TESIS
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT
(Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
Oleh:
DENNY SATRIA
NIM 127014009
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT
(Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
Oleh:
DENNY SATRIA
NIM 127014009
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT
(Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
Oleh:
DENNY SATRIA
NIM 127014009
Medan, Maret 2014 Menyetujui:
Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. NIP 194908111976031001 NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt. NIP 196602091992031003 NIP 195108161980031002
Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt.
NIP 194908111976031001
Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed.
NIP 196602091992031003
Mengetahui: Disahkan Oleh:
Ketua Program Studi, Dekan,
PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Denny Satria Nomor Induk Mahasiswa : 127014009
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap
Sel MCF-7.
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Rabu tanggal
dua belas bulan Februari tahun dua ribu empat belas.
Mengesahkan:
Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis : Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt.
Anggota Tim Penguji : Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M. Biomed.
Prof. Dr. Rosidah, M. Si., Apt.
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa : Denny Satria
Nomor Induk Mahasiswa : 127014009
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut
(Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap
Sel MCF-7
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya
sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut
plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun
oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan
menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan
sehat.
Medan, Maret 2014 Yang membuat pernyataan,
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang Maha Kuasa yang telah
melimpahkan rahmat, karunia, dan RidhoNya, sehingga penulis dapat
menyelesaikan tesis yang berjudul “Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut
(Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap Sel MCF-7”. Tesis ini diajukan
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister farmasi pada Fakultas
Farmasi Universita Sumatera Utara. Shalawat dan salam kepada Rasulullah SAW.
Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan
bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil. Untuk itu
penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga
kepada:
1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu,
DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K)., atas kesempatan dan fasilitas yang
diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program
Magister.
2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr.
Sumadio Hadisahputra, Apt., yang telah menyediakan fasilitas dan
kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi
Fakultas Farmasi.
3. Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., yang telah menyediakan
fasilitas bagi penulis selama menjadi mahasiswa Program Studi Magister
4. Bapak Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt., selaku Pembimbing I yang
tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan
semangat dengan penuh kesabaran sehingga penulis terpacu untuk
menyelesaikan penelitian dan penyelesaian tesis ini.
5. Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed., selaku Pembimbing II yang
tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberi saran dan dorongan
dengan penuh kesabaran selama penulis menjalani penelitian dan penyelesaian
tesis ini.
6. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan bapak Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt.,
sebagai penguji.
7. Ibu Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi
beserta staf.
8. Bapak Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., S.U., Ph.D., Sp.Park., Kepala
Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
beserta staf.
9. Bapak Prof. Dr. rer. nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., Kepala
Laboratorium Penelitian beserta staf.
10.Bapak dan Ibu Staff Pengajar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara
yang telah mendidik penulis selama perkuliahan.
Penulis juga tidak lupa mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang
tulus kepada orang tua, Ayahanda dan Ibunda tercinta Syamsul Bahri dan Ade
Irma Syuryani, dan kakak tersayang Rahmawati atas doa dan dukungan baik moril
maupun materil, serta adik-adik tersayang, Alwan Husein, Fauzi dan Alfalah atas
abang Abdi Wira Septama, M.Sc., Puji Lestari M.Si., Apt., Vonna Aulianshah,
S.Farm., Apt., Mainal Furqan, S.Si., Apt., dan Fitri Yanti, S.Farm., Apt., Ramses
Alfredo, S.Farm., Apt, Hendra, Adhli, Faisal, Nevi terima kasih atas motivasinya
dan semua pihak yang selalu memberi semangat, saran, dan nasehat.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih banyak kekurangannya, oleh
karena itu sangat diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari
semua pihak guna perbaikan tesis ini. Akhir kata penulis berharap semoga tesis ini
bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.
Medan, Maret 2014
Penulis,
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7
ABSTRAK
Indonesia adalah bagian dari wilayah Indopasifik, yang merupakan salah satu pusat keanekaragaman biota laut yang terbesar di dunia. Kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) adalah sejenis ikan laut dan termasuk kedalam familia Syngnathidae dan banyak digunakan sebagai obat kuat, penguat saraf dan pengobatan kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengetahui aktivitas serta mekanisme isolat yang diperoleh dari fraksi n -heksana kuda laut terhadap sel MCF-7.
