TESIS
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT
(
Hippocampus trimaculatus
Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
Oleh:
DENNY SATRIA
NIM 127014009
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT
(
Hippocampus trimaculatus
Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
Oleh:
DENNY SATRIA
NIM 127014009
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT
(
Hippocampus trimaculatus
Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
Oleh:
DENNY SATRIA
NIM 127014009
Medan, Maret 2014 Menyetujui:
Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. NIP 194908111976031001 NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt. NIP 196602091992031003 NIP 195108161980031002
Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt.
NIP 194908111976031001
Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed.
NIP 196602091992031003
Mengetahui: Disahkan Oleh:
Ketua Program Studi, Dekan,
PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Denny Satria Nomor Induk Mahasiswa : 127014009
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap
Sel MCF-7.
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Rabu tanggal dua belas bulan Februari tahun dua ribu empat belas.
Mengesahkan: Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis : Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt. Anggota Tim Penguji : Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M. Biomed.
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini: Nama Mahasiswa : Denny Satria Nomor Induk Mahasiswa : 127014009 Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap
Sel MCF-7
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan sehat.
Medan, Maret 2014 Yang membuat pernyataan,
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang Maha Kuasa yang telah melimpahkan rahmat, karunia, dan RidhoNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap Sel MCF-7”. Tesis ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister farmasi pada Fakultas Farmasi Universita Sumatera Utara. Shalawat dan salam kepada Rasulullah SAW. Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga kepada:
1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K)., atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Magister.
2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi.
4. Bapak Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt., selaku Pembimbing I yang tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan semangat dengan penuh kesabaran sehingga penulis terpacu untuk menyelesaikan penelitian dan penyelesaian tesis ini.
5. Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed., selaku Pembimbing II yang tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberi saran dan dorongan dengan penuh kesabaran selama penulis menjalani penelitian dan penyelesaian tesis ini.
6. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan bapak Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt., sebagai penguji.
7. Ibu Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi beserta staf.
8. Bapak Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., S.U., Ph.D., Sp.Park., Kepala Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada beserta staf.
9. Bapak Prof. Dr. rer. nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., Kepala Laboratorium Penelitian beserta staf.
10.Bapak dan Ibu Staff Pengajar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah mendidik penulis selama perkuliahan.
abang Abdi Wira Septama, M.Sc., Puji Lestari M.Si., Apt., Vonna Aulianshah, S.Farm., Apt., Mainal Furqan, S.Si., Apt., dan Fitri Yanti, S.Farm., Apt., Ramses Alfredo, S.Farm., Apt, Hendra, Adhli, Faisal, Nevi terima kasih atas motivasinya dan semua pihak yang selalu memberi semangat, saran, dan nasehat.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih banyak kekurangannya, oleh karena itu sangat diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak guna perbaikan tesis ini. Akhir kata penulis berharap semoga tesis ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.
Medan, Maret 2014 Penulis,
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
ABSTRAK
Indonesia adalah bagian dari wilayah Indopasifik, yang merupakan salah satu pusat keanekaragaman biota laut yang terbesar di dunia. Kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) adalah sejenis ikan laut dan termasuk kedalam familia Syngnathidae dan banyak digunakan sebagai obat kuat, penguat saraf dan pengobatan kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengetahui aktivitas serta mekanisme isolat yang diperoleh dari fraksi n-heksana kuda laut terhadap sel MCF-7.
Ekstraksi kuda laut dilakukan dengan cara maserasi dan fraksinasi ekstrak etanol dengan ekstraksi cair-cair (ECC). Fraksinasi terhadap fraksi paling aktif dilakukan dengan kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan fase gerak n-heksana: etilasetat secara landaian, kemudian dilanjutkan dengan kromatografi kolom dengan fase gerak n-heksana: etilasetat secara landaian. Penentuan struktur isolat dilakukan dengan spektrofotometri UV dan IR, spektrometri massa dan NMR. Pengujian aktivitas sitotoksisitas dilakukan terhadap fraksi dan isolat terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromida]. Pengujian penghambatan terhadap siklus sel menggunakan flow cytometer dan dilakukan imunositokimia terhadap ekspresi siklin D 1 dan kaspase 9 terhadap sel MCF-7.
Pengolahan data untuk penentuan nilai IC50 menggunakan analisis probit
pada program SPSS 19. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa fraksi KL I IC50 122.391,863 µg/ml, KL II IC50 45,392 µg/ml, KL III IC50 144,774 µg/ml,
KL IV IC50 285,723 µg/ml, KLV IC50 214,890 µg/ml dan doksorubisin 7,875
µg/ml. Hasil pengujian sitotoksisitas larutan uji dari isolat dari fraksi KCV KL II terhadap sel MCF-7 memberikan nilai IC50 22,082 µg/ml terhadap sel MCF-7.
Isolat dikarakterisasi dengan spektroskopi UV, FT-IR, HRMS, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC). Dari hasil karakterisasi menggunakan Spektrofotometer UV diperoleh spektrum dengan puncak absorpsi maksimum pada panjang gelombang 205,8 nm dan spektrum infra merah menunjukkan adanya gugus OH pada bilangan gelombang 3387 cm-1, -CH alifatis (pada CH3) pada 2939,52 cm-1, C=C pada 1589,34 cm-1, CH2 pada
1450,47 cm-1, CH3 pada 1373,32 cm-1, C-O pada 1049,28 cm-1; spektrum 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (COSY, HMBC dan HSQC) menunjukkan bahwa isolat mempunyai 27 atom karbon yang terdiri dari 5 CH3, 11 CH2, 8 CH dan 3 atom
karbon kuarterner dengan gugus fungsi siklis, alkil, hidroksi dan ena non konjugasi dan spektrum HRMS menunjukkan berat molekul 386,3543 (C27H46O,
berat molekul perhitungan 386,3551). Berdasarkan hasil karakterisasi isolat dapat disimpulkan bahwa isolat KL 1 adalah cholest-5-en-3β-ol (kolesterol). Isolat menunjukkan peningkatan pada fase sub G1 pada siklus sel, menghambat ekspresi siklin D 1 dan meningkatkan ekspresi kaspase 9 pada imunositokimia terhadap sel MCF-7.
ELUCIDATION STRUCTURE OF ACTIVE COMPOUND SEA HORSE (Hippocampus trimaculatus Leach.) ON MCF-7 CELL LINE
ABSTRACT
Indonesia is a part of Indopasifik region, which is one of the centers of diversity of marine life and biggest in the world
Sea horse extraction carried out with maceration and fractination with liquid-liquid extraction (LLE). Fractionation to the most active fraction with vaccume liquid chromatography (VLC) using gradient eluent n-hexane: ethylacetate, continue with column chromatography using gradient eluent n-hexane: ethylacetate. structure determination of isolate using UV and IR spectrophotometer, mass spectrometer and NMR. Cytotoxicity activity assay of fractions and isolate of sea horse on MCF-7 cell using MTT method [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide]. Inhibition examination of cell cycle using flowcytometer and immunocytochemistry of cyclin D 1 and caspase 9 expression on MCF-7 cell line.
. Sea horse (Hippocampus trimaculatus Leach.) is kind of sea fish and include in Syngnathidae family, much have been used as afrodisiac, nerve tonic and breast cancer treatment. This research have a purpose to isolation and know the activity and the mechanism isolate from n-hexane fraction sea horse on MCF-7 cell line.
Data processing for determination of IC50 values using probit analysis in
SPSS 19. The result of cytotoxicity assay show KL I fraction IC50 122391.863
µg/ml, KL II IC50 45.392 µg/ml, KL III IC50 144.774 µg/ml, KL IV IC50 285.723
µg/ml, KL V IC50 214.890 µg/ml and doxorubicin 7.875 µg/ml. The result of
cytotoxicity assay isolate from KL II fraction show IC50 22.082 µg/ml on MCF-7
cell line. Isolate characterized with UV and IR spectrophotometer, HRMS and 1 H-NMR, 13C-NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC and HSQC). From the characterization result using UV spectrophotometer obtainable spectrum with maximum absorbstion peak at wave length 205.8 nm and from infra red spectrum show OH group at wave number 3387 cm-1, -CH aliphatic (on CH3) at 2939.52
cm-1, C=C at 1589.34 cm-1, CH2 at 1450.47 cm-1, CH3 at 1373.32 cm-1, C-O at
1049.28 cm-1; spectrum 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC) shows isolate have 27 carbon consisting of 5 CH3, 11 CH2, 8 CH and
3 quartener carbon with functional group cyclics, alkyl, hydroxyl and ena non conjugated and HRMS spectrum show molecular weight 386.3543 (C27H46O,
molecular weight calculation 386,3551). Based on the result of characterization of isolate it can be concluded isolate KL 1 is cholest-5-en-3β-ol (cholesterol). Isolate can increase at sub G1 phase on cell cycle, inhibition cyclin D 1 expression and increase caspase 9 expression at immunocytochemistry on MCF-7 cell line.
