Manggis dan kerabat dekatnya memiliki mekanisme reproduksi apomiksis. Apomiksis merupakan sistem reproduksi yang terjadi secara alami, dimana embrio yang dihasilkan tidak melalui pembelahan miosis ataupun pembuahan ovum. Keturunan dari tanaman apomiksis memiliki konstitusi genetik yang sama dengan induk betinanya. Betuk apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya merupakan apomiksis embrio adventif. Sifat apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya, terdiri atas dua tipe, yaitu apomiksis obligat dan apomiksis fakultatif. Identifikasi dan karakterisasi plasma nutfah manggis dan kerabat dekatnya sangat diperlukan dalam proses konservasi dan peningkatan sumber genetiknya. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangan marka molekuler spesifik terpaut karakter apomiksis yang dapat digunakan untuk mempelajari dan memahami mekanisme apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya. Pengembangan marka molekuler dilakukan berdasarkan sekuen DNA 3 spesies Garcinia (Garcinia mangostana L., Garcinia celebica L. dan Garcinia malacensis Hk. F
) yang diperoleh dari hasil amplifikasi menggunakan primer Ozias akins berdasarkan sekuen DNA Pennisetum. Berdasarkan sekuen tersebut dilakukan pengembangan tiga set primer, yaitu Apo_Fak1, Apo_Fak2 dan Apo_Obli.Hasil penelitian menunjukkan bahwa primer yang telah dikembangkan berhasil menghasilkan pita spesifik dengan ukuran ± 300 pb dan ± 317 pb pada masing-masing spesies terpaut karakter apomiksis dan mengelompokkan 41 spesies
Garcinia kedalam 3 kelompok, yaitu 14 spesies apomiksis obligat, 14 spesies apomiksis fakultatif dengan bunga dioecius dan 13 spesies apomiksis fakultatif dengan bunga hermaprodit. Informasi ini dapat digunakan sebagai informasi dasar dalam program pemuliana Garcinia.
9 Pendahuluan
Manggis (Garcinia mangostana L.) dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.) merupakan anggota famili Gutiferae atau Cluciaseae. Mekanisme reproduksi pada manggis dan kerabat dekatnya bersifat apomiksis. Peristiwa apomiksis merupakan pola unik dari pembentukan tanaman, dimana biji yang dihasilkan bersifat fertil dan memiliki konstitusi genetik yang sama dengan induk betinanya (Sinaga 2008). Apomiksis pada tanaman Garcinia terbagi menjadi dua, yaitu apomiksis obligat dan apomiksis fakultatif (Sprecher 1919). Manggis bersifat apomiksis obligat (biji berkembang tanpa terjadi fertilisasi) dan berasal dari embrio adventif (Sprecher 1919). Menurut Den Nijs dan Van Dijk (1993) pada reproduksi apomiksis obligat, biji terbentuk tanpa terjadi reduksi jumlah kromosom dan terjadi reproduksi aseksual. Hal ini didukung Mansyah (2002), yang menyatakan bahwa pada berbagai tingkat perkembangan bunga secara visual dengan menggunakan lup pada bunga manggis menunjukkan tidak terlihat adanya serbuk sari. Sedangkan pada apomiksis fakultatif sel nuselar tertentu mangalami reproduksi seksual dan sel nuselar lainnya mengalami reproduksi aseksual (Koltunow 1993). Menurut Nogler (1984) ditemukannya variasi genetik pada tanaman apomiksis fakultatif, disebabkan karena terjadinya reproduksi seksual, sehingga menghasilkan individu yang bervariasi secara genetik dengan jumlah kromosom yang tetap.
Perbedaan dan pengetahuan dasar genetik mengenai sifat apomiksis obligat dan fakultatif pada manggis dan kerabat dekatnya diperlukan dalam analisis kekerabatan serta pengembangan tanaman Garcinia, akan tetapi informasi ini belum banyak dipelajari. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian mengenai dasar genetik sifat apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya, untuk mendukung program pemuliaan (PKBT 2010) dan menambah pemahaman akan hubungan kekerabatan antar aksesi manggis dan kerabat dekatnya yang sangat berpengaruh terhadap peningkatan mutu serta memudahkan menejemen konservasinya (Roldan et al. 2001). Berdasarkan informasi tersebut, penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan marka molekuler spesifik terpaut karakter apomiksis yang dapat digunakan dalam analisis kekerabatan manggis dan kerabat dekatnya. Marka molekuler tersebut dikembangkan berdasarkan sekuen DNA dari tanaman manggis dan kerabat dekatnya.
