Tanaman Kimera
PROTOKOL KREOPRESERVASI UNTUK SPESIES TAHAN SUHU RENDAH DAN SPESIES TIDAK TAHAN SUHU RENDAH
Ada perbedaan yang nyata dalam prosedur kreopreservasi yang dilakukan terhadap spesies tahan suhu rendah dan spesies yang tidak tahan suhu rendah. Perbedaan ini terutama sekali disebabkan oleh berbedaan pada suhu rendah alami antar spesies. Prosedur yang diterapkan untuk kreopreservasi tanaman yang tahan suhu rendah, kebanyakan tanaman daerah beriklim sedang yang toleran terhadap suhu –25oC, memanfaatkan kemampuan alami tanaman ini untuk toleran terhadap stres pembekuan. Peningkatan yang nyata pada toleransi terhadap pembekuan dan juga peningkatan pada viabilitas jaringan pada tanaman tahan terhadap suhu rendah yang disimpan dengan metoda kreopreservasi dapat diperoleh dengan mendinginkan tanaman tersebut secara perlahan-lahan dengan laju 2oC per jam hingga suhu antara –30oC dan –50oC sebelum di simpan di dalam nitrogen cair.
Praktisnya, semua tanaman yang tidak tahan suhu rendah membutuhkan perlakuan kreoprotektif agar dapat bertahan pada suhu ultra rendah. Sebagaimana halnya dengan spesies tahan suhu rendah, pendinginan secara perlahan-lahan dan pembekuan cepat menggunakan nitrogen cair dapat pula diterapkan pada tanaman yang tidak tahan suhu rendah.
Isolasi Pucuk dan Tunas Aksilar
Pucuk dan tunas aksilar, berukuran panjang 0,3 hingga 1 mm yang diisolasi dari tanaman yang ditanam di lapangan atau dari kultur in vitro dapat digunakan untuk kreopreservasi. Biasanya jaringan ini direndam di dalam dimethyl sulphoxide (DMSO) konsentrasi 0,5 hingga 5 persen untuk meningkatkan laju kehidupannya. Pada kebanyakan tanaman, pucuk terminal dan tunas aksilar yang berasal dari posisi atas pucuk menunjukkan laju kehidupan yang lebih tinggi daripada yang berasal dari bagian bawah sistem pucuk. Akan tetapi, pengaruh posisi seperti itu tidak terlihat pada laju kehidupan meristem pada beberapa tanaman dari famili Solanaceae (misalnya kentang).
Perlakuan Kreoprotektif Pra-pembekuan
Perlakuan Tanaman Stok
Sedikit sekali informasi mengenai perlakuan terhadap tanaman stok yang meningkatkan viabilitas jaringan yang disimpan melalui kreopreservasi. Pada umumnya, kehidupan jaringan yang disimpan secara kreopreservasi ditentukan, dalam batasan tertentu, oleh ketahanannya terhadap suhu rendah. Juga, beberapa bukti menunjukkan bahwa aklimatisasi pada kondisi
suhu rendah alami sebelum pembekuan dapat mengurangi perlukaan pada jaringan yang disimpan pada kreopreservasi.
Kreopreservasi Pucuk secara Kimiawi
Pengkulturan pucuk dan meristem dari tanaman tahan dan tidak tahan terhadap suhu rendah dengan penambahan kreoprotektan sebelum pembekuan dapat meningkatkan viabilitasnya. Ada dua kreoprotektan yang sering digunakan terhadap bahan tanaman. Kreoprotektan yang cepat meresap (permeating) seperi DMSO, ethylene glycol, dan propylene glycol adalah yang paling efektif. Kreoprotektan lain yang tidak bersifat meresap
(nonpermeating) atau meresap secara perlahan-lahan seperti mannitol, glyserol, polyethylene glycol, sukrosa, dan proline memberikan proteksi terutma sekali terhadap dehidrasi osmotik. Kroprotektan yang tidak meresap terbukti lebih efektif jika dikombinasikan dengan kreoprotektan yang meresap.
