BAB III METODE PENELITIAN
E. Tatacara Penelitian
3. Linearitas dan Rentang
Linearitas suatu prosedur analitik merupakan kemampuan suatu prosedur
analitik (dengan rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil yang secara langsung
proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit dalam sampel (Anonim, 2005a).
Linearitas dapat dinyatakan dengan koefisien korelasi (r) dimana untuk analisis komponen utama, nilai r harus > 0,999 (Snyderet al.,1997).
4. Rentang
Rentang suatu metode dapat didefinisikan sebagai konsentrasi terendah
linearitas yang baik (Snyder et al., 1997). Rentang untuk penetapan kadar obat biasanya berada pada kadar 80 sampai 120 % dari analit (Anonim, 2005a).
5. Spesifisitas
Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur analit
yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain
dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen
matriks (Gandjar dan Rohman, 2007). Spesifisitas merupakan kemampuan suatu
metode untuk mengukur secara akurat dan spesifik suatu analit dalam sampel. Jika
spesifisitas tidak diukur maka akurasi, presisi dan linearitas metode menjadi
diragukan (Snyderet al.,1997).
Penentuan spesifisitas metode dapat diperoleh dengan dua cara. Pertama
adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju
terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain (nilai resolusi senyawa yang
dituju 2). Cara kedua adalah dengan menggunakan detektor yang selektif,
terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi bersama-sama (Rohman, 2009).
F. Uji Kesesuaian Sistem
Sebelum dilakukan analisis sampel secara rutin, perlu adanya jaminan
bahwa sistem dan prosedur KCKT yang digunakan dapat memberikan data yang
kualitasnya baik. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji kesesuaian sistem untuk
memastikan bahwa hasil yang diberikan masih memiliki akurasi dan presisi yang
adalah plate number (N), tailing factor (Tf), resolusi (Rs) dan relative standard deviation (RSD) untuk peak height dan peak area pada beberapa kali penginjeksian (ripitasi) (Snyder et al., 1997). RSD yang diperbolehkan untuk 5 kali atau lebih ripitasi haruslah 2% (Anonim, 2005b). Parameter uji kesesuaian
sistem dapat dilihat pada tabel V berikut.
Tabel V. Parameter uji kesesuaian sistem (Snyderet al.,2010)
Parameter Rekomendasi FDA
Resolusi Rs2
Tailing factor TF< 2
Column plate number N2000 Keterulangan injeksi RSD2%, n5
G. Landasan Teori
Teobromin dan kafein merupakan senyawa alkaloid golongan ksantin
yang terkandung dalam cokelat. Berdasarkan strukturnya, kedua senyawa tersebut
memiliki kemiripan struktur sehingga perlu dilakukan pemisahan untuk
mempermudah analisis. Beberapa metode instrumental telah banyak digunakan
untuk penetapan kadar teobromin dan kafein, salah satunya adalah KCKT fase
terbalik. Baik teobromin maupun kafein memiliki bagian polar dan non polar
sehingga dapat dianalisis menggunakan KCKT berdasarkan perbedaan interaksi
antara kedua senyawa tersebut dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan.
Metode KCKT fase terbalik ini telah digunakan secara luas dimana
digunakan fase diam C18dengan fase gerak senyawa organik. Fase gerak dialirkan
dengan kecepatan tertentu dengan bantuan pompa bertekanan dan hasilnya
dideteksi menggunakan detektor. Pada analisis teobromin dan kafein ini akan
sehingga memungkinkan untuk dideteksi secara UV. Selain itu, teobromin
memiliki nilai = 10.144,14 M-1cm-1 dan kafein memiliki = 9.786,41 M-1cm-1
sehingga memungkinkan untuk dideteksi secara UV.
Metode KCKT yang akan digunakan pada penetapan kadar teobromin
dan kafein merupakan metode KCKT fase terbalik dengan fase diam kolom C18
merek KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak campuran metanol :
akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Metode
tersebut telah dioptimasi oleh Wati (2012) dan memberikan hasil yang baik dilihat
dari bentukpeak,resolusi, nilai HETP dan nilaitailing factor(Tf).
Baik teobromin maupun kafein terdapat dalam jumlah yang cukup besar
dalam cokelat bubuk sehingga penelitian ini termasuk kategori 1 yaitu analisis
suatu senyawa dengan kadar yang besar. Pada kategori ini, parameter validasi
yang harus dipenuhi adalah akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas.
Oleh karena itu, sebelum dilakukan penetapan kadar teobromin dan kafein dalam
cokelat bubuk, metode KCKT yang telah dioptimasi perlu divalidasi terlebih
dahulu untuk membuktikan bahwa metode yang digunakan memberikan hasil
yang valid berdasarkan pada paramater – parameter validasi tersebut.