Bahan dan Metode Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Kajian Hortikultura Tropik (PKHT) Institut Pertanian Bogor Jawa Barat, pada bulan Mei 2012 sampai dengan April 2013.
Bahan Tanaman
Sebanyak 41 spesies manggis (Garcinia mangostana L.) dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.), koleksi Kebun Raya Bogor dan Taman Buah Mekar Sari di koleksi untuk dilakukan analisis DNA (Tabel 1).
10
Tabel 1 Sampel 41 spesies manggis dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.)
No Spesies Nomor aksesia Lokasi Pengambilan
1 Garcinia dulcis Kurz VI.C/378 Kebun Raya Bogor
2 Garcinia sp. VI.C/377 Kebun Raya Bogor
3 Garcinia forbesii King VI.C/381 Kebun Raya Bogor
4 Garcinia sp. VI.C/379 Kebun Raya Bogor
5 Garcinia sizygiifolia Pierre VI.C/325 Kebun Raya Bogor
6 Garcinia lateriflora Blume var.
javanica Boerl. VI.C/150 Kebun Raya Bogor
7 Garcinia sp. VI.C/385 Kebun Raya Bogor
8 Garcinia parvifolia Miq. VI.C/382 Kebun Raya Bogor
9 Garcinia sp. VI.C/383 Kebun Raya Bogor
10 Garcinia benthami Pierre VI.C/106 Kebun Raya Bogor
11 Garcinia tetrandra Pierre VI.C/108 Kebun Raya Bogor
12 Garcinia tetrandra Pierre VI.C/386 Kebun Raya Bogor
13 Garcinia porrecta Wall. var.
schizogyna Boerl. VI.C/145 Kebun Raya Bogor
14 Garcinia spicata Hook.f. VI.C/111 Kebun Raya Bogor
15 Garcinia picrorhiza Miq. VI.C/141 Kebun Raya Bogor
16 Garcinia balica Miq. VI.C/365 Kebun Raya Bogor
17 Garcinia sp. VI.C/472 Kebun Raya Bogor
18 Garcinia latissima Miq. VI.C/366a Kebun Raya Bogor
19 Garcinia binucaa (Blanco) Choisy VI.C/161 Kebun Raya Bogor
20 Garcinia kydia Roxb. VII.D/84 Kebun Raya Bogor
21 Garcinia xanthochymus Hook. VI.A/52 Kebun Raya Bogor
22 Garcinia echinocarpa Thwaites VI.A/36 Kebun Raya Bogor
23 Garcinia nigrolineata Planch VI.A/28 Kebun Raya Bogor
24 Garcinia livingstonei Anderson VI.A/30 Kebun Raya Bogor
25 Garcinia picrorhiza Miq. Var.
limonorhiza Boerl. VI.A/27 Kebun Raya Bogor
26 Garcinia celebica L. (1) VI.A/16a Kebun Raya Bogor
27 Garcinia sp. VI.A/77 Kebun Raya Bogor
28 Garcinia megaphylla Verdc. VI.A/45 Kebun Raya Bogor
29 Garcinia hambroniana Pierre IX.D/286b Kebun Raya Bogor
30 Garcinia palawensis Elmer (cf.) VI.A/63 Kebun Raya Bogor
31 Garcinia loureiri Pierre VI.C/60 Kebun Raya Bogor
32 Garcinia sp. VI.C/412 Kebun Raya Bogor
33 Garcinia porrecta Wall. VI.A/79 Kebun Raya Bogor
34 Garcinia tetrandra Pierre IX.D/280b Kebun Raya Bogor
35 Garcinia forbesii king VI.C/474 Kebun Raya Bogor
36 Garcinia nigrolineata Planch VI.A/34 Kebun Raya Bogor
37 Garcinia latisima Miq. VI.A/54 Kebun Raya Bogor
38 Garcinia hambroniana Pierre * Taman Buah Mekar Sari
39 Garcinia malaccensis T. Anderson * Taman Buah Mekar Sari
40 Garcinia celebica L. (2) * Taman Buah Mekar Sari
41 Garcinia mangostana L. * Taman Buah Mekar Sari
a
Tidak memiliki nomor aksesi. Metode
Primer untuk Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis. Primer terpaut karakter apomiksis pada penelitian ini menggunakan primer yang telah dikembangkan pada penelitian sebelumnya (PKBT 2010), berdasarkan hasil rancangan Ozias akins et al. (1998). Dimana primer terpaut apomiksis tersebut dikembangkan dari Pennisetum apomiksis dan seksual, berdasarkan hasil pengembangan sequence characterized amplified region (SCAR) dari sekuen
11 DNA hasil random amplified polymorphic DNA (RAPD). Marka molekuler terpaut karakter apomiksis yang digunakan pada penelitian ini yaitu, marka molekuler C4 (forward 5‟CCGCATCTACAATAATCA‟3 dan reverse
5‟GAAATAAAGGCACTGGGA‟3).
