BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.6 Validasi Metode Analisis
2.6.2 Pengembangan Metode Bioanalisis
2.6.2.2 Kurva Kalibrasi
Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara respon instrumen dan konsentrasi analit yang diketahui. Kurva kalibrasi disiapkan dalam matriks biologi yang sama dengan sampel, dengan cara menambahkan sejumlah analit dengan konsentrasi yang diketahui ke dalam matriks. Rentang konsentrasi standar dipilih berdasarkan literatur atau penelitian. Pembuatan kurva kalibrasi harus mencakup sampel blangko (matriks tanpa baku dalam), sampe zero
(matriks dengan baku dalam), dan 6 sampai 8 non-zero
sampel pada rentang konsentrasi standar, termasuk LLOQ.
a. Lower Limit of Quantification (LLOQ)
Standar terendah dari kurva kalibrasi harus diterima sebagai LLOQ jika berada pada kondisi berikut: respon analit pada LLOQ setidaknya 5 kali respon sampel blangko, puncak analit (respon) harus dapat teridentifikasi, dapat terpisah dengan baik, dan
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
reprodusibel dengan nilai presisi ≤20% dan akurasi 80-120%.
b. Kurva Kalibrasi/ Kurva Standar/ Konsentrasi-Respon Syarat kurva kalibrasi agar dapat diterima, yaitu nilai nilai deviasi sebesar ≤20% dari konsentrasi LLOQ dan nilai nilai deviasi sebesar ≤15% dari konsentrasi standar selain LLOQ. Sedikitnya empat dari enam standar non-zero berada diatas kriteria diatas, termasuk LLOQ dan konsentrasi tertinggi dari kurva kalibrasi.
(Food and Drug Administration, 2001)
2.6.2.3Batas Deteksi (limit of detection, LOD)
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit diatas atau dibawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blangko (yb) ditambah dengan 3 simpangan baku blangko
(3Sb).
LOD dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope, S) kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai dengan rumus, LOD = 3,3 (SD/S) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.6.2.4Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ)
Batas Kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan. Seperti halnya LOD, LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan). Untuk menentukan LOQ, dapat menggunakan perhitungan yang didasarkan pada standar deviasi respon (SD) dan slope (S) kurva baku sesuai rumus : LOQ = 10 (SD/S) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.6.2.5Akurasi
Akurasi adalah suatu metode analisis yang menggambarkan kedekatan nilai rata-rata hasil uji yang diperoleh dengan nilai konsentrasi analit sebenarnya. Akurasi ditentukan oleh analisis berulang dari sampel yang telah diketahui kadar analit yang terkandung didalamnya (Food and Drug Administration, 2001). ICH merekomendasikan pengukuran minimal menggunakan 3 kali pengukuran (Ravichandranravichandran, V., Shalini S., Sundram K. M., Harish Rajak, 2010). Uji akurasi minimal menggunakan tiga konsentrasi pada rentang yang telah direkomendasikan, yaitu pada konsentrasi rendah (tiga kali LLOQ), sedang, dan tinggi dari kurva standar. Perbedaan nilai rata-rata harus + 15% terhadap nilai sebenarnya, kecuali pada LLOQ tidak boleh lebih dari 20% (Food and Drug Administration, 2001).
2.6.2.6Presisi
Presisi adalah suatu metode analisis yang menggambarkan kedekatan hasil pengukuran individu analit ketika suatu metode analisis diulang. ICH merekomendasikan pengukuran minimal menggunakan 3 kali pengukuran (Ravichandranravichandran, V., Shalini S., Sundram K. M., Harish Rajak, 2010). Uji presisi minimal
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menggunakan tiga konsentrasi pada rentang yang telah direkomendasikan, yaitu pada konsentrasi rendah (tiga kali LLOQ), sedang, dan tinggi dari kurva standar. Pengukuran presisi dikelompokkan menjadi within-run (selama waktu analisis), intra-batch precision atau repeatabilitas (dalam satu kali analisis) dan between-run, inter-batch precision
atau repeatabilitas (bila metode dilakukan oleh analis, alat, reagen, dan laboratorium yang berbeda). Perbedaan nilai rata-rata harus tidak lebih dari 15% terhadap nilai sebenarnya, kecuali pada LLOQ tidak boleh lebih dari 20% (Food and Drug Administration, 2001).
