Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap Sel MCF-7

(1)

Lampiran 1. Hasil identifikasi hewan kuda laut

(Hippocampus trimaculatus

(2)

Lampiran 2. Gambar simplisia kuda laut

(Hippocampus trimaculatus

Leach.)

(3)

Lampiran 3. Bagan kerja pembuatan ekstrak etanol

Ditambahkan etanol 96%, biarkan selama 3 hari

Disaring

Dicuci kembali dengan etanol 96%

Dicuci kembali dengan

etanol 96%

Dipekatkan dengan

rotary evaporator

Dikeringkan dengan

freeze dryer

250 g serbuk

simplisia kuda

laut

Ampas

Maserat

Ampas

Maserat

Ampas

(4)

Lampiran 4. Bagan fraksinasi ekstrak etanol kuda laut

Dilarutkan dalam etanol 96% sampai larut

Dimasukkan kedalam corong pisah

Ditambahkan 40 ml aquadest

Ditambahkan 100 ml

n

-heksana

Dikocok

Dilakukan penambahan

n

-heksana dan pengocokan sampai

memberikan hasil negatif dengan pereaksi Liebermann Burchard

Diambil lapisan

n

-heksana dengan cara dialirkan

Diuapkan dengan penguap vakum putar pada suhu ± 50

0

C

Ekstrak etanol

Lapisan

n

-

Lapisan Air

(5)

Lampiran 5. Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7

a. Kontrol sel dan kontrol media

(6)

(7)

(8)

Lampiran 6. Perhitungan persen sel hidup sel Vero

a. Kontrol sel dan kontrol media

Absorbansi

% sel hidup

(9)

Lampiran 7. Perhitungan IC

50

a.

Fraksi

n

-heksana

dengan analisa probit SPSS 19

Confidence Limits

Probability

95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)b

(10)

b.

Fraksi KL I

Probability

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)a

Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound

(11)

c.

Fraksi KL II

Probability

95% Confidence Limits for konsentrasi fraksi

95% Confidence Limits for log(konsentrasi fraksi)b

(12)

d.

Fraksi KL III

Probability

(13)

e.

Fraksi KL IV

Probability

95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak 95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)a

(14)

f.

Fraksi KL V

Probability

(15)

g.

Isolat KL I

Probability

(16)

h.

Doksorubisin MCF-7

Probability

(17)

i.

Isolat KL I sel vero

Probability

95% Confidence Limits for konsentrasi 95% Confidence Limits for log(konsentrasi)a

(18)

Lampiran 8. Bagan pembuatan media RPMI

Dimasukkan kedalam erlenmeyer

Ditambahkan 800 ml aquabidest steril

Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet

Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)

Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l

Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan

Ditampung dalam botol steril

Diberi identitas pada botol media

Disimpan pada suhu 2 – 8

o

C

2 g Hepes

2 g NaHCO

3

RPMI

Larutan media

(19)

Lampiran 9. Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK)

Dicampur

Diberi identitas pada botol MK

Disimpan pada suhu 2 – 8

o

C

RPMI ad

100%

Fungizone

(amphoterici

n B) (0,5%)

Penisilin-

Streptomisin

(2%)

%)

Fetal Bovine

Serum (FBS)

(10%)

(20)

Lampiran 10. Bagan penumbuhan sel MCF-7

Diambil diambil dari

freezer

Diambil beberapa tetes

Dimasukkan kedalam konikel yg berisi RPMI

Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit

Dibuang supernatan

Ditambahkan 4 ml MK RPMI

Di resuspensi hingga homogen

Dimasukkan ke dalam flask

Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask

Dihomogenkan

Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted

Diberi identitas pada flask

Disimpan dalam inkubator CO

2

Sel MCF-7 dalam

Konikel

Flask

(21)

Lampiran 11. Bagan panen sel MCF-7

Dipersiapkan dan dikondisikan

Diamati apakah sel telah konfluen 80%

Dibuang MK dari flask dengan mikropipet

Dicuci sel 2x dengan PBS

Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25%

Diinkubasi dalam inkubator CO

2

Ditambahkan 4 ml MK

selama 5 menit

Di resuspensi dengan mikropipet

Diamati sel dibawah mikroskop inverted

Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol

Ditransfer sel kedalam tabung konikel

Sel MCF-7, alat, dan

bahan

Sel yang

l k

(22)