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat Dekatnya (Garcinia spp.). Isolasi DNA 41 tanaman manggis dan kerabat dekatnya, dilakukan mengikuti metode Doyle dan Doyle (1990) dengan beberapa modifikasi, menggunakan buffer ekstraksi(10% CTAB, 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 5 M NaCl dan 1% β-mercaptoethanol) dengan penambahan
polivinilpyrolidon. Potongan daun muda sebanyak 0.15 mg digerus menggunakan mortar dengan menambahkan sekitar 0.6-0.8 ml buffer ekstraksi. Setelah digerus sampai halus, ekstrak daun tersebut dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan diinkubasi pada suhu 65°C selama 1 jam. Proses inkubasi ini dimaksudkan agar proses lisis dinding sel dapat berjalan dengan baik. Setelah diinkubasi, eppendorf
selanjutnya disentrifuse pada 11.000 rpm selama 10 menit setelah ditambahkan CIA (Chloroform:Isoamil Alcohol 24:1 v/v), supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tabung mikro steril 1000 µl baru dengan menambahkan 500 sampai 600 µl 2-propanol dingin dan diinkubasi dalam freezer overnight. Selanjutnya, disentrifuse dan supernatan dibuang. Pelet yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70% dan dikering anginkan overnight. Pelet dilarutkan dalam 10 sampai 50 µl TE (1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M EDTA (pH 8.0) dan Aquades).
Skrining Primer. Primer yang telah didesain sebelumnya, selanjutnya dilakukan skrining primer pada sampel tanaman manggis dan kerabat dekatnya yang telah dikoleksi. Skrining primer dilakukan dengan menggunakan mesin PCR (Termocycler Aplied Biosistems 2720 USA) dengan volume reaksi 25 µl (2 µl DNA template (10 ng/μl), masing-masing 1 µl primer (10 ng/μl), 12.5 µl Go Taq Green Master Mix (Promega M7122) dan 9.5 µl air murni). Proses amplifikasi PCR dilakukan sebanyak 35 siklus setelah denaturasi awal pada suhu 94°C selama 4. Setiap siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 94°C selama 45 detik, annealing pada suhu 45-65°C selama 30 detik dan pemanjangan fragmen DNA pada suhu 72°C selama 20 detik. Amplifikasi PCR diakhiri dengan dilakukan ektensi pada suhu 72°C selama 10 menit.
Elektroforesis Fragmen DNA Manggis dan Kerabat Dekatnya Hasil PCR. Fragmen DNA hasil amplifikasi di elektroforesis bersama dengan DNA standar 1 kb DNA ladder pada gel agarose 1.2% dalam buffer TBE 1X selama 45 menit pada tegangan 50 volt dan diwarnai dengan 1% ethidium bromide selama 10 menit untuk melihat fragmen DNA manggis yang dihasilkan. Selanjutnya hasil elektroforesis didokumentasikan dan disimpan.
Analisis Sekuen Fragmen DNA dan Pengembangan Marka Molekuler untuk Indentifikasi Karakter Apomiksis pada Manggis dan Kerabat Dekatnya. Analisis runutan basa DNA fragmen pita marka molekuler terpaut karakter apomiksis dilakukan menggunakan jasa sekuensing. Pengembangan marka molekuler terpaut karakter tersebut dilakukan berdasarkan sekuen manggis dan kerabat dekatnya mengikuti metode Innis dan Gelfand (1990) berdasarkan
12
karakter apomiksis dari hasil analisis runutan basa DNA. Pengembangan marka molekuler terpaut karakter apomiksis akan dilakukan berdasarkan sekuen manggis dan kerabat dekatnya dengan teknik SNP.
Verifikasi Marka Molekuler. Verifikasi marka molekuler terpaut apomiksis dilakukan pada 41 tanaman manggis dan kerabat dekatnya, terdiri dari spesies yang bersifat apomiksis obligat dan apomiksis fakultatif.
