BAB III. METODE PENELITIAN
G. Analisis Hasil
2. Linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode analisis untuk menunjukkan hasil uji yang secara langsung atau dengan persamaan matematis proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada rentang tertentu. Linearitas dapat ditentukan dengan pengukuran pada beberapa konsentrasi analit. Hasil slope (b), intersep (a) dan koefisien korelasi (r) menggambarkan informasi linearitas. Sebagai parameter adanya hubungan linear digunakan koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linear y = bx + a. Hubungan linear yang ideal dicapai apabila nilai a = 0 dan r = +1 atau –1 tergantung pada arah garis. Nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan (Harmita, 2004). Nilai koefisien korelasi 0,999 diterima untuk sebagian besar metode khususnya komponen dalam jumlah besar pada metode pengujian. Jika koefisien korelasi memiliki nilai kurang dari 0,999 maka perlu dilakukan perhitungan terhadap parameter lain yaitu Vxo ≤ 5 % (Yuwono dan Indrayanto, 2005).
Rentang adalah jarak antara kadar terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat diterapkan dengan ketepatan, ketelitian dan linearitas yang dapat diterima. Rentang dinyatakan dalam satuan yang sama dengan hasil yang diperoleh dengan metode analisis (Harmita, 2004).
3. Ketepatan (accuracy)
Ketepatan adalah ukuran kedekatan antara hasil analisis dan kadar analit yang sebenarnya. Ketepatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery). Ketepatan hasil analisis sangat tergantung pada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu, untuk mencapai ketepatan yang tinggi dapat dilakukan dengan mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang terkalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang dapat melarutkan senyawa dengan sempurna, pengontrolan suhu, pelaksanaan yang cermat dan taat asas serta sesuai prosedur (Harmita, 2004).
Kesulitan utama yang dihadapi pada evaluasi ketepatan suatu metode analisis adalah fakta bahwa nilai sebenarnya kadar analit biasanya tidak diketahui. Secara internasional, dikenal tiga macam cara yang umum digunakan untuk mengevaluasi ketepatan metode analisis kimia, yaitu dengan menggunakan bahan rujukan baku (Standard Reference Material / SRM), menggunakan baku sebagai pembanding (standard method), dan recovery dengan menempatkan analit plasebo (spiked placebo recovery) (Snyder dkk., 1997).
SRM digunakan untuk mengevaluasi ketepatan suatu metode dengan kesepakatan bahwa komposisi yang direkomendasikan oleh badan pembuat dianggap sebagai nilai sebenarnya. Dalam metode penggunaan baku sebagai pembanding, dilakukan pengujian secara paralel atas sampel menggunakan metode analisis yang sedang dievaluasi dan metode analisis lain yang telah diakui secara internasional sebagai metode baku. Jika dalam analisis tidak terdapat kesalahan sistematik maka pengujian menggunakan metode baku dianggap
memiliki ketepatan yang tinggi sehingga menghasilkan data yang dapat dianggap sebagai hasil yang sebenarnya. Metode spiked placebo recovery dilakukan dengan menganalisis sampel suatu obyek yang diperkaya dengan sejumlah analit baku yang telah ditetapkan. Berat total analit yang diperoleh dari analisis sampel yang diperkaya dikurangi dengan berat analit dalam sampel yang tidak diperkaya, dibandingkan terhadap jumlah analit baku yang ditambahkan (Snyder dkk., 1997).
Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Harmita, 2004). Persen perolehan kembali yang dapat diterima bergantung pada matriks analit, prosedur pengolahan analit dan konsentrasi analit (Anonim, 2004). Berikut ini adalah rentang recovery yang masih dapat diterima:
Tabel IV. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima (United States Pharmacopeial Convention, 2007)
Konsentrasi analit
(%) Unit (recoveryAkurasi , %)
100 100 % 98-102 ≥ 10 10 % 98-102 ≥ 1 1 % 97-103 ≥ 0,1 0,1 % 95-105 0,01 100 ppm 90-107 0,001 10 ppm 80-110 0,0001 1 ppm 80-110 0,00001 100 ppb 80-110 0,000001 10 ppb 60-115 0,0000001 1 ppb 40-120 4. Ketelitian (precision)
Ketelitian adalah ukuran yang menunjukkan kesesuaian antara hasil uji individual diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang
homogen (Snyder dkk., 1997). Ketelitian diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif/koefisien variasi (Harmita, 2004).