2.6.2.7Perolehan Kembali
Perolehan kembali suatu analit adalah respon detektor yang diperoleh dari jumlah analit yang ditambahkan dan diekstraksi dari matriks biologi dibandingkan dengan respon detektor analit yang diketahui konsentrasinya. Perolehan kembali analit tidak harus 100% namun tingkat perolehan kembali analit dan baku dalam harus konsisten, presisi, dan reprodusibel dengan rentang syarat 80-120%. Uji perolehan kembali harus dilakukan dengan membandingkan hasil analisis sampel pada tiga konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) yang diekstraksi dari matriks biologi dengan baku yang tidak diekstraksi yang mewakili perolehan kembali 100% (Food and Drug Administration,
2001).
2.6.2.8Stabilitas
Stabilitas obat dalam cairan biologis adalah fungsi dari kondisi penyimpanan, sifat-sifat kimia obat, matriks, dan sistem penyimpanan. Stabilitas analit dalam suatu matriks dan sistem penyimpanan hanya relevan pada
matriks dan sistem penyimpanan tersebut dan tidak dapat diekstrapolasikan ke matriks dan sistem penyimpanan lain.
Semua penentuan stabilitas harus menggunakan sampel yang disiapkan dari larutan stok analit yang dibuat baru dalam matriks biologis yang bebas analit dan bebas dari interferensi. Larutan stok analit harus disiapkan dalam pelarut yang sesuai pada konsentrasi yang diketahui.
Penentuan uji stabilitas dapat menggunakan beberapa cara, antara lain :
a. Stabilitas Beku-Cair
Stabilitas analit dapat ditentukan setelah tiga siklus beku-cair. Sedikitnya tiga larutan senyawa dari setiap konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi di simpan pada kondisi penyimpanan yang diinginkan selama 24 jam kemudian dikeluarkan dan dibiarkan hingga mencair pada temperatur ruang. Setelah semua mencair, sampel dibekukan kembali selama 12-24 jam pada kondisi yang sama. Siklus beku-cair ini harus diulang sebanyak 2 kali lagi, kemudian dianalisis setelah tiga siklus. Jika analit tidak stabil pada temperatur penyimpanan, maka uji dapat dilakukan dengan menyimpan sampel pada suhu -700C selama tiga siklus beku-cair.
b. Stabilitas Jangka Pendek
Tiga larutan senyawa dari setiap konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi dicairkan pada suhu ruang dan dibiarkan pada suhu ini selama 4 sampai 24 jam (atau berdasarkan durasi yang diperkirakan sampel stabil pada temperatur ruang berdasarkan penelitian) kemudian dianalisis.
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
c. Stabilitas Jangka Panjang
Waktu penyimpanan pada evaluasi stabilitas jangka panjang harus melebihi waktu pertama kali sampel di kumpulkan sampai waktu terakhir sampel dianalisis. Stabilitas jangka panjang ditentukan dengan menyimpan sedikitnya tiga larutan senyawa dari setiap konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi dicairkan pada kondisi yang sama seperti uji sampel. Konsentrasi dari semua sampel dibandingkan dengan rata-rata nilai perolehan kembali yang sesuai dengan konsentrasi standar dari hari pertama uji stabilitas jangka panjang.
d. Stabilitas Larutan Stok
Stabilitas larutan stok obat dan baku dalam harus dievaluasi pada temperatur ruang selama minimal 6 jam. Jika larutan stok dibekukan selama periode tertentu, perlu dicatat stabilitasnya. Setelah itu, dilakukan uji stabilitas dengan membandingkan respon instrumen terhadap larutan yang baru dibuat.
e. Stabilitas Post-Preparatif
Stabilitas dari sampel yang telah diproses, termasuk waktu sampel berada dalam autosampler. Stabilitas obat dan baku dalam harus ditentukan selama waktu analisis untuk setiap batch dalam validasi sampel dengan menentukan konsentrasi berdasarkan kalibrasi standar.