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
PENGESAHAN TESIS ... iv
SURAT PERNYATAAN ... v
KATA PENGANTAR ... vi
ABSTRAK ... ix
ABSTRACT ... x
DAFTAR ISI ... xi
DAFTAR TABEL ... xvii
DAFTAR GAMBAR ... xviii
DAFTAR LAMPIRAN ... xxii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 4
1.3 Hipotesis ... 5
1.4 Tujuan Penelitian ... 5
1.5 Manfaat Penelitian ... 5
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 7
2.1 Uraian Hewan ... 7
2.1.2 Sistematika Hewan ... 7
2.1.3 Morfologi Hewan ... 8
2.1.4 Kandungan Kimia ... 8
2.1.5 Kegunaan (khasiat) kuda laut ... 9
2.2 Kanker ... 9
2.2.1 Karsinogenesis ... 12
2.2.2 Kanker payudara ... 15
2.2.3 Sel MCF-7 ... 19
2.2.4 P-glikoprotein ... 20
2.2.5 Siklus sel ... 23
2.2.6 Doksorubisin ... 26
2.2.7 Uji sitotoksik menggunakan metode MTT ... 28
2.2.8 Flow cytometry ... 29
2.3 Ekstraksi ... 31
2.3.1 Ekstraksi cair-cair ... 36
2.4 Kromatografi ... 37
2.4.1 Kromatografi lapis tipis ... 37
2.4.2 Kromatografi lapis tipis preparatif ... 39
2.4.3 Kromatografi lapis tipis dua arah ... 40
2.4.4 Kromatografi kolom ... 41
2.4.5 Kromatografi cair vakum ... 41
2.5 Spektrofotometri Ultraviolet ... 42
2.6 Spektrofotometri Inframerah ... 43
2.8 Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic
Resonance)... 45
BAB III METODE PENELITIAN ... 46
3.1 Alat dan Bahan ... 46
3.1.1 Alat ... 46
3.1.2 Bahan ... 47
3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel ... 47
3.2.1 Pengambilan sampel ... 47
3.2.2 Identifikasi hewan kuda laut ... 47
3.2.3 Pembuatan sampel ... 48
3.3 Pembuatan Ekstrak ... 48
3.3.1 Pembuatan fraksi-fraksi dari ekstrak etanol ... 48
3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan... 49
3.5 Pembuatan Media ... 49
3.5.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ... 49
3.5.2 Pembuatan media kultur lengkap (MK) ... 50
3.6 Penumbuhan Sel MCF-7 ... 50
3.6.1 Penumbuhan sel ... 50
3.6.2 Subkultur sel ... 51
3.6.3 Panen sel MCF-7 ... 51
3.6.4 Penghitungan sel ... 51
3.7 Pembuatan Larutan Uji ... 52
3.8 Uji Antikanker ... 53
3.8.1 Uji Sitotoksik ... 53
3.8.2 Penghambatan pada Siklus sel (Cell Cycle) ... 53
3.8.3 Selectivity Index ... 54
3.8.4 Analisis Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan Imunositokimia ... 55
3.9 Analisis Hasil ... 56
3.10 Analisis Fraksi n-heksana dan Kloroform secara KLT .... 56
3.11 Fraksinasi Fraksi n-heksana dan Kloroform dengan KCV (Kromatografi Cair Vakum) ... 57
3.12 Analisis KLT Hasil KCV ... 57
3.13 Isolasi Senyawa Hasil Fraksinasi secara Kromatografi Kolom ... 57
3.14 Analisis Eluat (hasil fraksinasi kolom) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... 58
3.15 Uji Kemurnian Isolat ... 58
3.16 Karakterisasi Isolat ... 59
3.16.1 Karakterisasi Isolat secara Spektrofotometri UV ... 59
3.16.2 Karakterisasi Isolat secara Spektrofotometri IR ... 59
3.16.3 Karakterisasi Isolat secara Spektrometri Massa ... 60
3.16.4 Karakterisasi Isolat dengan Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ... 60
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 61
4.1 Hasil Identifikasi Hewan ... 61
4.2 Hasil Ekstraksi ... 61
4.4 Hasil Uji Sitotoksisitas Isolat Kuda Laut terhadap Sel
Vero dan Selectivity Index (SI) ... 63 4.5 Hasil Uji Penghambatan Siklus Sel dengan
Flowcytometer ... 64 4.6 Hasil Analisi Ekspresi kaspase 9 dan siklin D1 dengan
Imunositokimia ... 67 4.7 Hasil Analisis Fraksi n-heksana dengan
Cara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... 70 4.8 Hasil Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi
Cair Vakum (KCV) ... 71 4.9 Hasil Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi
Kolom ... 72 4.10 Hasil Analisi KLT dari Hasil Pemisahan dengan Kolom
Kromatografi ... 73 4.11 Hasil Analisi KLT Isolat ... 74 4.12 Hasil Pemeriksaan Kemurnian dengan Kromatografi
Lapis Tipis Dua Arah ... 74 4.13 Hasil Karakterisasi Isolat KL I dengan
Spektrofotometer Sinar Ultra Violet ... 75 4.14 Hasil Karakterisasi Isolat KL I dengan
Spektrofotometer Infra Merah ... 76 4.15 Spektrum NMR Karbon-13 ... 78 4.16 Spektrum NMR Proton ... 86 4.17 Spektrum DEPT (Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer) ... 91
Spectroscopy) ... 102
4.22 Spektrum NOESY (1H-1 Spectroscopy) ... 103
H Nuclear Overhouser Effect BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 108
5.1 Kesimpulan ... 108
5.2 Saran ... 108
DAFTAR PUSTAKA ... 109
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 4.1 Persentase akumulasi pada tiap fase dalam siklus sel ... 64
Tabel 4.2 Harga Rf hasil KLT fraksi n-heksana kuda laut ... 70 Tabel 4.3 Interpretasi spektrum IR isolat terhadap serapan dan
bilangan gelombang ... 76 Tabel 4.4 Korelasi frekuensi C-O dengan stereokimia ... 77 Tabel 4.5 Data pergeseran kimia spektrum 13
KL I ... 79 C-NMR dari isolat
Tabel 4.6 Perbandingan data 13
literatur ... 85 C-NMR hasil penelitian dan data
Tabel 4.7 Data karbon CH2, CH dan CH3 dari isolat KL I ... 92
Tabel 4.8 Data 13
Tabel 4.9 Perhitungan berat molekul isolat KL I berdasarkan berat
C-NMR dan DEPT isolat KL I ... 93
atom penyusunnya ... 94
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ... 6
Gambar 2.1 Morfologi hewan kuda laut ... 8
Gambar 2.2 Multitahap karsinogenesis ... 14
Gambar 2.3 Metastasis sel kanker melalui pembuluh limfoid ... 15
Gambar 2.4 Kanker payudara ... 18
Gambar 2.5 Mekanisme pemompaan oleh Pgp ... 22
Gambar 2.6 Checkpoints siklus sel ... 25
Gambar 2.7 Reduksi MTT menjadi formazan ... 28
Gambar 4.1 Hasil flow cytometer sel MCF-7 dengan pemberian doksorubisin dan isolat KL I ... 41
Gambar 4.2 Histogram siklus sel MCF-7 yang menunjukkan sedikit sel yang mengalami agregat (double cell) ditunjukkan oleh tanda panah ... 67
Gambar 4.3 Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 pada sel MCF-7 yang diberi doksorubisin dan isolat KL I ... 68
Gambar 4.4 Kromatogram hasil analisis fraksi n-heksana dengan KLT ... 70
Gambar 4.5 Bagan kerja KCV dan kromatografi kolom ... 72
Gambar 4.6 Bagan kerja fraksinasi dengan kolom kromatografi .... 73
Gambar 4.7 Kromatogram uji kemurnian dengan empat jenis fase gerak yang berbeda ... 74
Gambar 4.8 Kromatogram KLT dua arah isolat KL I ... 75
Gambar 4.9 Spektrum ultraviolet isolat KL I ... 75
Gambar 4.10 Spektrum infra merah isolat KL I ... 76
Gambar 4.12 Spektrum 13
Gambar 4.14 Spektrum 13 Gambar 4.15 Spektrum
C-NMR isolat KL I (42,3222 ppm) ... 80
13
(11,8559 – 19,3919 ppm) ... 81 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.16 Spektrum 13
(21,0842 – 24,2902 ppm) ... 81 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.17 Spektrum 13
(28,0107 – 31,9074 ppm) ... 82 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.18 Spektrum 13
(35,7823 – 37,2509 ppm) ... 83 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.19 Spektrum 13
(39,5164 – 42,3222 ppm) ... 84 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.20 Spektrum 13
(50,1360 – 56,7684 ppm) ... 84 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.21 Spektrum dari pelarut CDCl3
Gambar 4.22 Spektrum H-NMR isolat KL I yang menunjukkan
Gambar 4.25 Spektrum 1
(metin) ... 88 H-NMR isolat KL I cirri atom C-3
Gambar 4.26 Orientasi gugus OH pada atom C-3... 88 Gambar 4.27 Kedudukan gugus OH pada atom C menempati