H. Hipotesis
Metode KCKT fase terbalik yang digunakan dalam penetapan kadar
teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk memiliki validitas yang baik
didasarkan pada parameter validasi yaitu akurasi, presisi, linearitas, rentang dan
33
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan rancangan deskriptif karena tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek uji.
B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Klasifikasi Variabel
a. Variabel Bebas
Konsentrasi larutan baku teobromin dan kafein yang digunakan. b. Variabel Tergantung
Parameter validasi yaitu akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas.
c. Variabel Pengacau Terkendali
Kualitas bahan baku, pelarut dan sampel cokelat bubuk yang digunakan.
2. Definisi Operasional
a. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan dalam penelitian adalah fase gerak berupa campuran metanol dan akuabides/TEA 3% (40 : 60) dan fase diam berupa kolom oktadesilsilan (C18).
b. Kadar teobromin dan kafein dinyatakan dengan satuan part per million
c. Parameter validasi metode yang digunakan adalah akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas.
C. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi baku teobromin denganCertificate of Analysis dari Sigma Aldrich, baku kafein dengan
Certificate of Analysis dari Brataco, Metanol (p.a., E. Merck), Petroleum eter (titik didih 40-60oC) (p.a., E. Merck), Trietilamin (p.a., E. Merck), Kloroform teknis, Natrium hidroksida 0,1 M, Akuabides (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma) dan sampel cokelat bubuk merk “x”.
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi: Spektrofotometer UV/Vis SP-3000plus merk OPTIMA, kuvet, seperangkat alat KCKT dengan detektor UV, Shimadzu LC-2010C, kolom C18 merek KNAUER C18 (No. 25EE181KSJ (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm, 5m), seperangkat komputer (merek Dell B6RDZ1S Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printerHP DeskjetD2566 HP-024-000 625 730), degassingultrasonikator (Retsch tipe T460 no V935922013 EY), organic solvent membrane filter Whatman (0,45m), neraca analitik dengan kepekaan 0,001 (Ohaus Carat Series PAJ 1003) dan seperangkat alat gelas (Pyrex).
E. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan Larutan Stok Teobromin dan Kafein
a. Larutan stok teobromin. Ditimbang seksama kurang lebih 25 mg baku teobromin dan dilarutkan dalam akuabides panas hingga larut. Kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL dan ditambahkan akuabides hingga tanda.
b. Larutan stok kafein. Ditimbang seksama kurang lebih 25 mg baku kafein dan dilarutkan dalam akuabides panas hingga larut. Kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL dan ditambahkan akuabides hingga tanda.
2. Pembuatan Larutan Intermediet Teobromin dan Kafein
a. Larutan intermediet teobromin. Dipipet 12,5 mL larutan stok teobromin (dengan pipet ukur) dan diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 25 mL hingga tanda.
b. Larutan intermediet kafein. Dipipet 12,5 mL larutan stok kafein (dengan pipet ukur) dan diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 25 mL hingga tanda.
3. Pembuatan Seri Larutan Baku Campuran dan Penetapan Kurva Baku
Dipipet sejumlah 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0; dan 2,4 mL larutan intermediet teobromin kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Dipipet sejumlah 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; dan 1,2 mL larutan
intermediet kafein kemudian ditambahkan ke dalam labu takar yang telah berisi larutan baku antara teobromin (yang telah diambil sebelumnya). Masing-masing labu takar diencerkan dengan akuabides sampai tanda batas.
Masing-masing larutan seri baku campuran teobromin dan kafein disaring menggunakan millipore kemudian didegassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. Sejumlah 10 L masing-masing seri larutan baku tersebut disuntikkan ke sistem KCKT dengan kolom C18(Dimensi 250 x 4,6 mm, 5 m) menggunakan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/menit. Replikasi dilakukan 3 kali dan dipilih persamaan kurva baku teobromin dan kafein yang paling baik dilihat dari nilai koefisien korelasinya (r0,999) dan nilai intersepnya paling kecil.
4. Penetapan Panjang Gelombang Pengukuran
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan cara merekam spektra larutan baku teobromin dan kafein, masing-masing digunakan konsentrasi 5, 10 dan 15 ppm. Pengukuran dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-300 nm terhadap blanko akuabides. Berdasarkan spektra yang diperoleh kemudian ditentukan panjang gelombang maksimum tiap senyawa dan juga dicari panjang gelombang tumpang tindih. Panjang gelombang ini kemudian akan digunakan pada deteksi secara KCKT.
5. Preparasi Sampel
Sejumlah 30 g sampel cokelat bubuk dimasukkan ke dalam kantong sokhlet. Sokhletasi pertama dilakukan menggunakan pelarut petroleum eter sebanyak 100 mL dan dilakukan selama 4 jam pada suhu antara 40-60oC. Kemudian kantong sokhlet direndam dalam NaOH 0,1 M pH 13 selama 15 menit. Sokhletasi dilanjutkan menggunakan pelarut kloroform sebanyak 100 mL selama 4 jam pada suhu 60-70oC. Hasil ekstraksi dengan sokhlet tersebut kemudian diuapkan sampai diperoleh ekstrak kental dengan bobot yang tetap.