Pengertian presisi suatu metode dapat dikelompokkan menjadi tiga, yaitu keterulangan (repeatability), intermediet presisi, dan ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah ketelitian metode analisis dalam kondisi operasi yang sama pada laboratorium yang sama pada interval waktu yang singkat dengan analis dan peralatan yang berbeda. Keterulangan terbagi lagi dalam dua aspek yaitu presisi instrumental dan intra-assay precision. Keterulangan dinilai melalui penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik dari batch yang sama. Keterulangan memberikan ukuran ketelitian pada kondisi normal (Harmita, 2004). Intermediet presisi adalah keseuaian pengukuran ketika metode analisis yang sama diaplikasikan beberapa kali pada hari, instrumen atau analis yang berbeda pada laboratorium yang sama (Snyder dkk., 1997). Ketertiruan adalah ketelitian metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda (Harmita, 2004).
Suatu metode akan memenuhi persyaratan presisi apabila memberikan koefisien variasi (KV) < 2 %, namun persyaratan ini tergantung pada konsentrasi analit. KV meningkat dengan menurunnya konsentrasi analit. Karena presisi suatu metode merupakan fungsi penetapan konsentrasi pada rentang yang dapat diterima, maka pada analisis menggunakan KCKT digunakan ketentuan seperti pada tabel V.
Tabel V. Kriteria akurasi dan presisi yang masih dapat diterima (United States Pharmacopeial Convention, 2007) Konsentrasi analit (%) Unit (KV, %) Presisi 100 100 % 1,3 ≥ 10 10 % 2,7 ≥ 1 1 % 2,8 ≥ 0,1 0,1 % 3,7 0,01 100 ppm 5,3 0,001 10 ppm 7,3 0,0001 1 ppm 11 0,00001 100 ppb 15 0,000001 10 ppb 21 0,0000001 1 ppb 30 G. Landasan Teori
Kurkumin merupakan senyawa alam berwarna kuning atau kuning jingga yang banyak ditemukan dalam obat tradisional. Kurkumin terdiri atas dua molekul asam ferulat yang dihubungkan dengan jembatan metilen pada atom karbon dari gugus karboksilnya. Kurkumin stabil pada pH di bawah 6,5 dan akan terdegradasi pada pH di atas 6,5.
Kurkumin dapat dianalisis dengan menggunakan metode KCKT dengan tingkat selektivitas dan sensitivitas yang tinggi. Salah satu sistem KCKT yang dapat digunakan untuk menganalisis kurkumin adalah sistem KCKT fase terbalik menggunakan detektor visibel. Kurkumin memiliki gugus kromofor yang dapat menyerap gelombang elektromagnetik yang melaluinya sehingga dapat ditentukan kadarnya menggunakan detektor visibel. Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol dan asam asetat glasial 2 % karena kurkumin memiliki kelarutan yang baik di dalamnya.
Keberhasilan analisis menggunakan metode KCKT sangat tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang optimum. Kondisi optimum tersebut diperoleh dari hasil optimasi. Sistem KCKT yang telah dioptimasi selanjutnya divalidasi. Validasi dilakukan untuk meyakinkan bahwa metode yang digunakan telah memenuhi persyaratan aplikasi analisis. Validasi suatu metode analisis ditentukan oleh parameter validasi yang meliputi akurasi, presisi, linearitas, sensitivitas, dan selektivitas. Selektivitas ditentukan dari nilai resolusi, linearitas dinyatakan dengan nilai koefisien korelasi, akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali, dan presisi dinyatakan dengan koefisien variasi.
H. Hipotesis
Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk Kiranti® secara KCKT fase terbalik pada kondisi optimum hasil optimasi memenuhi parameter validitas yang baik, meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi.
