotik kanamisin dan diinkubasi semalam pada suhu 37 °C.
Koloni bakteri E. coli yang tumbuh pada media Luria Agar dikonfirmasi dengan metode PCR koloni. DNA plasmid koloni bakteri rekombinan tersebut selanjutnya diisolasi untuk direkombinasikan ke dalam vektor destinasi.
Plasmid rekombinan sebanyak 2 µL (50-150 ng) dimasukkan ke dalam tabung mikro dan ditambahkan 1 µL (150 ng/µL) vektor destinasi kemudian larutan buffer (TE pH 8.0) ditambahkan sampai volume menjadi 8 µL. Enzim LR Clonase ditambahkan terakhir sebanyak 2 µL, kemudian diinkubasi pada suhu 25
o
C selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, ditambahkan 1 µL enzim proteinase K
(2 µg/µ L), lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 10 menit. Hasil rekombinasi diambil sebanyak 5 µL kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli. DNA plasmid koloni bakteri yang tumbuh diisolasi lalu dikonfirmasi dengan metode PCR. Plasmid rekombinan selanjutnya ditransformasikan ke dalam E. coli.
Gambar 9 Peta genetik pDONRTM221 dengan penanda seleksi gen ketahanan terhadap kanamisin
Introduksi Vektor pDONR Rekombinan ke Dalam Bakteri E. coli
Vektor pDONR rekombinan diintroduksi ke dalam sel kompeten E. coli
strain DH5α dengan transformasi kejut panas pada suhu 42 °Cselama 45 detik (Sambrook et al. 1989). Koloni yang tumbuh pada media Luria Agar yang mengandung 50 mg/L kanamisin diambil untuk PCR koloni. PCR dilakukan dengan mengambil koloni menggunakan tusuk gigi kemudian disuspensikan ke dalam 5 µL ddH2O, kemudian suspensi dipanaskan pada 95 °C selama 10 menit
dan didinginkan pada suhu 15 °C selama 5 menit. Suspensi ini digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR (Suharsono et al. 2008)
Kondisi PCR koloni dilakukan pada suhu 95 °C selama 5 menit untuk pra PCR, 94 °C selama 30 menit untuk denaturasi, 52 °C selama 30 menit untuk penempelan primer, 72 °C selama 1 menit untuk pemanjangan nukleotida dan 72 °Cselama 5 menit untuk pasca PCR, proses PCR dilakukan sebanyak 35 siklus. PCR menggunakan primer M13 forward (5‟-GTAAAACGACGGCCAG-3‟) dan primer M13 reverse (5‟-CAGGAAACAGCTATGAC-3‟).
22
Plasmid pDONR rekombinan IMA diisolasi dan dipurifikasi menggunakan
high-speed plasmid mini kit-Geneaid dari koloni yang mengandung pDONR rekombinan.
Pengklonan Vektor pDONR Rekombinan dengan Vektor pGWB402
Plasmid pDONR rekombinan IMA digunakan untuk reaksi LR dengan plasmid biner pGWB402 sesuai dengan protokol gateway cloning (Invitrogen, USA).
Introduksi Vektor pGWB402-IMA ke dalam Bakteri E. coli
Hasil LR reaksi diintroduksi ke dalam E. coli strain DH5α dengan metode transformasi kejut panas pada suhu 42 °C selama 45 detik. Koloni yang mengandung plasmid pGWB402-IMA diverifikasi dengan PCR koloni menggunakan primer 35S forward dan primer IMA reverse. Koloni yang positif mengandung plasmid pGWB402-IMA sens dan antisens diisolasi DNA plasmidnya menggunakan high-speed plasmid mini kit-Geneaid.
Introduksi pGWB402-IMA ke dalam A. tumefaciens LBA4404
Vektor ekspresi pGWB402-IMA yang ada di dalam plamid E. coli DH5α
selanjutnya dimasukkan ke dalam A. tumefaciens LBA4404 menggunakan alat elektroporator. Tahap awal persiapan elektroporator adalah menyiapkan bakteri kompeten A. tumefaciens LBA4404. Bakteri kompeten 50 µl dicampur dengan 5 µl DNA plasmid yang membawa pGWB402-IMA sens maupun antisens (25-50 ng/µl) kemudian diberi kejutan listrik sebesar 2.5 kV, 400 Ω. Selanjutnya hasil elektroporator disebar pada media LA yang mengandung 100 mg/L streptomisin, 50 mg/L spektinomisin dan 50 mg/L kanamisin. Koloni yang tumbuh diperbanyak dan plasmidnya kemudian diisolasi menggunakan high-speed plasmid mini kit- Geneaid. Identifikasi keberhasilan elektroporasi menggunakan metode PCR koloni menggunakan primer spesifik 35S-F dan primer IMA-R.
Hasil dan Pembahasan
Konstruksi Vektor Ekspresi untuk Ekspresi Berlebih Gen IMA
Desain primer gateway yang spesifik merupakan tahap awal dalam konstruksi vektor. Primer yang digunakan yaitu gateway IMA-forward dan
gateway IMA-reverse dirancang khusus untuk metode gateway. Primer merupakan suatu polimer asam nukleat pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA template. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi. Fragmen gen IMA sens dan antisens telah berhasil diamplifikasi dengan primer spesifik. Primer dirancang berdasarkan sekuen gen IMA yang berasal dari tanaman tomat, pada penelitian sebelumnya. Rancangan tersebut adalah penambahan empat basa nukleotida Guanina (GGGG), diikuti situs attachment Bacterial atau attB (pada ujung
forward dan reverse), kemudian ditambahkan 18-25 urutan basa nukleotida spesifik gen IMA sens dan antisens (Invitrogen 2003). Situs attB disebut sebagai tempat pengikatan lambda (lambda attachment site), yaitu tempat integrasi DNA lambda ke dalam kromosom E. coli.
23 Hasil reaksi PCR yang menggunakan primer spesifik gateway
diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli DH5α dengan teknik transformasi
kejutan panas (heat shock). Koloni rekombinan diseleksi pada media yang mengandung 50 mg/L antibiotik kanamisin. Koloni rekombinan diverifikasi dengan PCR koloni menggunakan primer M13 forward dan reverse. Koloni yang mengandung pDONR-IMA menghasilkan DNA amplikon berukuran ~300 pb (Gambar 10). Fragmen tersebut telah direaksikan dengan vektor pDONR.
Gambar 10 Hasil PCR fragmen gen IMA menggunakan primer yang ditambah situs primer spesifik Gateway IMA forward dan reverse. M: Marker 100 bp, 1: pita gen IMA sens, 2: pita gen IMA antisens
Plasmid pDONR-IMA digunakan untuk reaksi rekombinasi yang menggunakan LR clonase. Hasil reaksi digunakan untuk bahan transformasi ke bakteri E. coli DH5α dengan teknik heat shock. Isolasi DNA plasmid dilakukan untuk memverifikasi keberhasilan rekombinasi antara pDONR-IMA. Selanjutnya dilakukan PCR menggunakan primer spesifik gen IMA forward dan primer IMA reverse.
Vektor ekspresi untuk gen IMA sens dan antisens yaitu pGWB402 memiliki marka seleksi berupa gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin (nptII) pada daerah T-DNA. Gen IMA pada vektor ini diregulasi oleh promoter konstitutif 35S CaMV. PCR mengamplifikasi daerah 35S dan IMA sebesar ~500 pb (Gambar 11 A dan B). Gen target terintegrasi pada daerah yang diapit oleh sekuen attL1 dan attL2 pada vektor pDONR.
300 pb
24
Gambar 11 Fragmen gen IMA dari plasmid pGWB402-IMA sens (A) dan pGWB402-IMA antisens (B)
Perakitan vektor ekspresi ini dilakukan dengan teknik kloning gateway dengan prinsip rekombinasi dua vektor yaitu pDONR sebagai vektor donor dan pGWB402 sebagai vektor penerima. Gateway cloning dapat dilakukan dengan dua macam enzim yang sesuai dengan sekuen homolog pada kedua vektor. Rekombinasi antara vektor pDONR-IMA dan pGWB402 menggunakan enzim LR clonase, sehingga gen IMA yang berada di antara sekuen attL1 dan attL2 dapat berpindah ke vektor pGWB402 pada daerah ccdB yang diapit daerah attR1 dan attR2. Teknik gateway cloning ini memudahkan dalam seleksi vektor ekpresi rekombinan (pGWB402-IMA). Bakteri E. coli DH5α yang tersisipi pGWB402 non rekombinan akan mati karena ccdB akan mengekspresikan protein yang bersifat toksin terhadap E. coli DH5α. pGWB402 rekombinan akan tumbuh, karena sekuen ccdB telah tergantikan oleh sekuen gen IMA.
Introduksi Vektor Rekombinan pGWB402-IMA ke dalam A. tumefaciens
LBA4404
Transformasi menggunakan elektroporator sangat membantu mempercepat proses introduksi vektor rekombinan hasil konstruksi ke bakteri A. tumefaciens.