posisi β-ekuatorial ... 90
Gambar 4.28 Spektrum 1
Gambar 4.30 Spektrum DEPT isolat KL I
(11,8585 – 42,2971 ppm) ... 92
Gambar 4.31 Spektrum DEPT isolat KL I (50,1378- 121,7262 ppm) ... 93
Gambar 4.32 Spektrum massa (HRMS) dari isolat KL I ... 94
Gambar 4.33 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-3; H-3 dan C-6; H-6) ... 95
Gambar 4.34 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-21; H-21, C-19; H-19 dan C-26; H-26) ... 96
Gambar 4.35 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-4; H-4) ... 96
Gambar 4.36 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-18; H-18, C-21; H-21 dan C-19; H-19) ... 97
Gambar 4.37 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-7;H-7, C-24; H-24, C-9; H-9, C-17; H-17, C-1; H-1 dan C-12;H-12 ... 97
Gambar 4.38 Spektrum HMBC isolat KL I ... 99
Gambar 4.39 Interaksi antara H-1 dengan C-5 dan C-9 ... 99
Gambar 4.40 Interaksi antara H-12 dengan C-14 dan C-17 ... 100
Gambar 4.41 Interaksi antara atom H-22 dengan C-21, C-24, C-20 dengan C-21 dan C-24 dan C-17 dengan C-21 ... 100
Gambar 4.42 Interaksi antara H-24 dengan C-26, C-27, H-26 dengan C-27 dan H-25 dengan C-26 dan C-27 ... 101
Gambar 4.43 Interaksi proton dan karbon ... 101
Gambar 4.44 Spektrum COSY isolat KL I (H-3; H-2; H-4 dan H-6; H-7... 102
Gambar 4.45 Spektrum COSY isolat KL I (H-3; dan H-2; H-4) ... 103
Gambar 4.46 Spektrum NOESY isolat KL I ... 104
Gambar 4.48 Hubungan antara masing-masing proton dengan
NOE ... 105 Gambar 4.49 Senyawa cholest-5en-3β-ol (kolesterol) ... 105 Gambar 4.50 Kedudukan atom H pada atom C-3 ... 106 Gambar 4.51 Pembuktian bahwa gugus OH tidak berkedudukan α .. 106 Gambar 4.52 Pola pemecahan anak puncak jika gugus OH
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1 Hasil identifikasi hewan kuda laut ... 118 Lampiran 2 Simplisia kuda laut ... 119 Lampiran 3 Bagan kerja pembuatan ekstrak etanol ... 120 Lampiran 4 Bagan fraksinasi ekstrak etanol kuda laut ... 121 Lampiran 5 Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7... 122 Lampiran 6 Perhitungan persen sel hidup sel Vero ... 125 Lampiran 7 Perhitungan IC50
Lampiran 8 Bagan pembuatan media RPMI ... 135 dengan analisa probit SPSS 19 ... 126
Lampiran 9 Bagan pembuatan media kultur lengkap ... 136 Lampiran 10 Bagan penumbuhan sel MCF-7 ... 137 Lampiran 11 Bagan panel sel MCF-7 ... 138 Lampiran 12 Bagan penghitungan sel ... 139 Lampiran 13 Bagan pembuatan larutan uji ... 139 Lampiran 14 Bagan pengujian sitotoksik ... 140 Lampiran 15 Bagan pengujian penghambatan pada siklus sel ... 141 Lampiran 16 Bagan analisis ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1
dengan Imunositokimia ... 142 Lampiran 17 Spektrum HRMS isolat KL I ... 143 Lampiran 18 Sel MCF-7 dibawah mikroskop ... 145 Lampiran 19 Kristal formazan dan sel Vero dibawah mikroskop .... 146 Lampiran 20 Mikroskop inverted, elisa reader, flowcytometer,
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
ABSTRAK
Indonesia adalah bagian dari wilayah Indopasifik, yang merupakan salah satu pusat keanekaragaman biota laut yang terbesar di dunia. Kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) adalah sejenis ikan laut dan termasuk kedalam familia Syngnathidae dan banyak digunakan sebagai obat kuat, penguat saraf dan pengobatan kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengetahui aktivitas serta mekanisme isolat yang diperoleh dari fraksi n-heksana kuda laut terhadap sel MCF-7.
Ekstraksi kuda laut dilakukan dengan cara maserasi dan fraksinasi ekstrak etanol dengan ekstraksi cair-cair (ECC). Fraksinasi terhadap fraksi paling aktif dilakukan dengan kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan fase gerak n-heksana: etilasetat secara landaian, kemudian dilanjutkan dengan kromatografi kolom dengan fase gerak n-heksana: etilasetat secara landaian. Penentuan struktur isolat dilakukan dengan spektrofotometri UV dan IR, spektrometri massa dan NMR. Pengujian aktivitas sitotoksisitas dilakukan terhadap fraksi dan isolat terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromida]. Pengujian penghambatan terhadap siklus sel menggunakan flow cytometer dan dilakukan imunositokimia terhadap ekspresi siklin D 1 dan kaspase 9 terhadap sel MCF-7.
Pengolahan data untuk penentuan nilai IC50 menggunakan analisis probit
pada program SPSS 19. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa fraksi KL I IC50 122.391,863 µg/ml, KL II IC50 45,392 µg/ml, KL III IC50 144,774 µg/ml,
KL IV IC50 285,723 µg/ml, KLV IC50 214,890 µg/ml dan doksorubisin 7,875
µg/ml. Hasil pengujian sitotoksisitas larutan uji dari isolat dari fraksi KCV KL II terhadap sel MCF-7 memberikan nilai IC50 22,082 µg/ml terhadap sel MCF-7.
Isolat dikarakterisasi dengan spektroskopi UV, FT-IR, HRMS, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC). Dari hasil karakterisasi menggunakan Spektrofotometer UV diperoleh spektrum dengan puncak absorpsi maksimum pada panjang gelombang 205,8 nm dan spektrum infra merah menunjukkan adanya gugus OH pada bilangan gelombang 3387 cm-1, -CH alifatis (pada CH3) pada 2939,52 cm-1, C=C pada 1589,34 cm-1, CH2 pada
1450,47 cm-1, CH3 pada 1373,32 cm-1, C-O pada 1049,28 cm-1; spektrum 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (COSY, HMBC dan HSQC) menunjukkan bahwa isolat mempunyai 27 atom karbon yang terdiri dari 5 CH3, 11 CH2, 8 CH dan 3 atom
karbon kuarterner dengan gugus fungsi siklis, alkil, hidroksi dan ena non konjugasi dan spektrum HRMS menunjukkan berat molekul 386,3543 (C27H46O,
berat molekul perhitungan 386,3551). Berdasarkan hasil karakterisasi isolat dapat disimpulkan bahwa isolat KL 1 adalah cholest-5-en-3β-ol (kolesterol). Isolat menunjukkan peningkatan pada fase sub G1 pada siklus sel, menghambat ekspresi siklin D 1 dan meningkatkan ekspresi kaspase 9 pada imunositokimia terhadap sel MCF-7.
ELUCIDATION STRUCTURE OF ACTIVE COMPOUND SEA HORSE (Hippocampus trimaculatus Leach.) ON MCF-7 CELL LINE
ABSTRACT
Indonesia is a part of Indopasifik region, which is one of the centers of diversity of marine life and biggest in the world
Sea horse extraction carried out with maceration and fractination with liquid-liquid extraction (LLE). Fractionation to the most active fraction with vaccume liquid chromatography (VLC) using gradient eluent n-hexane: ethylacetate, continue with column chromatography using gradient eluent n-hexane: ethylacetate. structure determination of isolate using UV and IR spectrophotometer, mass spectrometer and NMR. Cytotoxicity activity assay of fractions and isolate of sea horse on MCF-7 cell using MTT method [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide]. Inhibition examination of cell cycle using flowcytometer and immunocytochemistry of cyclin D 1 and caspase 9 expression on MCF-7 cell line.
. Sea horse (Hippocampus trimaculatus Leach.) is kind of sea fish and include in Syngnathidae family, much have been used as afrodisiac, nerve tonic and breast cancer treatment. This research have a purpose to isolation and know the activity and the mechanism isolate from n-hexane fraction sea horse on MCF-7 cell line.
