BAB III METODOLOGI PENELITIAN
H. Alat dan Bahan Penelitian
I. Langkah-langkah Penelitian
Penelitian ini terbagi menjadi 3 tahap yaitu, tahap persiapan, tahap pelaksanaan, tahap perlakuan.
1. Tahap Persiapan
Tahap persiapan adalah tahap inventaris alat dan bahan yang dibutuhkan dalam penelitian. Pengumpulan bahan ekstrak dari Kebun Obat dengan cara pengambilan daun yang dalam kondisi baik untuk digunakan dalam penelitian. Getah diperoleh dari tangkai daun yang diputus dari batangnya.
2. Tahap Pelaksanaan a. Sterilisasi
Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda (Hadioetomo,1985 dalam Dewi 2010). Pratiwi (2008) menyampaikan bahwa metode sterilisasi panas merupakan metode yang paling dapat dipercaya dan banyak digunakan. Metode sterilisasi panas dengan uap air disebut metode sterilisasi panas basah. Sterilisasi panas basah menggunakan temperatur di atas 1000C dilakukan dengan uap yaitu
autoklaf. Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan, hal ini ditujukan agar alat-alat yang digunakan steril dari mikroba sehingga tidak mengkontaminasi media atau kultur. Sterilisasi dilakukan pada alat-alat yang berbahan kaca, alat-alat tersebut disterilkan dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi dilakukan pada tekanan 1 atm, suhu 1210C selama 15 menit. Media NA yang akan digunakan untuk mengkulturkan bakteri juga harus dalam kondisi steril, perlakuanya sama dengan sterilisasi alat hanya lama waktu autoklafnya yang berbeda jika alat selama 15 menit, untuk sterilisasi media cukup dengan 10 menit. Untuk alat-alat yang tidak tahan panas dapat disterilisasi dengan penyemprotan alkohol atau pembakaran dengan bunsen.
b. Ekstraksi Daun dan Penyulingan Getah 1) Ekstraksi Daun
Ekstraksi merupakan proses pengambilan sari yang berkhasiat atau zat tertentu yang ada pada tanaman herbal atau hewan. Menurut Voigt (1995) ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Cairan yang dapat digunakan
untuk menyari diantaranya air, ester, dan campuran etanol dengan air (Voight, 1995). Ektraksi biasanya dilakukan dengan melarutkan bahan yang akan dibuat substrat dengan pelarut tertentu. Tujuan dari dilakukannya ekstraksi adalah mendapatkan komponen kimia yang diperoleh dari bahan.
a)Pembuatan Ekstrak Daun Jarak tintir (Jatropha multifida L.)
Daun Jarak tintir (Jatropha multifida L.) dicuci bersih dengan aquades kemudian ditumbuk, diperas untuk mendapatkan sarinya. Setelah didapatkan pedoman konsentrasi kemudian dibuat seri pengenceran dengan aquades steril.
Ektrak pekat daun jarak tintir (Jatropha multifida L.), dibuat lima konsentrasi yaitu 5%, 10%, 25%, 50%, 100% dengan pengenceran menggunakan aquades steril. Setiap konsentrasi dibuat dengan menambahkan aquades steril sampai mencapai volume 10 ml, kecuali pada konsentrasi 100% yang merupakan ektrak murni. Volume ekstrak yang yang digunakan untuk penelitian dapat dilihat dalam tabel di bawah ini.
Tabel 3.3 : Volume ekstrak daun yang digunakan untuk membuat stok konsentrasi ekstrak.
Nilai Konsentrasi (%) Ekstrak Pekat Daun Jarak Tintir ( ml) 5 0,5 10 1 25 2,5 50 5 100 10
2) Penyulingan Getah
Getah didapatkan dengan memotong tangkai daun dan memisahkannya dari batang sehingga didapatkan getah Jarak tintir (Jatropha multifida L.) selain itu bisa juga dengan memotong batang yang muda dimana banyak terdapat getah. Dalam menyuling getah diusahakan agar tidak terkontaminasi. Volume getah yang digunakan untuk penelitian dapat dilihat dalam tabel di bawah ini.
Tabel 3.5 : Volume getah yang digunakan untuk membuat stok konsentrasi getah. Nilai Konsentrasi (%) Getah Jarak Tintir ( ml)
5 0,5
10 1
25 2,5
50 5
100 10
c. Pembuatan Media Kultur Bakteri
“Media mempengaruhi ukuran zona melalui efeknya terhadap kecepatan pertumbuhan organisme, kecepatan difusi obat antimikroba, dan aktivitas obat. Penggunaan media harus sesuai dengan metode tersebut “(Vandepitte, 2011 :112). Media yang akan digunakan untuk mengkulturkan bakteri Staphylococcus aureus adalah media NA, sebelum sterilisasi dilakukan pengukuran pH terhadap media kultur. Bila belum sesuai pengaturan pH bisa dilakukan dengan penambahan HCl atau NaOH. NA Oxoid dipanaskan dengan pemanas dicampurkan pada aquades dengan perbandingan, 500 :10 yaitu untuk membuat NA sebanyak 500 ml maka memerlukan Nutrient agar oxoid sebanyak 10 gram. Media NA dianggap sudah bisa diangkat apabila sudah berwarna jernih, Media
NA tidak bisa langsung digunakan melainkan harus disterilkan terlebih dahulu dengan autoklaf. Media NA pada cawan petri yang digunakan sebagai media kultur untuk menguji aktivitas antibakteri berisi masing-masing 10 ml. Sedangkan media yang akan digunakan sebagai media kultur bakteri agar miring pada tabung reaksi adalah masing-masing 5 ml. Media NA agar miring digunakan untuk meremajakan bakteri biakan murni.
