BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.4 Kromatografi
Kromatografi adalah suatu metode yang digunakan untuk pemisahan komponen cuplikan yang komponen-komponenya terdistribusi antara dua fase, salah satunya diam dan yang lainnya bergerak. Saat ini, kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif (analitik) maupun kuantitatif dan preparatif dalam bidang farmasi (Rohman, 2007).
2.4.1 Kromatografi lapis tipis
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau proses reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom, melakukan screening sampel untuk obat (Gritter, et al., 1991)
Fase diam pada KLT sering disebut penyerap, walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Ukuran partikel penyerap KLT biasanya lebih kecil dari 63 µm (Gritter, et al., 1991). Banyak penyerap yang telah digunakan, termasuk silika gel, selulosa, aluminium oksida, poliamid dan silika gel dengan ikatan kimia rangkap, dengan ketebalan sekitar 0,10 sampai 0,25 mm, didukung oleh plat kaca, alumunium atau plastik (Wall, 2005). Kromatografi lapis tipis-kinerja tinggi atau High Performance-Thin Layer Chromatography (HPTLC) menghasilkan pemisahan dan hasil analisis yang lebih baik dibanding dengan KLT biasa. Kelebihan KLTKT dibanding dengan KLT terletak pada fase diamnya, yang mana pada KLTKT digunakan fase diam berukuran halus dan pori-porinya seragam serta mempunyai ketebalan lapisan 0,1
mm. Ukuran partikel fase diam yang lebih kecil ini akan menyebabkan semakin besarnya jumlah lempeng teoretis (N), karenanya pemisahan menjadi lebih efisien (Rohman, 2009).
Fase gerak adalah medium angkut, terdiri dari satu atau beberapa pelarut, yang bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori karena adanya gaya kapiler (Stahl, 1985). Pemilihan sistem pelarut yang dipakai didasarkan atas prinsip like dissolve like, artinya untuk memisahkan sampel yang bersifat non polar digunakan sistem pelarut yang bersifat non polar juga. Proses pengembangan akan lebih baik bila ruangan pengembangan tersebut telah jenuh dengan uap sistem pelarut (Adnan, 1997).
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan harga Rf atau hRf. Harga Rf didefenisikan sebagai perbandingan antara jarak titik pusat bercak dari titik awal dan jarak garis depan dari titik awal.
Rf = jarak ti tik pusat bercak dari titik awal
jarak garis depan pelarut dari titik awal
Harga Rf berkisar antara 0,00 sampai 1,00 dan dituliskan dua desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 sampai 100. Jika dipilih 10 cm sebagai jarak pengembangan, maka jarak rambat suatu senyawa (titik awal-pusat bercak dalam cm) x 10 menghasilkan angka hRf (Stahl, 1985).
Pada TLC (Thin Layer Chromatography) dengan metode pengembangan berganda dimana garis depan pelarut tidak dapat diukur maka dapat dipakai harga Rx sebagai jarak pengembangan senyawa.
Rx = jarak tempuh sampel
Harga Rx dapat lebih besar daripada 1. Tidak satupun dari harga Rf atau Rx yang mempunyai harga konstan tetapi harga Rx lebih reproducible daripada harga Rf (Fried dan Sherma, 1999).
Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf pada KLT, antara lain: struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan, sifat dari penyerap, dan derajat aktivitasnya, tebal dan kerataan lapisan penyerap, derajat kemurnian fase gerak, derajat kejenuhan uap pengembang pada bejana, jumlah cuplikan dan suhu (Sastrohamidjojo, 1991).
2.4.2 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) merupakan suatu metode pemisahan dengan biaya murah dan sederhana. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram.Ketebalan penyerap yang paling sering dipakai adalah 0,5 - 2 mm. Ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm. Penyerap yang paling umum adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Untuk pembuatan lapisan tanpa retak dianjurkan memakai penyerap niaga yang tersedia. Ukuran partikel dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran tingkat mutu KLT. Pada KLTP cuplikan ditotolkan berupa pita sesempit mungkin karena pemisahan bergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan tangan atau pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan berulang. Jika pemisahan telah dicapai, plat
dikeringkan dan kemudian dimasukkan lagi ke dalam bejana. Bergantung pada nilai Rf pita, proses ini dapat diulang beberapa kali. Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap sinar UV. Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung yang disambungkan ke pengumpul vakum. Senyawa diekstraksi dari penjerap dengan pelarut polar (sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap). Ekstrak disaring melalui ‘frit’ kaca berkeporian 4 dan kemudian melalui membran 0,2 - 0,45 µm (Hostettmann, dkk., 1995).
2.4.3 Kromatografi Lapis Tipis Dua Arah
KLT dua arah atau dua dimensi bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama sehingga nilai Rf juga hampir sama. Selain itu, dua sistem fase gerak yang sangat berbeda polaritasnya dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama. Penotolan dilakukan di salah satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya sebagaimana biasa dengan eluen pertama, kemudian lempeng kromatografi dikeluarkan dari chamber pengembang dan eluen dibiarkan menguap dari lempeng. Selanjutnya lempeng dimasukkan dalam chamber yang menggunakan eluen kedua sehingga pengembangan yang terjadi pada arah kedua tegak lurus dengan arah pengembangan yang pertama (Rohman, 2009).
2.4.4 Kromatografi Kolom
Penggunaan kolom besar merupakan metode kromatografi untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Campuran yang akan dipisahkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap. Fase gerak dialirkan melalui kolom oleh gaya berat atau tekanan. Pita campuran bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi (Gritter, dkk., 1991)
Ukuran partikel penyerap untuk kolom dengan gaya tarik bumi biasanya lebih besar daripada untuk KLT, yaitu 63-250 µm; sedangkan untuk kolom dengan tekanan biasanya lebih kecil daripada untuk KLT (Gritter, dkk., 1991; Hostettman, dkk., 1995).
Karena memerlukan waktu yang lama dan bahan yang cukup banyak, perlu dipastikan campuran pelarut yang terbaik untuk pemisahan. Masalah ini dapat dipecahkan melalui tiga pendekatan, antara lain, penelusuran pustaka, penerapan data KLT dan pemakaian elusi landaian (Gritter, dkk., 1991).
Fraksi kolom yang mengandung senyawa yang sama (diperiksa dengan KLT) digabungkan, diuapkan dengan tekanan rendah. Jika pelarut dan penyerap murni, maka fraksi-fraksi pun murni. Namun mungkin masih diperlukan penghabluran ulang atau penyulingan kasar untuk memperoleh senyawa murni (Gritter, dkk., 1991)
2.4.5 Kromatografi Cair Vakum
Cara ini pertama kali dipublikasikan oleh Coll, dkk pada tahun 1977 dengan menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek untuk mengisolasi diterpena sembrenoida dari terumbu karang Australia. Kolom
kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dihisap sampai kering dan sekarang siap dipakai.
Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom atau pada lapisan penjerap dan dihisap perlahan-lahan kedalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dari pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi. Oleh karena itu kromatografi cair vakum menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak (Hostettmann, dkk., 1995).