Proses ini diawali dengan penyiapan bakteri A. tumefaciens kompeten dan DNA plasmid pembawa vektor rekombinan. Seleksi A. tumefaciens LBA4404 yang membawa pGWB402-IMA sens dan antisens menggunakan media yang mengandung antibiotik 100 mg/L streptomisin, 50 mg/L spektinomisin dan 50 mg/L kanamisin. Vektor pGWB402 memiliki gen ketahanan terhadap kanamisin (nptII) pada daerah T-DNA dan spektinomisin (Spcr) di luar daerah T-DNA. A. tumefaciens yang mengandung pGWB402-IMA dapat tumbuh pada media LA yang mengandung streptomisin, kanamisin dan spektinomisin. pGWB402 memiliki gen ketahanan kanamisin (nptII) dan spektinomisin (Spcr) (Gambar 9). Konfirmasi bakteri A. tumefaciens yang membawa pGWB402 IMA sens dan antisens dilakukan dengan cara PCR koloni. Populasi koloni yang ditumbuhkan pada media LA yang mengandung antibiotik kanamisin diambil sebanyak delapan koloni untuk A. tumefaciens dengan IMA sens dan delapan koloni dengan IMA antisens (Gambar 13). Setelah dilakukan PCR koloni maka diperoleh pita-pita DNA yang berukuran ~500 pb. Ukuran pita yang diperoleh dari hasil PCR mengindikasikan gen IMA sens dan antisens telah tersisipi dalam A. tumefaciens
M 2
A
M
25 LBA4404. Pemilihan koloni yang akan dijadikan bahan transformasi ke tanaman berdasarkan ketebalan pita. Koloni yang dipilih untuk A. tumefaciens LBA4404 IMA sens yaitu koloni nomor tujuh pada media template dan untuk koloni A. tumefaciens LBA440 antisens dipilih koloni nomor 16 (Gambar 12). Koloni A. tumefaciens yang terseleksi dikonfirmasi dengan PCR koloni menggunakan primer 35S forward dan IMA reverse menghasilkan ukuran pita 500 pb baik pada DNA plasmid A. tumefaciens IMA sens maupun antisens (Gambar 13). Kondisi PCR koloni yaitu suhu 95 °C selama 5 menit untuk pra PCR, 94 °C selama 30 menit untuk denaturasi, 52 °C selama 30 menit untuk penempelan primer, 72 °C selama 1 menit untuk pemanjangan nukleotida dan 72 °C selama 5 menit untuk pasca PCR, proses PCR dilakukan sebanyak 35 siklus. Hasil PCR dikonfirmasi dengan elektroforesis pada media agarosa 1% (b/v), diwarnai menggunakan
Ethidium bromide (EtBr) kemudian divisualilasi menggunakan sinar UV. Ukuran pita yang diperoleh pada PCR koloni menunjukkan ukuran yang sama dengan pita pada saat konstruksi gen pada vektor ekspresi pGWB402.
Gambar 12 Koloni A. tumefaciens strain LBA4404+IMA sens (no. 1-8) dan antisens (no. 9-16). Koloni yang terpilih tunjukkan dengan panah hitam
Gambar 13 Hasil PCR menggunakan primer 35S CaMV forward dan primer
IMA reverse terhadap plasmid A. tumefaciens LBA4404 sens (A) dan antisens (B) setelah perlakuan elektroporator
1 2
26
Visualisasi hasil PCR tersebut menunjukkan hasil yang positif bahwa A. tumefaciens telah membawa DNA plasmid pGWB402 yang mengandung gen
IMA sens maupun antisens. Konstruksi vektor ekspresi menunjukkan posisi gen
IMA sens maupun antisens diapit oleh promoter 35 S dan nptII. Gen penanda seleksi ditempatkan dibelakang gen target agar memudahkana melacak gen target dalam genom tanaman (Gambar 14).
Gambar 14 Peta genetik vektor ekspresi gen IMA sens dan antisens setelah konstruksi
Simpulan
Fragmen gen IMA yang berasal dari tanaman tomat dapat diklon dan disisipkan pada vektor ekspresi A. tumefaciens LBA4404. Diperoleh dua hasil konstruksi gen yaitu A. tumefaciens LBA4404 yang mengandung pGWB402-IMA sens dan A. tumefaciens LBA4404 yang mengandung pGWB402-IMA antisens. Ukuran pita yang diperoleh setelah PCR menggunakan primer 35S CaMV sebagai
forward dan IMA reverse yaitu ~500 pb.
27