Lampiran 12. Bagan penghitungan sel

Diambil 10µl panenan sel

Dipipetkan kedalam hemositometer

Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop

Lampiran 13. Bagan pembuatan larutan uji

Ditimbang masing-masing bahan

Dimasukkan kedalam polytube

Dilarutkan dalam 1000 µl DMSO

Di vortex

Dibuat pengenceran sampai diperoleh

konsentrasi 250 µg/ml, 125 µg/ml,

62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml dan 15,625 µg/ml

Kultur Sel MCF-7

Jumlah Sel

Doksorubisin

Isolat KL I

Fraksi KL I-V

Fraksi

n

-heksana

(23)

Lampiran 14. Bagan pengujian sitotoksik

Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan

kepadatan 1 x 10

Diinkubasi selama 24 jam

4

Dibuang medium

Ditambahkan medium baru

Ditambahkan larutan uji

Diinkubasi selama 24 jam

Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam

Dicuci dengan PBS

Ditambahkan 100 µl MK dan 10 µl MTT (5 mg/ml)

Diinkubasi selama 4-6 jam

Ditambahkan SDS (sebagai stopper)

Dibungkus dengan aluminium foil

Dibiarkan selama 1 malam

Dibaca serapan dengan ELISA reader pada

λ 595 nm

Dihitung % sel hidup

Dihitung IC

50

SPSS 19

dengan analisa probit menggunakan

Sel MCF-7

Absorbansi

(24)

Lampiran 15. Bagan pengujian penghambatan pada siklus sel

dimasukkan 1x10

6

(6 sumuran)

sel per sumuran

diinkubasi selama 24 jam

diberikan seri larutan isolat dan doksorubisin

diinkubasi selama 24 jam

dikumpulkan sel yang mengapung dan

melekat dengan memberikan tripsin 0,025%

dipindahkan ke konikel

dicuci dengan 1 ml PBS sebanyak 2 kali

dipindahkan kedalam konikel yang sama

disentrifuse dan lapisan supernatant dibuang

difiksasi dengan etanol 70% dalam PBS

pada suhu -20

o

C selama 2 jam

dicuci dengan PBS dingin 1 ml sebanyak 2

kali dan diresuspensi

di sentrifuse 3000 rpm selama 3 menit dan

lapisan supernatant dibuang

ditambahkan larutan RNase/PI dan

diresuspensi sampai homogen dan

diinkubasi 10 menit

dianalisa dengan

flowcytometer

Sel

MCF-7

Endapan

(25)

Lampiran 16. Bagan analisis ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan

diberi larutan isolat dan doksorubisin

diinkubasi selama 24 jam dan dicuci PBS

ditambahkan methanol dingin dan diinkubasi

dalam

freezer

-4

o

dibuang metanol dengan mikropipet

C selama 10 menit

diangkat dari plate 24 sumuran dan

diletakkan pada objek glass

dicuci dengan akuades 500 µL sebanyak

3 kali

ditambahkan larutan H

2

O

2

menit dan dibuang H

3% dibiarkan 10

2

O

2

pada objek glass

ditambahkan

prediluted blocking serum

diamkan 10 menit kemudian dibuang

ditambahkan antibodi kaspase 9 dan siklin

D1 inkubasi 1 jam dan cuci dengan PBS

ditetesi antibodi sekunder inkubasi 10 menit

dicuci dengan PBS dan tetesi

streptavidin-

HRP

dicuci dengan PBS dan tambahkan 3,3’-

DAB dan inkubasi 5 menit (sampai warna

coklat)

dicuci dengan PBS dan tambahkan larutan

Mayer-Haematoksilin

dan inkubasi 5 menit

(26)

Lampiran 17. Spektrum HRMS isolat KL I

(27)

(28)

Lampiran 18. Sel MCF-7 di bawah mikroskop

Keterangan: a. Sel MCF-7 sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10)

b. Sel MCF-7 setelah diberi larutan uji (sel mengalami

perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

(29)

Lampiran 19. Kristal formazan dan sel vero di bawah mikroskop

a

b

Keterangan: a. Kristal Formazan (perbesaran 10 x 10)

b. Sel vero (perbesaran 10x10)

(30)

Lampiran 20. Mikroskop inverted,

elisa reader

,

flowcytometer

,

laminar air

flow

dan inkubator CO

2

Keterangan :

Elisa reader

Keterangan : Mikroskop

inverted

(31)

Keterangan:

Flowcytometer