Ekstraksi kuda laut dilakukan dengan cara maserasi dan fraksinasi ekstrak etanol dengan ekstraksi cair-cair (ECC). Fraksinasi terhadap fraksi paling aktif dilakukan dengan kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan fase gerak
n-heksana: etilasetat secara landaian, kemudian dilanjutkan dengan kromatografi kolom dengan fase gerak n-heksana: etilasetat secara landaian. Penentuan struktur isolat dilakukan dengan spektrofotometri UV dan IR, spektrometri massa dan NMR. Pengujian aktivitas sitotoksisitas dilakukan terhadap fraksi dan isolat terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromida]. Pengujian penghambatan terhadap siklus sel menggunakan flow cytometer dan dilakukan imunositokimia terhadap ekspresi siklin D 1 dan kaspase 9 terhadap sel MCF-7.
Pengolahan data untuk penentuan nilai IC50 menggunakan analisis probit
pada program SPSS 19. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa fraksi KL I IC50 122.391,863 µg/ml, KL II IC50 45,392 µg/ml, KL III IC50 144,774 µg/ml,
KL IV IC50 285,723 µg/ml, KLV IC50 214,890 µg/ml dan doksorubisin 7,875
µg/ml. Hasil pengujian sitotoksisitas larutan uji dari isolat dari fraksi KCV KL II terhadap sel MCF-7 memberikan nilai IC50 22,082 µg/ml terhadap sel MCF-7.
Isolat dikarakterisasi dengan spektroskopi UV, FT-IR, HRMS, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC). Dari hasil karakterisasi menggunakan Spektrofotometer UV diperoleh spektrum dengan puncak absorpsi maksimum pada panjang gelombang 205,8 nm dan spektrum infra merah menunjukkan adanya gugus OH pada bilangan gelombang 3387 cm-1, -CH alifatis (pada CH3) pada 2939,52 cm-1, C=C pada 1589,34 cm-1, CH2 pada
1450,47 cm-1, CH3 pada 1373,32 cm-1, C-O pada 1049,28 cm-1; spektrum 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (COSY, HMBC dan HSQC) menunjukkan bahwa isolat mempunyai 27 atom karbon yang terdiri dari 5 CH3, 11 CH2, 8 CH dan 3 atom
karbon kuarterner dengan gugus fungsi siklis, alkil, hidroksi dan ena non konjugasi dan spektrum HRMS menunjukkan berat molekul 386,3543 (C27H46O,
berat molekul perhitungan 386,3551). Berdasarkan hasil karakterisasi isolat dapat disimpulkan bahwa isolat KL 1 adalah cholest-5-en-3β-ol (kolesterol). Isolat menunjukkan peningkatan pada fase sub G1 pada siklus sel, menghambat ekspresi siklin D 1 dan meningkatkan ekspresi kaspase 9 pada imunositokimia terhadap sel MCF-7.
ELUCIDATION STRUCTURE OF ACTIVE COMPOUND SEA HORSE (Hippocampus trimaculatus Leach.) ON MCF-7 CELL LINE
ABSTRACT
Indonesia is a part of Indopasifik region, which is one of the centers of diversity of marine life and biggest in the world
Sea horse extraction carried out with maceration and fractination with liquid-liquid extraction (LLE). Fractionation to the most active fraction with vaccume liquid chromatography (VLC) using gradient eluent n-hexane: ethylacetate, continue with column chromatography using gradient eluent n-hexane: ethylacetate. structure determination of isolate using UV and IR spectrophotometer, mass spectrometer and NMR. Cytotoxicity activity assay of fractions and isolate of sea horse on MCF-7 cell using MTT method [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide]. Inhibition examination of cell cycle using flowcytometer and immunocytochemistry of cyclin D 1 and caspase 9 expression on MCF-7 cell line.
. Sea horse (Hippocampus trimaculatus Leach.) is kind of sea fish and include in Syngnathidae family, much have been used as afrodisiac, nerve tonic and breast cancer treatment. This research have a purpose to isolation and know the activity and the mechanism isolate from n-hexane fraction sea horse on MCF-7 cell line.
Data processing for determination of IC50 values using probit analysis in
SPSS 19. The result of cytotoxicity assay show KL I fraction IC50 122391.863
µg/ml, KL II IC50 45.392 µg/ml, KL III IC50 144.774 µg/ml, KL IV IC50 285.723
µg/ml, KL V IC50 214.890 µg/ml and doxorubicin 7.875 µg/ml. The result of
cytotoxicity assay isolate from KL II fraction show IC50 22.082 µg/ml on MCF-7
cell line. Isolate characterized with UV and IR spectrophotometer, HRMS and 1 H-NMR, 13C-NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC and HSQC). From the characterization result using UV spectrophotometer obtainable spectrum with maximum absorbstion peak at wave length 205.8 nm and from infra red spectrum show OH group at wave number 3387 cm-1, -CH aliphatic (on CH3) at 2939.52
cm-1, C=C at 1589.34 cm-1, CH2 at 1450.47 cm-1, CH3 at 1373.32 cm-1, C-O at
1049.28 cm-1; spectrum 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC) shows isolate have 27 carbon consisting of 5 CH3, 11 CH2, 8 CH and
3 quartener carbon with functional group cyclics, alkyl, hydroxyl and ena non conjugated and HRMS spectrum show molecular weight 386.3543 (C27H46O,
molecular weight calculation 386,3551). Based on the result of characterization of isolate it can be concluded isolate KL 1 is cholest-5-en-3β-ol (cholesterol). Isolate can increase at sub G1 phase on cell cycle, inhibition cyclin D 1 expression and increase caspase 9 expression at immunocytochemistry on MCF-7 cell line.