31 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan mengikuti jenis penelitian non eksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif, sebab pada penelitian ini tidak dilakukan manipulasi pada subjek uji dan hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.
B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah sistem KCKT yang telah dioptimasi.
2. Variabel tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter-parameter validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi.
3. Variabel pengacau terkendali
a. Pelarut yang digunakan, berupa pelarut pro analysis yang memiliki tingkat kemurnian tinggi.
b. pH larutan dengan melakukan pengaturan pH terhadap larutan baku kurkumin, yaitu pada pH 4.
C. Definisi Operasional
1. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan terdiri atas fase diam berupa kolom oktadesilsilan (C18) serta fase gerak berupa campuran metanol p.a dan asam asetat glasial p.a 2 % (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. 2. Kadar kurkumin dinyatakan dalam satuan part per million (ppm).
3. Parameter validasi yang digunakan pada penelitian ini meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi.
D. Bahan-bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah baku kurkumin hasil sintesis Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. yang telah dikonfirmasi strukturnya dengan metode spektroskopi 1H-NMR dan Mass Spectra dengan titik lebur 181,2-182,4o-C, metanol p.a EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur (E. Merck), asam asetat glasial
p.a EMPARTA® ACS (E. Merck), aquabidestilata dan OHT merk Kiranti®.
E. Alat-alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah organic solvent membrane filter (Whatman) ukuran pori 0,45μm; diameter 47mm, indikator pH, penyaring Millipore,
mikropipet Socorex, neraca kasar, neraca analitik (Ohaus PAJ1003), ultrasonikator (Retsch tipe T460 no V935922013 Ey), vaccum (Gaast model DOA-P104-BN), magnetic stirrer, seperangkat alat spektrofotometri UV-VIS merk Milton Ray Spectronic 3000 Array yang dihubungkan dengan printer merk
228-46703-38, SERIAL No. C21254706757 LP, Shimadzu Corporaion), kolom oktadesilsilan (C18) berukuran 250 x 4,6 mm merk KNAUER No. 25EE181KSJ (B115Y620), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant System
RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730), dan alat-alat gelas yang umum digunakan dalam analisis (Pyrex).
F. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan fase gerak KCKT
Fase gerak yang digunakan terdiri dari asam asetat glasial p.a 2% dan metanol p.a Masing-masing komponen fase gerak disaring melalui organic solvent membrane filter (Whatman) berukuran pori 0,45 μm; diameter 47 mm dengan bantuan pompa vakum, selanjutnya diawaudarakan dengan ultrasonikator selama 15 menit. Pencampuran kedua komponen fase gerak dilakukan di dalam instrument KCKT dengan perbandingan metanol : asam asetat glasial 2% sebesar 90:10 v/v.
2. Pembuatan pelarut metanol pH 4
Pelarut yang digunakan berupa metanol yang diatur pada pH 4. Pengaturan pH dilakukan dengan menambahkan asam asetat glasial 2% sebanyak 1 bagian ke dalam 9 bagian metanol.
3. Pembuatan larutan baku kurkumin
a. Pembuatan larutan stok kurkumin. Ditimbang lebih kurang seksama 10,0 mg baku kurkumin dilarutkan dengan metanol pH 4 dalam labu takar 10,0 ml hingga tanda sehingga diperoleh konsentrasi 1000 ppm.
b. Pembuatan larutan intermediet kurkumin. Larutan stok kurkumin diambil sebanyak 1,0 ml dan diencerkan dengan metanol pH 4 dalam labu takar 10,0 ml hingga tanda sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 100 ppm.
c. Pembuatan seri larutan baku kurkumin. Dibuat seri larutan baku kurkumin dengan konsentrasi 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 dan 4,5 ppm dengan mengambil 150; 200; 250; 300; 350; 400 dan 450 µl larutan intermediet kurkumin, masukkan dalam labu takar 10,0 ml dan tambahkan metanol pH 4 hingga tanda. Larutan kemudian disaring dengan Millipore dan diawaudarakan dengan ultrasonikator selama 15 menit.