Data processing for determination of IC50 values using probit analysis in
SPSS 19. The result of cytotoxicity assay show KL I fraction IC50 122391.863
µg/ml, KL II IC50 45.392 µg/ml, KL III IC50 144.774 µg/ml, KL IV IC50 285.723
µg/ml, KL V IC50 214.890 µg/ml and doxorubicin 7.875 µg/ml. The result of
cytotoxicity assay isolate from KL II fraction show IC50 22.082 µg/ml on MCF-7
cell line. Isolate characterized with UV and IR spectrophotometer, HRMS and 1 H-NMR, 13C-NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC and HSQC). From the characterization result using UV spectrophotometer obtainable spectrum with maximum absorbstion peak at wave length 205.8 nm and from infra red spectrum show OH group at wave number 3387 cm-1, -CH aliphatic (on CH3) at 2939.52
cm-1, C=C at 1589.34 cm-1, CH2 at 1450.47 cm-1, CH3 at 1373.32 cm-1, C-O at
1049.28 cm-1; spectrum 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC) shows isolate have 27 carbon consisting of 5 CH3, 11 CH2, 8 CH and
3 quartener carbon with functional group cyclics, alkyl, hydroxyl and ena non conjugated and HRMS spectrum show molecular weight 386.3543 (C27H46O,
molecular weight calculation 386,3551). Based on the result of characterization of isolate it can be concluded isolate KL 1 is cholest-5-en-3β-ol (cholesterol). Isolate can increase at sub G1 phase on cell cycle, inhibition cyclin D 1 expression and increase caspase 9 expression at immunocytochemistry on MCF-7 cell line.
BAB I PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Indonesia adalah bagian dari wilayah Indopasifik, yang merupakan salah satu pusat keanekaragaman biota laut yang terbesar di dunia. Sumber daya biota laut tersebut merupakan aset potensial yang dapat didayagunakan menjadi produk untuk dimanfaatkan pada berbagai bidang seperti bidang kesehatan, makanan dan kosmetik. Jenis biota laut di daerah tropis Indonesia diperkirakan 2-3 kali lebih besar dibandingkan dengan biota laut di daerah subtropik dan di daerah beriklim dingin (Sumaryono, dkk., 2005).
Pemanfaatan kekayaan laut Indonesia selama ini masih terbatas pada budidaya ikan dan sejenisnya untuk konsumsi makanan sedangkan pemanfaatan dalam bidang medis dan pengobatan masih jarang dilakukan. Pada tahun 1995, hasil perdagangan dunia untuk obat-obatan yang berasal dari potensi biota laut ini mencapai angka $ US 14 milliar (Fachrudin, 2004). Ironisnya, Indonesia masih belum bisa memproduksi bahan baku dasar kimia untuk produksi obat dengan hampir 90% bahan baku dasar kimia tersebut masih diimpor (Setyowati, dkk., 2007). Di lain pihak, potensi dari biota laut untuk bahan dasar industri farmasi, kosmetika, bioenergi dan industri lainnya di Indonesia sangat besar, diperkirakan mencapai nilai ekonomi sebesar 40 miliar dollar AS per tahun (Dahuri, 2004).
aktivitas sebagai stimulan kekebalan dan penghambat enzim tertentu. Selama 30 tahun terakhir, lebih dari 7000 senyawa aktif berhasil diisolasi dari biota laut dan digunakan sebagai dasar dalam pengembangan obat baru (Edrada, 1998).
Penanganan kanker dengan agen kemoterapi masih menjadi pilihan dalam pengobatan kanker. Namun adanya mekanisme multi drug resistance (MDR) mengakibatkan berkurangnya efikasi obat kemoterapi (Conze, et al., 2001). Agen kemoprevensi yang dimaksud di sini umumnya memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan tumor melalui mekanisme cell cycle arrest (Saphiro dan Harper, 1999), pemacuan apoptosis, ataupun menghambat ekspresi protein yang berperan dalam Multi Drug Resistance (Kitagawa, 2006). Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker penyebab kematian di dunia setelah kanker paru-paru, hepar dan kolon. Insidensi kanker payudara di Amerika pada tahun 2010 sebesar 209.060 kasus baru (Jemal, et al., 2010).
sensitivitas terhadap agen kemoterapi seperti doksorubisin rendah (Wong, et al., 2006).
Doksorubisin merupakan agen kemoterapi golongan antrasiklin yang memiliki aktivitas antitumor spektrum luas dan telah digunakan pada berbagai jenis kanker seperti kanker payudara. Penggunaan doksorubisin sebagai agen kemoterapi dibatasi oleh adanya efek toksik terhadap jaringan normal terutama jantung dan dapat menekan sistem imun (Wattanapitayakul, et al., 2005). Timbulnya resistensi pada beberapa obat terapi kanker termasuk doksorubisin menjadi kendala utama dalam pengobatan kemoterapi, yakni dapat menurunkan sensitivitas sel kanker terhadap agen kemoterapi. Oleh karena itu, berbagai penelitian untuk mengurangi resistensi obat terus dilakukan, sehingga dapat memperbaiki penerapan klinik agen kemoterapi kanker payudara dan diperlukan adanya pengembangan pengobatan baru untuk terapi kanker payudara yang lebih efektif.
Kuda laut atau sering disebut juga sebagai tangkur kuda (Hippocampus sp.) merupakan jenis ikan yang dimanfaatkan untuk bahan obat-obatan dalam bentuk tepung. Di Cina, obat dari tangkur kuda ini disebut “ginseng dari Selatan”. Kuda laut ini digunakan sebagai tonik untuk memulihkan tubuh dari keletihan dan kelemahan fungsi ginjal dan sangat baik untuk memperbaiki kerusakan sistem syaraf. Di Cina, sekali produksi dibutuhkan kira-kira 500 kg kuda laut kering sebagai bahan baku untuk pabrik obat-obatan (Romimohtarto dan Sri, 2001).
gangren. Dari beberapa literatur Cina, binatang ini diyakini juga mampu mengatasi kanker payudara dan meremajakan kulit (Anonim, 2007).
Ekstrak etanol kuda laut memiliki kandungan kimia steroid/triterpenoid, saponin dan glikosida serta memiliki efek sitotoksik yang ditunjukkan dengan nilai IC50 123,988 µg/ml dan berkekuatan lemah karena nilai IC50 >100 µg/ml
(Satria, dkk., 2012a), sedangkan pada fraksi n-heksana dan kloroform memiliki kandungan kimia steroid/triterpenoid serta memiliki efek sitotoksik yang ditunjukkan dengan nilai IC50 66,815 µg/ml dan 69,628 µg/ml yang poten karena
memiliki nilai IC50 <100 µg/ml (Satria, dkk., 2012b
Berdasarkan hal tersebut di mana pada fraksi n-heksana memiliki nilai IC
; Satria, et al., 2014).
50
Penelitian ini meliputi pembuatan simplisia, pembuatan ekstrak dengan pelarut etanol, fraksinasi ekstrak etanol dengan menggunakan pelarut n-heksana, isolasi senyawa aktif dari fraksi n-heksana dan pengujian isolat terhadap sel MCF-7, pengujian imunositokimia, penentuan fase penghambatan sel pada siklus sel dengan flow cytometer dan elusidasi struktur isolat yang aktif.
yang poten dan sejauh ini belum pernah dilakukan penelitian, maka peneliti tertarik untuk melakukan isolasi senyawa yang aktif terhadap sel MCF-7 dari fraksi tersebut, melakukan pengujian sitotoksisitas, pengujian imunositokimia dan pengujian penghambatan siklus sel dengan flow cytometer dari isolat.
1.2Perumusan Masalah
1. Apakah isolat aktif dari kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker?
1.3Hipotesis
1. Isolat memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker. 2. Struktur kimia dari zat aktif dapat ditentukan dengan metode spektroskopi. 1.4Tujuan Penelitian
1. Untuk memperoleh senyawa yang dapat dikembangkan sebagai senyawa antikanker.
2. Untuk memperoleh informasi senyawa-senyawa yang terdapat pada kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) yang belum banyak ditemukan pada pustaka.
1.5 Manfaat Penelitian
1.6Kerangka Pikir Penelitian
2
Gambar 1.1 Diagram Kerangka Pikir Penelitian
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Hewan
Uraian hewan meliputi habitat, sistematika hewan, morfologi hewan, kandungan kimia dan kegunaan (khasiat) hewan kuda laut.
2.1.1 Habitat
Ditemukan pada kedalaman >10 m dari permukaan air dan dilaporkan maksimum pada kedalaman 100 m, koral lunak, dasar yang berpasir disekitar terumbu dangkal, dasar yang berlumpur. Untuk jenis Hippocampus trimaculatus Leach., banyak ditemukan di Australia, Kamboja, Cina, Hongkong, Taiwan, Tahiti, India, Indonesia, Jepang, Malaysia, Myanmar, Filipina, Singapura, Thailand dan Vietnam (Lourie, et al., 2004).
2.1.2 Sistematika hewan Kerajaan : Animalia Filum : Chordata Kelas : Actinopterygii Bangsa : Syngnathiformes Suku : Syngnathidae Marga : Hippocampus
Spesies : Hippocampus trimaculatus Leach.
Sinonim : H. mannulus Cantor 1850; H. kampylotrachelos Bleeker 1854; H. planifrons Peters 1877; H. dahli Ogilby 1908; H. takakurae
2.1.3 Morfologi hewan
Gambar 2.1 Morfologi hewan kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) (Lourie, et al., 2004).
Kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) memiliki warna kecoklatan, panjang maksimum 17 cm, trunk rings 11, tail rings 40-41 (38-43), head length/snout length 2,2 (1,9-2,4 cm), coronet rendah dan menyerupai 5 titik, tidak
terdapatnya duri hidung, duri pipi tunggal dan berbentuk seperti ‘hook’ (Lourie, et al., 2004).
2.1.4 Kandungan kimia
glutamat 7,63 ± 0,43%, alanin 5,86 ± 0,15%, tirosin 1,36 ± 0,12%, glisin 10,01 ± 1,33%, serin 2,32 ± 0,02%. Asam amino esensial 19,18 ± 1,16%, asam amino total 56,88 ± 2,56%, mengandung asam-asam lemak jenuh dan tak jenuh serta mineral (Lin, et al., 2008).
2.1.5 Kegunaan (khasiat) kuda laut
Kuda laut banyak digunakan oleh masyarakat untuk penyembuhan distosia pada wanita hamil, memperkuat ginjal, meningkatkan imunitas dan menghilangkan tumor. Kuda laut juga dilaporkan dapat meningkatkan jumlah sperma (spermatogenesis), memperpanjang estrum pada tikus dan meningkatkan stamina (Lin, et al., 2008).
2.2 Kanker
Kanker adalah istilah umum untuk pertumbuhan sel yang tidak normal, yaitu suatu kondisi di mana sel telah kehilangan pengendalian dan mekanisme normal, sehingga mengalami pertumbuhan yang tidak normal, cepat dan tidak terkendali. Kanker dapat menyusup ke jaringan tubuh normal dan menekan jaringan tubuh normal sehingga mempengaruhi fungsi tubuh. Kanker bukan merupakan penyakit menular (Diandana, 2009).
Adapun ciri-ciri sel kanker secara khusus yang membedakan dengan sel normal, antara lain sebagai berikut.
a. Sel kanker mampu mencukupi kebutuhan sinyal pertumbuhannya sendiri
tidak bergantung pada rangsangan sinyal pertumbuhan dari luar untuk melakukan proliferasi. Mutasi yang terjadi pada sel kanker memungkinkan sel tersebut untuk memperpendek growth factor pathway. Dengan demikian, sel kanker dapat tumbuh menjadi tidak terkendali (Pecorino, 2005; Kumar, 2005; Adina, 2009). b. Sel kanker tidak sensitif terhadap sinyal antiproliferatif
Sinyal antiproliferatif merupakan sinyal anti pertumbuhan yang dibutuhkan oleh sel untuk mengontrol dan menjaga keteraturan sel serta homeostasis jaringan. Pada kondisi normal, regulasi sinyal pertumbuhan ini menjadi faktor penentu bagi sel untuk berproliferasi atau istirahat. Sinyal ini akan mengatur perkembangan sel dengan memblok proliferasi melalui dua mekanisme, yaitu (1) sel dipaksa keluar dari fase proliferasi yang aktif menuju fase istirahat G0 atau (2) sel diinduksi untuk melepaskan potensi proliferasi secara permanen dengan diinduksi untuk memasuki fase post mitotic. Sel kanker memiliki kemampuan untuk menghindar dari sinyal anti pertumbuhan yang berhubungan dengan daur sel. Hal ini disebabkan oleh adanya mutasi pada beberapa gen (proto-onkogen) (Pecorino, 2005; Kumar, et al., 2005; Adina, 2009).
c. Sel kanker mampu menghindar dari mekanisme apoptosis
protein regulator ini menyebabkan sel kehilangan kontrol proliferasi (Kumar, et al., 2005; Adina, 2009).
d. Kemampuan angiogenesis yang dimiliki oleh sel kanker
Sel kanker memiliki kemampuan untuk memacu pertumbuhan pembuluh darah baru yang dinamakan angiogenesis. Kemampuan tersebut diinisiasi oleh sinyal Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) dan Fibroblas Growth Factor (FGF). Terdapat beberapa regulator proses angiogenesis antara lain: angiopoietin-1, angiotropin, angiogenin, epidermal growth factor, granulocyte
colony-stimulating factor, interleukin (IL-1), IL-6, IL-8, TNF-α, kolagen, dan
cathepsin. Faktor-faktor angiogenensis dapat mengaktifkan angiogenic switch, sehingga pertumbuhan pembuluh darah baru menjadi tidak terkendali (Kumar, et al., 2005; Adina, 2009).
e. Sel kanker mampu menginvasi jaringan di sekitarnya dan membentuk anak sebar (metastasis)
Selama perkembangannya, kebanyakan kanker pada manusia akan membentuk massa tumor primer yang mampu membebaskan diri dari jaringan awalnya, memasuki aliran darah atau pembuluh limfa, dan membentuk tumor sekunder (metastasis) di bagian tubuh yang lain. Hal ini dapat terjadi akibat mutasi yang memungkinkan peningkatan aktivitas enzim-enzim yang terlibat dalam invasi sel kanker dan berkurangnya adhesi antar sel oleh molekul addisi sel (Pecorino, 2005; Adina, 2009).
berkaitan dengan enzim telomerase yang menjaga integritas telomer pada kromosom, sehingga sel tetap memiliki kemampuan untuk membelah diri. Pada kondisi normal, telomer akan mengalami degradasi (pemotongan) pada saat sel mengalami replikasi. Ketidakmampuan sel untuk meregulasi degradasi telomer inilah yang menyebabkan sel kanker memiliki kemampuan tidak terbatas untuk bereplikasi (Kumar, et al., 2005; Adina, 2009)
2.2.1 Karsinogenesis
Karsinogenesis merupakan suatu proses terjadinya kanker melalui mekanisme multitahap dengan adanya perubahan neoplastik pada jaringan normal yang disebabkan oleh akumulasi multimutasi genetik dan menyebabkan transformasi progresif sel normal menjadi sel malignan (ganas) (Tsao, et al., 2004). Perubahan ini diawali dari mutasi somatik satu sel tunggal yang mengakibatkan perubahan dari normal menjadi hiperplastik, displastik, dan pada akhirnya menjadi suatu keganasan atau malignansi (memiliki kemampuan metastasis atau menginvasi jaringan di sekelilingnya) (Gambar 2.2). Perubahan genetik ini termasuk perubahan seluler mendasar pada sel kanker yang dipengaruhi oleh beberapa gen seperti: tumor suppressor genes (pRb, p53,PTEN, E-cadherin) dan proto-oncogenes (ras, c-myc, Bcl-2). Karsinogenesis dapat dibagi
menjadi empat tahap utama, yaitu tahap inisiasi, promosi, progresi, dan metastasis (Tsao, et al., 2004; Adina, 2009).
Secara singkat, pembentukan dan pertumbuhan sel kanker dapat dijelaskan melalui tahapan-tahapan berikut (Diandana, 2009; Harianto, 2009).
b. Fase induksi, yaitu ketika sel normal yang sedang bermutasi mulai berubah menjadi sel kanker. Fase inisiasi dan induksi tidak bisa diketahui dan sangat susah untuk dideteksi. Fase-fase ini dapat berlangsung hingga puluhan tahun.
c. Fase in situ, yaitu ketika pertumbuhan kanker terbatas pada jaringan tempat asalnya tumbuh. Fase ini lamanya sangat bervariasi. Mungkin saja penderita penyakit kanker berada dalam fase ini selamanya, tetapi umumnya berlangsung sampai 5 tahun.
d. Fase metastasis, yaitu penyebaran kanker ke kelenjar getah bening atau organ lain yang letaknya jauh (misal kanker usus besar menyebar ke hati). Penyebaran ini dapat melalui aliran darah, aliran getah bening, atau langsung dari tumor.
Pada tahap promosi, sel-sel akan memperoleh beberapa keuntungan selektif untuk tumbuh sehingga pertumbuhannya menjadi cepat dan berubah menjadi tumor jinak. Tahap promosi tidak melibatkan perubahan struktural dari genom secara langsung, tetapi biasanya terjadi perubahan ekspresi gen yang terinisiasi (Tsao, et al., 2004).
Adanya mutasi pada satu sel tunggal normal sebagai akibat terpapar oleh karsinogen (inisiasi), akan menyebabkan progresi sel menjadi hiperplasi (promosi), diplasi (progresi) dan pada akhirnya memiliki kemampuan invasi ke jaringan sekitarnya (metastasis) (Tsao, et al., 2004; Adina, 2009).
dan angiogenesis (Kumar, et al., 2005). Pada tahap ini, sel-sel tumor dikatakan sebagai sel malignan. Pada fase ini juga akan terjadi karsinoma dan metastasis melalui aktivasi onkogen dan malfungsi dari enzim topoisomerase (Pecorino, 2005; Adina, 2009).
Gambar 2.2 Multitahap karsinogenesis (Tsao, et al., 2004).
lainnya membentuk tumor sekunder dengan didukung kemampuan neoangiogenesis yang dimilikinya (Kumar, et al., 2005; Adina, 2009).
Gambar 2.3 Metastasis sel kanker melalui pembuluh limpoid (Kumar, et al., 2005).
Tahap metastasis dapat berlangsung karena melemahnya ikatan antarsel yang disebabkan oleh terdegradasinya CAMs (Cell-cell Adhesion Molocules) dan E-cadherin sebagai molekul yang menjaga pertautan antarsel. Molekul-molekul tersebut diketahui sudah sangat sedikit bahkan tidak ditemukan lagi pada sel kanker, sehingga proses metastasis dapat terus terjadi. Selain itu, kemampuan angiogenesis yang telah dimiliki sel kanker mampu menjaga sel agar tetap hidup selama proses metastasis berlangsung (Kumar, et al., 2005; Adina, 2009).
2.2.2 Kanker payudara
tergolong pada karsinoma. Kanker payudara merupakan kanker yang paling umum diderita oleh wanita, di samping kanker serviks. Penyebab kanker payudara sangat beragam (Torosian, 2002)., antara lain:
a. Kerusakan pada DNA yang menyebabkan mutasi genetik. Kerusakan ini dapat disebabkan oleh radiasi yang berlebihan
b. Kegagalan immune surveillance dalam pencegahan proses malignan pada fase awal
c. Faktor pertumbuhan yang abnormal
d. Malfungsi DNA repairs seperti : BRCA1, BRCA2 dan p53
Kanker payudara terjadi ketika sel-sel pada payudara tumbuh tidak terkendali dan dapat menginvasi jaringan tubuh yang lain baik yang dekat dengan organ tersebut maupun bermetastasis ke jaringan tubuh yang letaknya berjauhan. Semua tipe jaringan pada payudara dapat berkembang menjadi kanker, namun pada umumnya kanker muncul baik dari saluran (ducts) maupun kelenjar (glands). Perkembangannya memerlukan waktu berbulan-bulan atau bertahun-tahun sampai tumor tersebut cukup besar untuk dirasakan pada payudara. Deteksi dapat dilakukan dengan mammograms (Gambar 2.4) yang kadang-kadang dapat mendeteksi tumor sejak dini (Elwood, 1993; Dolinsky, 2002; Adina, 2009).
(sebelum 12 tahun), yang mengalami menopause terlambat (setelah 50 tahun), yang tidak pernah melahirkan atau melahirkan di usia lebih dari 30 tahun, dan yang mengalami mutasi genetik. Dari berbagai macam faktor tersebut, 3 - 10% penyebab kanker payudara diduga berkaitan dengan perubahan baik gen BRCA1 maupun gen BRCA2 (Dolinsky, 2002; Adina, 2009).
Beberapa faktor yang menaikkan resiko menderita kanker payudara yang dapat diubah, yakni mendapatkan terapi pengganti hormon (penggunaan estrogen dan progesteron dalam jangka waktu lama untuk mengatasi gejala menopause), menggunakan pil antikontrasepsi (pil KB), tidak menyusui, mengonsumsi minuman beralkohol 2 - 5 gelas per hari, menjadi gemuk terutama setelah menopause, dan tidak berolahraga (Dolinsky, 2002; Adina, 2009). Perlu diingat bahwa faktor-faktor resiko tersebut hanyalah berdasarkan pada kemungkinan. Seseorang tetap dapat terkena kanker payudara walaupun ia tidak mempunyai satu pun faktor resiko tersebut. Menghindari faktor resiko tersebut dan deteksi awal adalah cara terbaik untuk mengurangi kematian berkaitan dengan kanker ini.
dan ekspresinya mampu meningkatkan efektivitas agen kemoterapi (Zhou, et al., 2006; Adina, 2009).
Payudara normal Kanker payudara Payudara normal Kanker payudara a b
Gambar 2.4 Kanker payudara (Elwood, 1993; Dolinsky, 2002; Adina, 2009). Keterangan gambar:
Proses pembentukan breast cancer yang diawali oleh pertumbuhan satu sel (a), Payudara normal (kiri) dan kanker payudara (kanan) melalui mammography image (b)
Selain itu, paparan estrogen endogen yang berlebihan juga dapat berkontribusi sebagai penyebab kanker payudara. Sekitar 50% kasus kanker payudara merupakan kanker yang bergantung pada estrogen dan sekitar 30% kasus merupakan kanker yang positif mengekspresi HER-2 berlebihan (Gibbs, 2000; Adina, 2009). Kedua protein tersebut selain berperan dalan metastasis, juga berperan dalam perkembangan kanker payudara (early cancer development).
utama dalam sinyal pertumbuhan, misalnya Ras, Myc, dan cycD1 (Foster, et al., 2001). Aktivasi protein ini mengakibatkan adanya pertumbuhan yang berlebihan melalui aktivasi onkoprotein yang lain seperti P13K, AKT, Raf, ERK, dan MAP kinase (Hahn, et al., 2002). Di lain pihak, kompleks estrogen dengan reseptornya juga akan memacu transkripsi beberapa gen tumor suppressor, seperti BRCA1, BRCA2, dan p53. Namun, pada penderita kanker payudara (yang umumnya telah
lewat masa menopause) gen-gen tersebut telah mengalami perubahan (transformed) akibat dari hiperproliferasi sel-sel payudara selama perkembangannya sehingga tidak berperan sebagaimana mestinya (Adelmann, et al., 2000, Clarke, 2001; Ingvarsson, et al., 2001; Adina, 2009).
2.2.3 Sel MCF-7
Salah satu model sel kanker payudara yang sering digunakan dalam penelitian adalah sel MCF-7. Sel ini merupakan sel kanker payudara yang mengekspresikan reseptor estrogen (ER+) dan berasal dari pleural effusion breast adenocarcinoma seorang pasien wanita Kaukasian berumur 69 tahun, golongan darah O (Crawford, 2002). Sel ini termasuk sel adherent (melekat) yang dapat ditumbuhkan dalam media penumbuh DMEM yang mengandung foetal bovine serum (FBS) 10% dan antibiotik penisilin-streptomicin 1% (ATCC, 2008). Sel ini
mengekspresikan reseptor estrogen alfa (ER-α), memiliki sifat resisten terhadap
sel MCF-7. Salah satu cara untuk meningkatkan sensitivitas MCF-7 adalah dengan menghambat ekspresi dan aktivasi Pgp (Zhou, et al., 2006; Adina, 2009).
2.2.4 P-glycoprotein
P-glycoprotein (Pgp) merupakan protein ABC-transporter pada manusia yang termasuk dalam subfamili MDR/TAP (Allen, et al., 2002) Pgp dikenal dalam beberapa sebutan yakni ABCB1, ATP-binding cassette sub-family B member 1, MDR1, dan PGY1 (Choi, 2005). ABCD1 atau Pgp termasuk dalam ATP-dependent efflux pump yang memiliki substrat spesifik antara lain: obat
(colchicine dan tacrolimus), agen kemoterapi (etoposide, adrimycin dan vinblastine), lipid, steroid, xenobiotik, peptide, bilirubin, cardiac glycoside (digoxin), glucocorticoids (dexamethasone) dan agen terapi HIV tipe 1 (inhibitor protease dan nonnucleoside reverse transcriptase) (Kitagawa, 2006). Di dalam tubuh, Pgp ini dapat ditemukan pada sel usus, hati, tubula ginjal dan capillary endothelial (Deng, et al., 2001; Adina, 2009).
P-glycoprotein adalah sebuah glikoprotein transmembran yang memiliki 10 - 15 kDa N-terminal glycosylation dengan bobot 170-kDa dikode oleh gen MDR1 (Kitagawa, 2006). Gen ini dicirikan dengan pompa efflux obat dan anggota
aktivasi pada Pgp (Choi, et al., 2005). Aktivasi Pgp akan menurunkan intake agen kemoterapi sehingga menurunkan efikasi agen tersebut terhadap sel kanker. Pada kondisi ekspresi yang berlebihan, Pgp dapat menyebabkan resistensi obat terutama agen kemoterapi pada kanker payudara seperti Doksorubisin (Mechetner, et al., 1998). Pgp akan mengikat Doksorubisin sebagai salah satu substratnya untuk dikeluarkan dari dalam sel (Wong, et al., 2006). Pgp atau ABCD1 pertama kali diujikan sebagai multidrug resistance dan terbukti sebagai penyebab resistensi obat kemoterapi (Juliano, 1976; Adina, 2009).
Penghambatan aktivasi dan ekspresi Pgp memegang peranan penting dalam keberhasilan terapi kanker (Zhou, et al., 2006). Penghambatan aktivitas Pgp dapat melalui dua mekanisme yakni (1) penghambatan substrat Pgp secara langsung dengan berikatan pada Pgp-binding domain dan (2) penghambatan hidrolisis ATP oleh ATase melalui ikatan substrat dengan ATP (Kitagawa, 2006). Penghambatan ini dapat dilakukan menggunakan senyawa flavonoid dan polifenol melalui dua sisi ikatan pada ATP-binding sites dan steroid interacting region dimana ATPase berikatan dengan Pgp cytosolic domain (Kitagawa, 2006).