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
PENGESAHAN TESIS ... iv
SURAT PERNYATAAN ... v
KATA PENGANTAR ... vi
ABSTRAK ... ix
ABSTRACT ... x
DAFTAR ISI ... xi
DAFTAR TABEL ... xvii
DAFTAR GAMBAR ... xviii
DAFTAR LAMPIRAN ... xxii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 4
1.3 Hipotesis ... 5
1.4 Tujuan Penelitian ... 5
1.5 Manfaat Penelitian ... 5
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 7
2.1 Uraian Hewan ... 7
2.1.2 Sistematika Hewan ... 7
2.1.3 Morfologi Hewan ... 8
2.1.4 Kandungan Kimia ... 8
2.1.5 Kegunaan (khasiat) kuda laut ... 9
2.2 Kanker ... 9
2.2.1 Karsinogenesis ... 12
2.2.2 Kanker payudara ... 15
2.2.3 Sel MCF-7 ... 19
2.2.4 P-glikoprotein ... 20
2.2.5 Siklus sel ... 23
2.2.6 Doksorubisin ... 26
2.2.7 Uji sitotoksik menggunakan metode MTT ... 28
2.2.8 Flow cytometry ... 29
2.3 Ekstraksi ... 31
2.3.1 Ekstraksi cair-cair ... 36
2.4 Kromatografi ... 37
2.4.1 Kromatografi lapis tipis ... 37
2.4.2 Kromatografi lapis tipis preparatif ... 39
2.4.3 Kromatografi lapis tipis dua arah ... 40
2.4.4 Kromatografi kolom ... 41
2.4.5 Kromatografi cair vakum ... 41
2.5 Spektrofotometri Ultraviolet ... 42
2.6 Spektrofotometri Inframerah ... 43
2.8 Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic
Resonance)... 45
BAB III METODE PENELITIAN ... 46
3.1 Alat dan Bahan ... 46
3.1.1 Alat ... 46
3.1.2 Bahan ... 47
3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel ... 47
3.2.1 Pengambilan sampel ... 47
3.2.2 Identifikasi hewan kuda laut ... 47
3.2.3 Pembuatan sampel ... 48
3.3 Pembuatan Ekstrak ... 48
3.3.1 Pembuatan fraksi-fraksi dari ekstrak etanol ... 48
3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan... 49
3.5 Pembuatan Media ... 49
3.5.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ... 49
3.5.2 Pembuatan media kultur lengkap (MK) ... 50
3.6 Penumbuhan Sel MCF-7 ... 50
3.6.1 Penumbuhan sel ... 50
3.6.2 Subkultur sel ... 51
3.6.3 Panen sel MCF-7 ... 51
3.6.4 Penghitungan sel ... 51
3.7 Pembuatan Larutan Uji ... 52
3.8 Uji Antikanker ... 53
3.8.1 Uji Sitotoksik ... 53
3.8.2 Penghambatan pada Siklus sel (Cell Cycle) ... 53
3.8.3 Selectivity Index ... 54
3.8.4 Analisis Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan Imunositokimia ... 55
3.9 Analisis Hasil ... 56
3.10 Analisis Fraksi n-heksana dan Kloroform secara KLT .... 56
3.11 Fraksinasi Fraksi n-heksana dan Kloroform dengan KCV (Kromatografi Cair Vakum) ... 57
3.12 Analisis KLT Hasil KCV ... 57
3.13 Isolasi Senyawa Hasil Fraksinasi secara Kromatografi Kolom ... 57
3.14 Analisis Eluat (hasil fraksinasi kolom) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... 58
3.15 Uji Kemurnian Isolat ... 58
3.16 Karakterisasi Isolat ... 59
3.16.1 Karakterisasi Isolat secara Spektrofotometri UV ... 59
3.16.2 Karakterisasi Isolat secara Spektrofotometri IR ... 59
3.16.3 Karakterisasi Isolat secara Spektrometri Massa ... 60
3.16.4 Karakterisasi Isolat dengan Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ... 60
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 61
4.1 Hasil Identifikasi Hewan ... 61
4.2 Hasil Ekstraksi ... 61
4.4 Hasil Uji Sitotoksisitas Isolat Kuda Laut terhadap Sel
Vero dan Selectivity Index (SI) ... 63
4.5 Hasil Uji Penghambatan Siklus Sel dengan
Flowcytometer ... 64
4.6 Hasil Analisi Ekspresi kaspase 9 dan siklin D1 dengan
Imunositokimia ... 67
4.7 Hasil Analisis Fraksi n-heksana dengan
Cara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... 70
4.8 Hasil Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi
Cair Vakum (KCV) ... 71
4.9 Hasil Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi
Kolom ... 72
4.10 Hasil Analisi KLT dari Hasil Pemisahan dengan Kolom
Kromatografi ... 73
4.11 Hasil Analisi KLT Isolat ... 74
4.12 Hasil Pemeriksaan Kemurnian dengan Kromatografi
Lapis Tipis Dua Arah ... 74
4.13 Hasil Karakterisasi Isolat KL I dengan
Spektrofotometer Sinar Ultra Violet ... 75
4.14 Hasil Karakterisasi Isolat KL I dengan
Spektrofotometer Infra Merah ... 76
4.15 Spektrum NMR Karbon-13 ... 78
4.16 Spektrum NMR Proton ... 86
4.17 Spektrum DEPT (Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer) ... 91
Spectroscopy) ... 102
4.22 Spektrum NOESY (1H-1 Spectroscopy) ... 103
H Nuclear Overhouser Effect BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 108
5.1 Kesimpulan ... 108
5.2 Saran ... 108
DAFTAR PUSTAKA ... 109
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 4.1 Persentase akumulasi pada tiap fase dalam siklus sel ... 64
Tabel 4.2 Harga Rf hasil KLT fraksi n-heksana kuda laut ... 70
Tabel 4.3 Interpretasi spektrum IR isolat terhadap serapan dan
bilangan gelombang ... 76
Tabel 4.4 Korelasi frekuensi C-O dengan stereokimia ... 77
Tabel 4.5 Data pergeseran kimia spektrum 13
KL I ... 79 C-NMR dari isolat
Tabel 4.6 Perbandingan data 13
literatur ... 85 C-NMR hasil penelitian dan data
Tabel 4.7 Data karbon CH2, CH dan CH3 dari isolat KL I ... 92
Tabel 4.8 Data 13
Tabel 4.9 Perhitungan berat molekul isolat KL I berdasarkan berat
C-NMR dan DEPT isolat KL I ... 93
atom penyusunnya ... 94
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ... 6
Gambar 2.1 Morfologi hewan kuda laut ... 8
Gambar 2.2 Multitahap karsinogenesis ... 14
Gambar 2.3 Metastasis sel kanker melalui pembuluh limfoid ... 15
Gambar 2.4 Kanker payudara ... 18
Gambar 2.5 Mekanisme pemompaan oleh Pgp ... 22
Gambar 2.6 Checkpoints siklus sel ... 25
Gambar 2.7 Reduksi MTT menjadi formazan ... 28
Gambar 4.1 Hasil flow cytometer sel MCF-7 dengan pemberian doksorubisin dan isolat KL I ... 41
Gambar 4.2 Histogram siklus sel MCF-7 yang menunjukkan sedikit sel yang mengalami agregat (double cell) ditunjukkan oleh tanda panah ... 67
Gambar 4.3 Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 pada sel MCF-7 yang diberi doksorubisin dan isolat KL I ... 68
Gambar 4.4 Kromatogram hasil analisis fraksi n-heksana dengan KLT ... 70
Gambar 4.5 Bagan kerja KCV dan kromatografi kolom ... 72
Gambar 4.6 Bagan kerja fraksinasi dengan kolom kromatografi .... 73
Gambar 4.7 Kromatogram uji kemurnian dengan empat jenis fase gerak yang berbeda ... 74
Gambar 4.8 Kromatogram KLT dua arah isolat KL I ... 75
Gambar 4.9 Spektrum ultraviolet isolat KL I ... 75
Gambar 4.10 Spektrum infra merah isolat KL I ... 76
Gambar 4.12 Spektrum 13
Gambar 4.14 Spektrum 13
Gambar 4.15 Spektrum
C-NMR isolat KL I (42,3222 ppm) ... 80
13
(11,8559 – 19,3919 ppm) ... 81 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.16 Spektrum 13
(21,0842 – 24,2902 ppm) ... 81 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.17 Spektrum 13
(28,0107 – 31,9074 ppm) ... 82 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.18 Spektrum 13