4. Penentuan panjang gelombang (λ) maksimum kurkumin
Sebanyak 40; 100 dan 160 µl larutan intermediet kurkumin diencerkan dengan metanol p.a pH 4 dalam labu takar 10,0 ml sampai tanda sehingga diperoleh konsentrasi 0,4; 1,0 dan 1,6 ppm. Dari kadar baku kurkumin tersebut dilakukan pengukuran absorbansi pada rentang panjang gelombang 300-500 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Kemudian dari spektrum yang dihasilkan tersebut ditentukan panjang gelombang maksimumnya. Nilai panjang gelombang maksimum yang diperoleh selanjutnya digunakan sebagai panjang gelombang deteksi pada sistem KCKT.
5. Preparasi sampel
Sebanyak 1,0 ml sampel sediaan cair OHT merk Kiranti® dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 ml dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga tanda. Kemudian diekstraksi menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. Ekstrak disaring dan filtrat diencerkan dengan metanol pH 4 sampai 10,0 ml.
6. Validasi metode analisis
a. Penentuan resolusi sampel. Sebanyak 20 µl larutan ekstrak sampel yang telah diawudarakan selama 15 menit diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Dilakukan repetisi sebanyak 5 kali. Resolusi dihitung dengan memasukkan selisih waktu retensi dan lebar peak
ke dalam rumus perhitungan resolusi.
b. Pembuatan kurva baku kurkumin. Sebanyak 20 µl larutan kurkumin dengan konsentrasi 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 dan 4,5 ppm yang telah disaring dengan Millipore dan diawaudarakan selama 15 menit diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Persamaan kurva baku tiap replikasi ditetapkan dari hasil analisis regresi linear antara konsentrasi tiap seri baku dengan AUC yang diperoleh. Kemudian dipilih persamaan kurva baku terbaik dengan nilai koefisien korelasi (r) lebih besar dari 0,999 yang selanjutnya digunakan untuk menghitung konsentrasi kurkumin.
c. Penentuan persen perolehan kembali dan koefisien variasi baku kurkumin. Sebanyak 20 µl larutan baku kurkumin 1,5; 3,0 dan 4,5 ppm yang telah disaring dengan Millipore dan diawaudarakan selama 15 menit diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Dilakukan replikasi sebanyak 5 kali. Konsentrasi baku kurkumin dihitung dengan memasukkan nilai AUC yang diperoleh ke dalam persamaan kurva baku.
d. Penentuan persen perolehan kembali dan koefisien variasi adisi baku kurkumin dalam sampel. Dibuat 2 macam larutan yaitu larutan sampel dan larutan sampel adisi. Larutan sampel dibuat dengan mengambil 1,0 ml ekstrak sampel ke dalam labu takar 10,0 ml dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga tanda. Larutan sampel adisi dibuat dengan mengambil 75 µl larutan stok kurkumin dan 1,0 ml ekstrak sampel dalam labu takar 10,0 ml dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga tanda. Keduanya disaring dengan Millipore dan diawaudarakan selama 15 menit. Kemudian sebanyak 20 µl dari tiap larutan diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Dilakukan repetisi sebanyak 5 kali. Konsentrasi baku kurkumin yang ditambahkan dalam sampel dihitung dengan memasukkan selisih nilai AUC sampel adisi dan AUC sampel ke dalam persamaan kurva baku.
G. Analisis Hasil
Kesahihan metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT secara KCKT fase terbalik dapat ditentukan berdasarkan parameter berikut:
1. Selektivitas
Menurut Harmita (2004), selektivitas ditentukan dengan parameter resolusi (Rs). Rumus perhitungan resolusi:
Resolusi (Rs) = 1(tR2− tR1)
2(W1+ W2) (6)
Keterangan: Rs = resolusi
tR1 = waktu retensi puncak analit pertama tR2 = waktu retensi puncak analit kedua W1 = lebar dasar puncak pertama W2 = lebar dasar puncak kedua
2. Linearitas
Linearitas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Konsentrasi larutan baku kurkumin yang diperoleh diplotkan terhadap luas area pada kromatogram sehingga diperoleh nilai koefisien korelasi (r) dari persamaan y = Bx + A.