3. Tahap Perlakuan
a. Pengujian Aktivitas Antibakteri dengan Media Difusi Agar
Metode difusi agar spread plate secara aseptis digunakan untuk mengetahui aktivitas antibakteri. Media NA steril sebanyak 10 ml dalam cawan petri di inokulum bakteri sebanyak 0,5 ml. Inokulum yang dipakai adalah inokulum pada konsentrasi 10-8cfu/mL. Setelah inokulum dimasukkan maka inokulum diratakan menggunakan batang L, perlakuan ini juga dilakukan dengan aseptis. Area cawan petri dibagi menjadi 3 kuadran, yang terdiri dari kontrol negatif, kontrol positif, dan perlakuan, hal ini dilakukan agar tidak terjadi tumpang tindih pertumbuhan atau penghambatan bakteri. Paper disc yang sudah direndam selama 10 menit dalam ekstrak konsentrasi tertentu dimasukan ke dalam media yang sudah diinokulum, paper disc diambil menggunakan pinset dibiarkan sesaat sebelum dimasukkan ke dalam cawan petri sehingga dapat berdifusi ke dalam media sekitarnya. Selanjutnya media tersebut di inkubasikan selama 1 hari (24 jam) dalam incubator dengan suhu 370C, setelah itu dilihat dan diukur diameter zona hambat yang mengelilingi paper disc tersebut dengan jangka sorong. Pada suhu 370C karena pada suhu tersebut tidak mengalami perpanjangan fase lag pada pertumbuhan bakteri dan viabilitas bakteri tidak menurun. Selama 24 jam karena sel bakteri diduga sudah dalam fase death. Hasilnya adalah zona hambat
antibakteri pada pertumbuhan bakteri, biasanya terlihat lebih bening daripada daerah sekitarnya. Ukuran zona jernih tergantung kepada kecepatan difusi antimikroba, derajat sensitifitas, mikroorganisme dan kecepatan pertumbuhan bakteri (Anonim, 2011). Keefektifan ekstrak dilihat dari zona hambat yang didapat.
b. Pengujian Nilai MIC atau KHM
Ada dua macam metode dilusi yaitu metode dilusi cair dan metode dilusi padat. Pada penelitian ini menggunakan metode dilusi padat. Konsentrasi ekstrak daun dan getah jarak tintir adalah 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, ditambah 1 kelompok kontrol positif, kontrol negatif, dan kontrol media. Konsentrasi minimal yang di dapat dari uji aktivitas digunakan sebagai acuan untuk menentukan konsentrasi yang akan digunakan dalam pengujian nilai MIC atau KHM. Pengujian dilakukan dengan metode dilusi padat, metode ini dilakukan dengan cara penanaman bakteri secara pourplate atau cawan tuang. Prosedur pourplate
adalah dengan mendinginkan media kultur yang sudah disterilkan dalam tabung reaksi sampai dengan suhu 450C, kemudian dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi mikroba uji dan sampel ekstrak (Cappuccino,2008). Media kultur yang digunakan adalah 10 ml, sedangkan bakteri uji yang digunakan adalah bakteri uji pada konsentrasi 10-8cfu/mL yang di vortex dahulu sebelum digunakan sebanyak 0,5 ml sampel ekstrak sebanyak 0,5 ml. Setelah pourplate dilakukan langkah selanjutnya adalah menginkubasinya selama 24 jam dalam suhu 370C, penentuan nilai MIC atau KHM dilihat dari konsentrasi terendah yang medianya tidak ditumbuhi bakteri.
c. Pengujian MBC atau KBM
Metode streak dengan cottonbude steril dilakukan untuk menegaskan nilai MBC yang diperoleh dari media yang digunakan dalam uji MIC. Metode streakplate dilakukan dengan cara menggoreskan bakteri uji pada permukaan media agar menggunakan jarum ose yang dibagi menjadi 3 kuadran, kerapatan goresan pada masing-masing kuadran berbeda berturut rapatnya mulai dari kuadran pertama hingga kuadran ketiga.
Setelah di dapatkan nilai MIC atau KHM langkah selanjutnya adalah memilih 2 konsentrasi paling besar dalam uji MIC atau KHM yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri , hal tersebut di tandai dengan media yang tidak ditumbuhi oleh bakteri. Dua media paling jernih dibandingkan dengan menstreakan cotton bud steril pada media kultur baru kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 370C, media kultur yang tidak ditumbuhi bakteri tersebutlah yang menjadi MBC atau KBM.