Gambar 2.5 Mekanisme pemompaan oleh Pgp (Matheny, et al., 2001). Penekanan ekspresi Pgp dapat dilakukan melalui berbagai mekanisme antara lain aktivasi jalur sinyal transduksi c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) dan
inaktivasi NF-κB transcriptional factor, c-Jun NH2-terminal kinase (JNK)
merupakan protein kinase yang berikatan dengan NH2-terminal yang merupakan
sisi aktif pada c-Jun transcriptional factor dan protein ini mampu memfosforilasi c-Jun. Fosforilasi c-Jun akan menstimulasi pembentukan ikatan dengan AP-1, suatu elemen pada gen MDR1. Pembentukan ikatan ini akan mencegah ekspresi mRNA MDR1 dan pada akhirnya akan menghambat ekspresi Pgp. Fosforilasi c-Jun tersebut dapat dilakukan oleh salvicine (quinine diterpenoid sintetik) (Zhou, et al., 2006; Adina, 2009).
Penelitian yang dilakukan oleh Deng, et al., (2001), melaporkan bahwa
aktivasi NF-κB sebagai akibat adanya stimulus dari lingkungan berupa stress,
paparan agen sitotoksik, heat shock, iradiasi, genotoxic stress, inflamasi, paparan
aktif mampu berikatan dengan promoter gen MDR1 sehingga proses ekspresi Pgp
dapat berjalan. Inaktivasi NF-κB mampu menghambat ekspresi Pgp.
2.2.5 Siklus sel
Siklus sel merupakan proses perkembangbiakan sel yang memperantarai pertumbuhan dan perkembangan makhluk hidup. Setiap sel baik normal maupun kanker mengalami siklus sel. Siklus sel memiliki dua fase utama, yakni fase S (sintesis) dan fase M (mitosis). Fase S merupakan fase terjadinya replikasi DNA kromosom dalam sel, sedangkan pada fase M terjadi pemisahan 2 set DNA kromosom tersebut menjadi 2 sel (Nurse, 2000; Adina, 2009).
Selain itu, terdapat fase yang membatasi kedua fase utama tersebut yang dinamakan Gap. G1 (Gap-1) terdapat sebelum fase S dan setelah fase S dinamakan G-2 (Gap-2). Pada fase G1, sel melakukan persiapan untuk sintesis DNA. Fase ini merupakan fase awal cell cycle progression yang diatur oleh faktor ekstraselular seperti mitogen dan molekul adhesi. Penanda fase ini adalah adanya ekspresi dan sintesis protein sebagai persiapan memasuki fase S. Pada fase G2, sel melakukan sintesis lebih lanjut yang memadai untuk proses pembelahan, sehingga sel siap melakukan pembelahan pada fase M (Ruddon, 2007).
sel (G1-S-G2-M) (Nurse, 2000). Aktivasi CDK dihambat oleh regulator negatif siklus sel, yakni CDK inhibitor (CKI), yang terdiri dari Cip/Kip protein (meliputi p21, p27, p57) dan keluarga INK4 (meliputi p16, p18, p19). Selain itu, tumor suppressor protein yaitu p53 dan pRb juga bertindak sebagai protein regulator
negatif (Foster, et al., 2001; Adina, 2009).
Aktivasi CDK memerlukan ekspresi cyclin (Cyc). Kompleks Cyclin-CDK dengan protein CKI dan adanya fosforilasi oleh Wee1 (tyrosin15)/ Myt1 (threonin14) dapat menyebabkan inaktivasi CDK. Aktivasi kompleks Cyc-CDK diawali dengan proteolisis CKI oleh ubiquitin, kemudian fosforilasi CDK oleh CDK-activating kinase (CAK) pada threonin161 dan penghilangan fosfat (defosforilasi) oleh Cdc25 fosfatase pada target fosforilasi Wee1 (tyrosin15)/Myt1 (threonin14) (Heuvel, 2005). CDK bekerja pada awal G1 untuk mengaktifkan E2F-dependent transcription gen yang diperlukan untuk fase S (di akhir G1 untuk
menginisiasi fase S) dan juga di akhir G2 untuk menginisiasi mitosis (M) (Nurse, 2000; Adina, 2009).
Gambar 2.6 Checkpoints siklus sel (Ruddon, 2007).
Checkpoint pada fase G1 akan dapat dilalui jika (1) ukuran sel memadai; (2) ketersediaan nutrien mencukupi; dan (3) adanya faktor pertumbuhan (sinyal dari sel yang lain). Checkpoint pada fase G2 dapat dilewati jika ukuran sel memadai, dan replikasi kromosom terselesaikan dengan sempurna, sedangkan checkpoint pada metaphase (M) terpenuhi bila semua kromosom dapat menempel
pada gelendong (spindle) mitotik (Ruddon, 2007).
sehingga kromatid tidak bergerak menjauh ke kutub yang berlawanan (Ruddon, 2007).
Kontrol checkpoint sangat penting untuk menjaga stabilitas genomik. Kesalahan pada checkpoint akan meloloskan sel untuk berkembang biak meskipun terdapat kerusakan DNA atau replikasi yang tidak lengkap atau kromosom tidak terpisah sempurna sehingga akan menghasilkan kerusakan genetik. Hal ini kritis bagi timbulnya kanker. Oleh karena itu, proses regulasi siklus sel mampu berperan dalam pencegahan kanker (Ruddon, 2007).
2.2.6 Doksorubisin
Doksorubisin adalah golongan antibiotik antrasiklin sitotoksik yang diisolasi dari Streptomyces peucetius var. caesius. Doksorubisin telah digunakan secara luas untuk mengobati kanker payudara (Thurston, et al., 1998). Senyawa ini menunjukkan kemampuan yang kuat dalam melawan kanker dan telah digunakan sebagai obat kemoterapi kanker sejak akhir tahun 1960-an (Singal, et al., 1998; Rock, et al., 2003).
Aplikasi doksorubisin yang telah digunakan secara klinis untuk berbagai jenis tumor ini dibatasi oleh timbulnya efek samping (Tyagi, et al., 2004). Efek samping yang timbul segera setelah pengobatan dengan doksorubisin adalah mual, imunosupresi dan aritmia yang sifatnya revesibel serta dapat dikontrol dengan obat-obat lain. Efek samping yang paling serius akibat pengobatan dengan doksorubisin dalam jangka waktu yang lama adalah cardiomyopathy yang diikuti dengan gagal jantung (Tyagi, et al., 2004). Berdasarkan hasil penelitian restrospektif diketahui bahwa toksisitas kardiak akibat pemberian doksorubisin merupakan efek samping yang bergantung pada dosis. Mekanisme yang memperantarai toksisitas kardiak tersebut diduga disebabkan oleh terbentuknya spesies oksigen reaktif, meningkatnya kadar anion superoksida dan pengurasan ATP yang kemudian menyebabkan perlukaan jaringan kardiak (Wattanapitayakul, et al., 2005).
Permasalahan yang sering timbul dalam terapi kanker terutama kanker payudara menggunakan doksorubisin adalah resistensi obat dan menjadi penyebab kegagalan terapi kanker payudara (Mechetner, et al., 1998). Resistensi ini diperantarai oleh berbagai mekanisme antara lain: mutasi pada target obat, kegagalan inisiasi apoptosis dan pengeluaran obat oleh protein transporter pada membran sel (Notobartolo, et al., 2005). Pengeluaran obat yang disebabkan oleh adanya pompa efflux Pgp menjadi salah satu sebab utama resistensi obat ini (Mechetner, et al., 1998).
konsentrasi efektif doksorubisin dalam sel kanker. Mekanisme pemompaan oleh Pgp sangat bergantung pada aktivasi protein tersebut dan penekanan ekspresi Pgp (Zhou, et al., 2006). Oleh karena itu, inaktivasi Pgp dan penekanan ekspresinya mampu mengatasi permasalahan resistensi sel kanker terhadap doksorubisin (Mechetner, et al., 1998; Zhou, et al., 2006).
2.2.7 Uji sitotoksik menggunakan metode MTT
Uji sitotoksisitas dilakukan secara in vitro, yaitu untuk menentukan potensi sitotoksik suatu senyawa seperti obat antikanker. Toksisitas merupakan kejadian kompleks secara in vivo yang menimbulkan kerusakan sel akibat penggunaan obat antikanker yang bersifat sitotoksik. Respon sel terhadap agen-agen sitotoksik dipengaruhi oleh kerapatan sel (Kupcsik, 2011).
Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna (Kupcsik, 2011).
Gambar 2.7 Reduksi MTT menjadi formazan (Kupcsik, 2011).
reduktase suksinat tetrazolium, yang termasuk dalam mitokondria dari sel hidup (Kupcsik, 2011).