6. Validasi Metode Analisis
a. Pembuatan campuran teobromin dan kafein. Larutan campuran teobromin dan kafein dibuat pada 3 konsentrasi berbeda dan masing-masing direplikasi 3 kali.
Tabel VI. Pembuatan larutan campuran teobromin dan kafein
Konsentrasi (ppm) Ambil dari larutan intermediet (mL) Tambahkan akuabides hingga tanda dalam labu takar 10 mL Rendah Teobromin 20 0,4 Kafein 10 0,2 Tengah Teobromin 60 1,2 Kafein 30 0,6 Tinggi Teobromin 120 2,4 Kafein 60 1,2
Masing-masing campuran tersebut disaring dengan millipore dan didegassingselama 15 menit.
b. Penetapan %recovery dan % CV. Masing-masing seri larutan campuran teobromin dan kafein sejumlah 10 L disuntikkan ke sistem KCKT
dengan kolom C18 (Dimensi 250 x 4,6 mm, 5 m) menggunakan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Kadar terukur baku teobromin dan kafein yang ada dalam campuran dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah diperoleh. Kemudian dihitung nilai % recovery dari kadar terukur tersebut menggunakan rumus sebagai berikut:
% = kadar terukur
kadar sebenarnya 100%
c. Penetapan %recoverydan % CV sampel. Sejumlah 10 mg ekstrak kental yang telah diperoleh kemudian dispike dengan seri larutan baku campuran teobromin dan kafein pada 3 level konsentrasi (lihat tabel IV). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-masing level konsentrasi. Blanko yang digunakan adalah larutan sampel yang tidak
dispike dengan baku. Masing-masing larutan sampel yang telah dispike
dan juga blanko kemudian di saring dengan millipore dan didegassing
selama 15 menit. Sejumlah 10 L disuntikkan ke sistem KCKT dengan kolom C18 (Dimensi 250 x 4,6 mm, 5 m) menggunakan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Kadar terukur baku teobromin dan kafein yang ada dalam campuran dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah diperoleh. Kemudian dihitung nilai % recovery dari kadar terukur tersebut menggunakan rumus sebagai berikut:
% = kadar terukur
kadar sebenarnya 100%
5. Uji Kesesuaian Sistem
Pada penetapan uji kesesuaian sistem, digunakan seri larutan baku campuran pada level konsentrasi sedang (teobromin = 60 ppm dam kafein = 30 ppm). Sejumlah 10 L larutan seri tersebut disuntikkan ke sistem KCKT dengan kolom C18menggunakan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dan kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/menit secara berulang sebanyak 5 kali penyuntikan. Parameter yang diukur adalah resolusi, tailing factor dan
column plate number.Selain parameter di atas, dihitung pula nilai RSD untuk
peak areadan peak height untuk repetisi penyuntikan sebanyak 5 kali. Nilai RSD yang diperbolehkan adalah2 % (Anonim, 2005b).
F. Analisis Hasil
Kesahihan metode yang digunakan dalam penetapan kadar kafein dan teobromin dalam bubuk cokelat dapat ditentukan berdasarkan parameter berikut:
1. Akurasi
Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery).
% = kadar terukur
Metode ini dikatakan memiliki akurasi yang baik jika nilai % recoveryberada pada rentang 95-105% untuk analit pada matriks sampel 0,1% (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007).
2. Presisi
Presisi biasanya dinyatakan dengancoefficient of variation(CV). CV = SD
x 100%
Menurut aturan AOAC, suatu metode dapat dinyatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki CV < 3,7% untuk konsentrasi analit 0,1% (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007).
3. Linearitas dan Rentang
Linearitas dinyatakan dalam koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linear. Linearitas yang baik apabila nilai r 0,999 untuk minimal 6 seri konsentrasi (Anonim, 1995). Rentang ditentukan dari kadar kafein dan teobromin yang digunakan dalam analisis, mulai dari kadar terendah hingga tertinggi yang dapat diukur secara kuantitatif dan menghasilkan akurasi, presisi, dan linearitas yang baik.
Parameter rentang ditetapkan dengan mencari konsentrasi terendah dan teratas yang masih memberikan linearitas yang memenuhi syarat yaitu r 0,999 (Snyderet al.,1997).
4. Spesifisitas
Spesifisitas metode ditentukan dengan melihat resolusi (daya pisah) antarapeakkafein dan teobromin. Resolusi yang baik apabila Rs2 (Snyderet al.,2010).
41
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN