Ada beberapa macam mutagen yang tersedia bagi para pemulia tanaman. Di antaranya adalah mutagen fisik dan mutagen kimiawi serta mutagen sisipan (termasuk transposon dan T(transfer)-DNA dari Agrobacterium sp.).
Mutagen Fisik
Mutagen fisik termasuk radiasi ion seperti sinar X, sinar gamma, netron, dan radiasi UV.
Sinar X adalah radiasi elektromagnetik yang dihasilkan oleh akselerasi elektron secara elektrik di dalam ruang vakum. Panjang gelombang sinar X berkisar antara 0,001 hingga 10
nm, dan sebagai akibatnya, penetrasi radiasi seperti itu ke dalam jaringan akan bervariasi – dari hanya beberapa milimeter pada gelombang yang panjang, hingga beberapa sentimeter pada gelombang yang pendek.
Sinar gamma diemisikan dari radioisotop selama pelapukan isotop alamiah seperti cobalt-60 dan caesium-137 (dengan waktu paruh berturut-turut adalah 5,3 dan 30 tahun). Isotop ini memiliki gelombang lebih pendek dari pada sinar X, dan memiliki kemampuan penetrasi yang lebih dalam (dapat masuk ke dalam jaringan hingga beberapa sentimeter). Dosis pemberiannya perlu ditentukan melalui eksperimen.
Netron diproduksi di dalam reaktor nuklir atau akselerator. Emisi netron menyebabkan lepasnya energi dalam jumlah besar yang dapat menyebabkan mutasi. Akan tetapi akses kepada sumber netron merupakan faktor pembatas utama bagi aplikasinya pada mutagenesis
in vitro.
Radiasi UV diketahui menginduksi mutasi (pengurangan atau penambahan basa tidak dalam kelipatan tiga) dan substitusi pasangan basa. Pembentukan dimer pyrimidine sebagai akibat respon terhadap iradiasi UV, diikuti oleh mekanisme pemulihan, mengakibatkan timbulnya jarak untaian tunggal (singe-strand gap) di dalam DNA. Ini merupakan modus utama untuk induksi mutasi menggunakan radiasi UV.
Lampu merkuri yang mengeluarkan emisi pada kisaran panjang gelombang 250 hingga 290 nm adalah sumber cahaya UV di dalam laboratorium. Di antara radiasi ion yang ada, cahaya UV barangkali adalah sumber radiasi yang paling murah dan paling mudah didapatkan. Akan tetapi, dikarenakan panjang gelombang cahaya UV yang relatif panjang, penetrasinya ke dalam jaringan sangat terbatas. Oleh karenanya, cahaya UV cocok untuk menginduksi mutasi di dalam kultur sel atau kultur protoplas. Biasanya protoplas diletakkan beberapa sentimeter di bawah lampu UV di dalam cawan Petri (tanpa tutup) selama durasi yang mengakibatkan berkurangnya pembentukan koloni 10 hingga 50 persen dibandingkan protoplas yang tidak mengalami mutagenesis pada pengkulturan berikutnya.
Mutagen Kimiawi
Ada sejumlah bahan kimia yang berlaku sebagai mutagen (Gambar 8.1). Salah satu ciri umum senyawa ini adalah sangat beracun (dapat menyebabkan mutasi pada sel-sel tubuh manusia yang dapat berakibat kanker) dan harus diperlakukan dengan sangat hati-hati. Senyawa-senyawa ini meliputi analog basa, agen alkylating, dan senyawa kimia beracun lainnya seperti sodium azide.
GAMBAR 8.1. Struktur 5-bromouracil dan maleic hydrazide, yang digunakan sebagai mutagen, dibandingkan dengan uracil. Dikarenakan kemiripan di antara senyawa tersebut, ketiganya dianggap sebagai analog struktur.
Analog basa secara struktural mirip dengan basa DNA, jadi, senyawa ini mudah digabungkan dengan molekul DNA selama replikasinya pada awal pembelahan sel. Masuknya analog basa promutagenik ke dalam DNA menyebabkan pembentukan ikatan hidrogen aberasi (Negrutiu, 1990). Ionisasi basa selanjutnya menyebabkan perubahan basa di dalam DNA, yang merupakan dasar bagi induksi mutasi oleh analog basa. Penggunaan senyawa seperti ini menimbulkan frekuensi mutasi yang rendah pada tanaman, sehingga pemanfaatannya di lapangan agak terbatas.
Beberapa di antara senyawa yang masuk ke dalam kategori ini adalah: 5-bromouracil, 5- bromo (atau fluoro)-deoxyuridine – keduanya adalah analog thymine (T). Kedua senyawa ini tanpa sengaja dapat bergabung ke dalam DNA pada posisi T. Selain itu, 5-bromouracil dapat pula tanpa sengaja berpasangan dengan guanine (G), bukannya dengan adenine, dan hal ini dapat menyebabkan terjadinya substitusi guanine pada posisi adenine (A). Produk akhir dari pasangan yang tanpa sengaja ini adalah introduksi pasangan G-C pada posisi pasangan A-T, mengakibatkan terjadinya mutasi. Juga, termasuk ke dalam kategori ini adalah maleic hydrazide (suatu herbisida selektif yang tersedia secara komersial yang dapat mengatasi pertumbuhan rimbun pada sejumlah tanaman), yang merupakan isomer struktur dari uracil dan dapat menimbulkan pertukaran kromatida anak, memungkinkan terjadinya mutasi.
Agen alkylating adalah senyawa yang sangat reaktif yang dapat mengalkylasi senyawa fosfat serta basa purine dan pyrimidine pada DNA. Basa yang teralkylasi akan mengalami pemulihan atau substitusi yang dalam prosesnya dapat terjadi kesalahan sehingga menimbulkan mutasi. Ada dua kategori senyawa dari subkelas mutagen ini:
1. Sulfat alkyl dan sulfonate: contoh senyawa kelompok ini adalah methyl-, ethyl- atau propyl-methane sulfonate. Di antara senyawa ini, ethyl methane sulfonate (EMS) adalah yang sering digunakan untuk menginduksi mutasi pada tanaman. EMS adalah cairan yang mudah menguap dan sangat beracun yang harus dipipet ke dalam media kultur sel dengan konsentrasi akhir 0,1 hingga 3 persen v/v.
2. Senyawa-senyawa nitroso termasuk dialkyl nitrosamines, alkyl nitrosoureas, mustard belerang atau mustard nitrogen (misalnya gas mustard), dan epoxides. Di antara senyawa- senyawa ini, N-methyl-N-nitrosourea (NMU) dan N-ethyl-N-nitrosourea (NEU) adalah mutagen yang banyak digunakan pada kultur sel tanaman (dengan konsentrasi akhir berkisar antara 0,1 hingga 10 mM).
Kehati-hatian dalam Penggunaan Mutagen Kimiawi
Sebagaimana disebutkan sebelumnya, senyawa-senyawa ini sangat beracun dan bersifat karsinogenik. Senyawa ini harus ditangani dengan ekstra hati-hati. Para pekerja harus mengenakan masker wajah yang sesuai dan pakaian pelindung, dan jika terjadi kontak dengan kulit, bagian yang terkena harus segera dicuci bersih secara menyeluruh.
Nitrosourea tidak stabil di dalam larutan alkaline, oleh karenanya larutan perlakuan harus merupakan medium kultur dengan pH 5,6 (pH yang umum untuk media kultur sel tanaman). Selain itu, sebaiknya dibuat siapan segar sebelum digunakan.
Juga penting untuk diperhatikan adalah cara pembuangan sisa-sisa bahan kimia ini secara baik dan benar. Larutan yang terkontaminasi oleh nitrosourea harus secara perlahan- lahan ditambahkan ke dalam 5 persen NaOH, dibiarkan di dalam kotak gas (fumehood)
sebelum dibuang ke dalam saluran pembuangan dan disiram dengan air dalam jumlah besar. Peralatan pecah belah dan peralatan lainnya yang terkontaminasi dapat direndam selama semalam di dalam larutan NaOH 5 persen, dan cuci lagi dengan NaOH 5 persen sebelum dibilas (Dix, 1999). Larutan EMS dapat ditambahkan ke dalam KOH 3 M di dalam etanol 95 persen, dipanaskan di bawah reflux, dan diaduk berulang-ulang selama dua jam sebelum dibuang.