Formazan merupakan zat berwarna ungu yang tidak larut dalam air sehingga dilarutkan menggunakan HCl 0,04 N dalam isopropanol atau 10% SDS dalam HCl 0,01 N. Intensitas warna ungu terbentuk dapat ditetapkan dengan spektrofotometri dan berkorelasi langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme, sehingga berkorelasi dengan viabilitas sel (Kupcsik, 2011). Persentase viabilitas dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut.
% ����������= ����������������
����������������� � 100%
2.2.8 Flow cytometry
Flow cytometry merupakan suatu teknologi mutakhir yang dapat
diaplikasikan dalam bidang biologi sel maupun medisinal klinis. Prinsip utama dalam metode flow cytometry adalah memisahkan sel atau partikel tunggal yang terdapat dalam suatu suspensi melewat suatu celah sempit dengan waktu singkat yang ditembus seberkas sinar. Sinyal optik yang terbentuk umumnya pada daerah visible yang menunjukkan jenis senyawa kimia atau biologi tertentu. Pada
parameter dapat dianalisis dan dengan teknologi komputer saat ini dapat dikerjakan analisis multiparametrik dengan mudah dan cepat (Robinson, 2004).
Sel yang melewati berkas sinar akan menyebabkan sinar berpencar (scatterd) kedua arah yaitu forward scatterd (FS) yang parallel dengan arah sinar dan side scatterd (SS) yang arahnya tegak terhadap arah sinar. Besarnya FS sebanding dengan ukuran sel dan dapat membedakan antara pecahan sel dengan sel hidup, sedangkan SS menunjukkan morfologi sel dan emisi sinar fluorescence yang dipancarkan fluorokrom yang digunakan untuk mewarnai sel. FS dan SS masing-masing partikel memiliki keunikan sendiri, sehingga kombinasi keduanya dapat membedakan setiap partikel. Nilai FS dan SS dikonversikan dalam bentuk digital dan histogram sehingga dapat dianalisis (Rahman, 2006).
Aplikasi utama dalam flow cytometry yang digunakan untuk memisahkan sel sesuai dengan sub tipe atau ekspresi epitop yang diinginkan adalah cell sorting atau analisis Fluororesence Activated Cell Sorter (FACS) (Rahman, 2006).
Ketika sampel dimasukkan dan mengalami aliran hidrodinamik, masing-masing partikel akan tersinari. Ketika nilai dari sinyal scattered dan fluorescence sesuai dengan nilai yang sudah disiapkan, maka akan terjadi proses charging (pemberian muatan) pada saat keluar dari nozzle sistem fluidic. Partikel bermuatan tersebut dipisahkan sesuai dengan yang diinginkan (Rahman, 2006).
disebut cluster of differentiation (CD) sehingga sistem kompleks antara antigen dengan reseptornya dapat diidentifikasi. Saat ini sudah diketahui ada 166 klasifikasi dari antigen CD (Robinson, 2004).
2.3 Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain. Setelah diketahui senyawa aktif yang dikandung oleh simplisia, akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat. Simplisia yang lunak seperti rimpang dan daun mudah ditembus oleh pelarut, karena itu pada proses ekstraksi tidak perlu diserbuk sampai halus. Simplisia yang keras seperti biji, kulit kayu dan kulit akar sulit untuk ditembus oleh pelarut, karena itu perlu diserbuk sampai halus (Depkes, 2000).
Metode ekstraksi menurut Depkes (2000), ada beberapa cara, yaitu: maserasi, perkolasi, refluks, sokletasi, digesti, infundasi dan dekoktasi.
1. Maserasi
Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang bersifat lunak seperti daun dan bunga tetapi banyak juga yang menggunakan metode ini untuk menyari simplisia yang keras seperti akar dan korteks karena cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Pada penyarian dengan cara maserasi perlu dilakukan pengadukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan larutan di luar sel.
Maserasi dapat dilakukan dengan cara menurut Farmakope Indonesia Edisi III (1979):
Masukkan 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok kedalam sebuah bejana, kemudian dituangi dengan 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sering diaduk, serkai, peras, cuci ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana tertutup, biarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Enap tuangkan atau saring.
Maserasi dapat dilakukan modifikasi misalnya: 1. Digesti
Digesti adalah cara maserasi dengan menggunakan pemanasan lemah, yaitu pada suhu 40 - 50ºC. Cara maserasi ini hanya dapat dilakukan untuk simplisia yang zat aktifnya tahan terhadap pemanasan.
2. Maserasi dengan mesin pengaduk
Penggunaan mesin pengaduk yang berputar terus menerus sehingga waktu proses maserasi dapat dipersingkat menjadi 6 sampai 24 jam.
3. Remaserasi
Cairan penyari dibagi dua, seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua.
4. Maserasi melingkar
2. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan gaya kapiler yang cenderung untuk menahan. Untuk menentukan akhir perkolasi, dilakukan pemeriksaan zat aktif secara kualiitatif pada perkolat terakhir. Proses perkolasi terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak.
1. Reperkolasi
Simplisia dibagi dalam beberapa perkolator, hasil pekolator pertama dipisahkan menjadi perkolat I dan sari selanjutnya disebut susulan II. Susulan II digunakan untuk menyari perkolator 2, hasil perkolator II dipisahkan menjadi perkolat II dan sari selanjutnya disebut susulan III. Pekerjaan tersebut diulang sampai mendapat perkolat yang diinginkan. Untuk cara reperkolasi dapat dilakukan pada herba Timi.
2. Perkolasi Bertingkat
menggunakan cairan penyari yang baru diharapkan agar serbuk simplisia tersebut tersari sempurna. Sebaliknya serbuk simplisia yang baru disari dengan perkolat yang hampir jenuh. Dengan demikian akan diperoleh perkolat akhir yang jenuh. Perkolat dipisahkan dan dipekatkan.
3. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya dalam jangka waktu tertentu dimana pelarut akan terkondensasi pada pendingin menetes jatuh kembali ke labu. Keuntungan dari metode ini adalah digunakan untuk mengekstraksi sampel-sampel yang mempunyai tekstur kasar dan tahan pemanasan langsung. Kerugiannya adalah membutuhkan volume total pelarut yang besar (Mayo, et al., 1955; Landgrebe, 1982).
4. Sokletasi
Sokletasi adalah ekstraksi kontinu menggunakan alat soklet di mana pelarut akan terkondensasi dari labu menuju pendingin, kemudian jatuh membasahi sampel dan mengisi bagian tengah alat soklet. Tabung sifon juga terisi dengan larutan ekstraksi dan ketika tinggi cairan mencapai bagian atas tabung sifon, larutan tersebut akan kembali ke dalam labu. Keuntungan metode ini adalah dapat digunakan untuk sampel dengan tekstur yang lunak dan tidak tahan terhadap pemanasan secara langsung, pelarut yang digunakan lebih sedikit, pemanasannya dapat diatur (Mayo, et al., 1955; Landgrebe, 1982).
5. Digesti
6. Infundasi
Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98ºC) selama waktu tertentu (15-20 menit).
Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30 menit) dan temperatur sampai titik didih air.
2.3.1 Ekstraksi cair-cair
Ekstraksi cair-cair merupakan suatu teknik yang mana suatu larutan (biasanya dalam air) dibuat bersentuhan dengan suatu pelarut kedua (biasanya pelarut organik), yang pada hakikatnya tidak tercampurkan, pada proses ini terjadi pemindahan satu atau lebih zat terlarut (solute) kedalam pelarut yang kedua (Bassett, dkk., 1994).
Pemisahan yang dapat dilakukan bersifat sederhana, bersih, cepat, dan mudah, yang dapat dilakukan dengan cara mengocok-ngocok dalam sebuah corong pisah selama beberapa menit (Bassett, dkk., 1994). Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah molekul-molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang bersifat nonpolar atau agak polar. Sementara itu senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi dan senyawa polar lainnya akan tertahan dalam fase air (Rohman, 2007).
2.4 Kromatografi
Kromatografi adalah suatu metode yang digunakan untuk pemisahan komponen cuplikan yang komponen-komponenya terdistribusi antara dua fase, salah satunya diam dan yang lainnya bergerak. Saat ini, kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif (analitik) maupun kuantitatif dan preparatif dalam bidang farmasi (Rohman, 2007).
2.4.1 Kromatografi lapis tipis
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau proses reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom, melakukan screening sampel untuk obat (Gritter, et al., 1991)
Fase diam pada KLT sering disebut penyerap, walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Ukuran partikel penyerap KLT biasanya lebih kecil dari 63 µm (Gritter, et al., 1991). Banyak penyerap yang telah digunakan, termasuk silika gel, selulosa, aluminium oksida, poliamid dan silika gel dengan ikatan kimia rangkap, dengan ketebalan sekitar 0,10 sampai 0,25 mm, didukung oleh plat kaca, alumunium atau plastik (Wall, 2005). Kromatografi lapis tipis-kinerja tinggi atau High Performance-Thin Layer Chromatography (HPTLC) menghasilkan pemisahan dan hasil analisis yang lebih