Macam kreoprotektan yang cocok dan konsentrasi yang dibutuhkan serta lama perlakuan yang diberikan berbeda tergantung pada spesies dan harus ditentukan melalui pengujian empiris. Dalam banyak hal, kreoprotektan yang tidak meresap atau yang meresap perlahan-lahan digunakan pada konsentrasi 1 – 2 M, dan dimasukkan ke dalam medium secara bertahap atau dengan sekali pemberian saja. Pada umumnya, jaringan akan diinkubasikan selama satu hingga tiga jam di dalam kreoprotektan, seringkali pada suhu rendah untuk meminimalkan keracunan, sebelum pembekuan.
Vitrifikasi
Laju kehidupan dari jaringan yang disimpan melalui kreopreservasi dapat ditingkatkan dengan menghindarkan terjadinya pembentukan es di dalam jaringan selama pembekuan. Hal ini dapat diperoleh melalui vitrifikasi, yaitu suatu keadaan di mana air memadat menjadi amorfos menyerupai kaca, bukannya membentuk es. Di dalam kreopreservasi, jaringan divitrifikasikan dengan menghadapkannya pada kreoprotektan aktif yang pekat dan pendinginan yang sesuai. Meskipun ada manfaat yang jelas dari vitrifikasi untuk meningkatkan viabilitas jaringan, proses ini seringkali menimbulkan pengaruh osmotik yang merusak selama tahap pemulihan jaringan.
Enkapsulasi dan Pengeringan Jaringan
Selama enkapsulasi dan pengeringan, jaringan disisipkan pada blok (bead) kalsium alginat yang mengandung sukrosa. Blok yang disisipi jaringan ini dikeringkan di bawah
kondisi steril, yang memungkinkan jaringan tersebut untuk bertahan terhadap kondisi beku tanpa memerlukan kreoprotektan.
Pembekuan
Metoda bagaimana jaringan dihadapkan pada suhu ultra rendah dapat menjadi faktor penting dalam menentukan kehidupan jaringan yang disimpan dalam kreopreservasi. Sampel dapat dibekukan dengan cepat dengan merendamnya secara langsung di dalam nitrogen cair atau didinginkan secara bertahap dengan laju yang terkendali hingga kira-kira –35 sampai – 40oC dan berada pada suhu tersebut selama beberapa waktu sebelum dipindahkan ke nitrogen cair. Laju pendinginan kira-kira 0,25 hingga 1oC per menit menghasilkan kehidupan yang optimal bagi jaringan tanaman. Laju kecepatan pembekuan ini tetap mempertahankan keseimbangan potensi air sel sehingga mengurangi perlukaan sel. Pendinginan yang terlalu lambat akan sangat mempengaruhi viabilitas sel dikarenakan terlalu banyaknya interaksi makromolekuler dan perubahan-perubahan konsentrasi elektrolit.
Pada jaringan yang didinginkan dengan cepat, pembentukan sel intraseluler, yang acapkali letal, tidak dapat dihindari. Oleh karenanya pembentukan es intraseluler harus diminimalkan sekecil mungkin sampai pada tingkat yang tidak menyebabkan kerusakan untuk mempertahankan viabilitas jaringan yang disimpan dengan kreopreservasi. Suatu prosedur kreopreservasi yang berhasil, apakah melibatkan pembekuan cepat atau pendinginan bertahap diikuti oleh pembekuan, tergantung pada persiapan pra-pembekuan yang sesuai, seperti vitrifikasi atau perlakuan kreoprotektan yang cocok untuk menjaga viabilitas sel setelah pembekuan. Misalnya, dengan prosedur yang distandarisasi dengan baik yang melibatkan pembekuan cepat secara langsung, Kumu, Harada dan Yakuwa (1983) melaporkan laju kehidupan sebesar 100 persen pada pucuk Asparagus officinalis. Pada Tabel 10.1 disajikan contoh-contoh keberhasilan kreopreservasi jaringan meristem beberapa tanaman yang memiliki nilai ekonomi penting.