(35,7823 – 37,2509 ppm) ... 83 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.19 Spektrum 13
(39,5164 – 42,3222 ppm) ... 84 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.20 Spektrum 13
(50,1360 – 56,7684 ppm) ... 84 C-NMR isolat KL I
Gambar 4.21 Spektrum dari pelarut CDCl3
Gambar 4.22 Spektrum H-NMR isolat KL I yang menunjukkan
Gambar 4.25 Spektrum 1
(metin) ... 88 H-NMR isolat KL I cirri atom C-3
Gambar 4.26 Orientasi gugus OH pada atom C-3... 88
Gambar 4.27 Kedudukan gugus OH pada atom C menempati
posisi β-ekuatorial ... 90
Gambar 4.28 Spektrum 1
Gambar 4.30 Spektrum DEPT isolat KL I
(11,8585 – 42,2971 ppm) ... 92
Gambar 4.31 Spektrum DEPT isolat KL I (50,1378- 121,7262 ppm) ... 93
Gambar 4.32 Spektrum massa (HRMS) dari isolat KL I ... 94
Gambar 4.33 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-3; H-3 dan C-6; H-6) ... 95
Gambar 4.34 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-21; H-21, C-19; H-19 dan C-26; H-26) ... 96
Gambar 4.35 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-4; H-4) ... 96
Gambar 4.36 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-18; H-18, C-21; H-21 dan C-19; H-19) ... 97
Gambar 4.37 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-7;H-7, C-24; H-24, C-9; H-9, C-17; H-17, C-1; H-1 dan C-12;H-12 ... 97
Gambar 4.38 Spektrum HMBC isolat KL I ... 99
Gambar 4.39 Interaksi antara H-1 dengan C-5 dan C-9 ... 99
Gambar 4.40 Interaksi antara H-12 dengan C-14 dan C-17 ... 100
Gambar 4.41 Interaksi antara atom H-22 dengan C-21, C-24, C-20 dengan C-21 dan C-24 dan C-17 dengan C-21 ... 100
Gambar 4.42 Interaksi antara H-24 dengan C-26, C-27, H-26 dengan C-27 dan H-25 dengan C-26 dan C-27 ... 101
Gambar 4.43 Interaksi proton dan karbon ... 101
Gambar 4.44 Spektrum COSY isolat KL I (H-3; H-2; H-4 dan H-6; H-7... 102
Gambar 4.45 Spektrum COSY isolat KL I (H-3; dan H-2; H-4) ... 103
Gambar 4.46 Spektrum NOESY isolat KL I ... 104
Gambar 4.48 Hubungan antara masing-masing proton dengan
NOE ... 105
Gambar 4.49 Senyawa cholest-5en-3β-ol (kolesterol) ... 105
Gambar 4.50 Kedudukan atom H pada atom C-3 ... 106
Gambar 4.51 Pembuktian bahwa gugus OH tidak berkedudukan α .. 106
Gambar 4.52 Pola pemecahan anak puncak jika gugus OH
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Hasil identifikasi hewan kuda laut ... 118
Lampiran 2 Simplisia kuda laut ... 119
Lampiran 3 Bagan kerja pembuatan ekstrak etanol ... 120
Lampiran 4 Bagan fraksinasi ekstrak etanol kuda laut ... 121
Lampiran 5 Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7... 122
Lampiran 6 Perhitungan persen sel hidup sel Vero ... 125
Lampiran 7 Perhitungan IC50 Lampiran 8 Bagan pembuatan media RPMI ... 135
dengan analisa probit SPSS 19 ... 126
Lampiran 9 Bagan pembuatan media kultur lengkap ... 136
Lampiran 10 Bagan penumbuhan sel MCF-7 ... 137
Lampiran 11 Bagan panel sel MCF-7 ... 138
Lampiran 12 Bagan penghitungan sel ... 139
Lampiran 13 Bagan pembuatan larutan uji ... 139
Lampiran 14 Bagan pengujian sitotoksik ... 140
Lampiran 15 Bagan pengujian penghambatan pada siklus sel ... 141
Lampiran 16 Bagan analisis ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan Imunositokimia ... 142
Lampiran 17 Spektrum HRMS isolat KL I ... 143
Lampiran 18 Sel MCF-7 dibawah mikroskop ... 145
Lampiran 19 Kristal formazan dan sel Vero dibawah mikroskop .... 146