Analisis Data. Analisis data dilakukan secara deskriptif untuk mengeksplorasi hubungan antara karakter variasi genotipe target dan fenotipe yang menunjukkan keterkaitan sifat dengan sekuen yang telah didesain primernya. Hal ini dilakukan dengan menyusun data setiap fragmen DNA hasil amplifikasi, dengan ketentuan tidak ada fragmen dan ada fragmen pada posisi yang sama. Hasil sekuen DNA selanjutnya dilakukan analisis homologi sekuen untuk melihat dan membuktikan bahwa sekuen yang telah dikembangkan merupakan marka molekuler untuk identifikasi karakter apomiksis pada Garcinia dengan menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida (BLAST-N) pada National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Hasil dan Pembahasan Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis
Marka molekuler terpaut karakter apomiksis yang digunakan pada penelitian ini merupakan marka molekuler yang telah di desain dari penelitian sebelumnya (PKBT 2010), hasil rancangan Ozias akins et al. (1998). Pada penelitian tersebut telah diamplifikasikan beberapa marka molekuler, untuk mengidentifikasi karakter apomiksis pada manggis. Marka molekuler ini merupakan hasil pengembangan sequence characterized amplified region (SCAR) terpaut karakter apomiksis pada Pennisetum (Ozias akins et al. 1998).
Berdasarkan sekuen primer terpaut karakter apomiksis, maka dapat dilakukan skrining PCR. Dimana proses skrining PCR dilakukan untuk menghasilkan fragmen pita spesifik yang berkaitan dengan karakter apomiksis pada Garcinia. Temperatur annealing pada proses skrining PCR dilakukan berdasarkan nukleotida penyusun primer tersebut. Pada penelitian ini, skrining PCR dilakukan pada temperatur annealing 45-65°C dan konsentrasi reaksi PCR yang bervariasi. Sebab keberhasilan proses PCR menghasilkan fragmen pita dipengaruhi reaksi dari masing-masing komponen PCR dan temperatur yang digunakan (Kwok et al. 1994).
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat Dekatnya (Garcinia spp.)
Proses ekstraksi DNA 41 spesies manggis dan kerabat dekatnya dilakukan dengan beberapa modifikasi dari metode Doyle dan Doyle (1990), yaitu menggunakan senyawa CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 10% dengan NaCl 5N (Carmin del Castillo 2006) dan senyawa β-mercaptoethanol
yang bertujuan untuk menghambat oksidasi senyawa fenolik pada daun manggis dan kerabat dekatnya (Mansyah 2010). Sehingga proses ektraksi dapat dilakukan
13 dengan baik serta mendapatkan DNA dengan kualitas dan kuantitas yang cukup murni untuk analisis selanjutnya (Nkongolo et al. 1998). Hal ini dilakukan karena daun manggis dan kerabat dekatnya mengandung senyawa metabolit sekunder yang cukup tinggi, yaitu senyawa polifenol yang dapat menghasilkan aktivitas radikal bebas terhadap DNA dan menghambat kerja buffer ekstraksi dalam melisis dinding sel (Sinaga 2008). Tingginya senyawa fenolik pada daun terlihat dari cepatnya proses pencoklatan yang terjadi pada saat daun dipotong (Zainudin et al. 2010).
Proses ektraksi DNA pada penelitian ini juga menggunakan senyawa CIA (Chloroform:Isoamil Alcohol) yang bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa senyawa fenolik, sebab dapat penghambat proses amplifikasi DNA selanjutnya (Harini et al. 2008). Penambahan senyawa CIA tidak dapat mendenaturasi RNA, karena RNA tidak dapat larut didalam pelarut organik. Sehingga pada penelitian ini dilakukan penambahan senyawa RNAse yang bertujuan untuk menghilangkan RNA. Selain itu beberapa spesies kerabat manggis juga mengandung senyawa polisakarida yang tinggi, ini terlihat dari terbentuknya larutan kental pada saat penggerusan daun. Sehingga DNA tidak terisolasi dengan baik karena struktur polisakarida mirip dengan struktur asam nukleat dan dapat mengendap bersamaan dengan asam nukleat (Zainudin et al. 2010). Kesulitan ini dapat diatasi dengan melakukan perendaman hasil penggerusan dengan CTAB dalam waterbath selama semalaman pada suhu 65°C. Sebab senyawa CTAB umum dipakai pada proses ekstraksi sel tanaman yang banyak mengandung senyawa polifenol dan polisakarida (Jose & Usha 2000). Hasil ekstraksi DNA manggis dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.) dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Hasil elektroforesis ektraksi DNA manggis dan kerabat dekatnya. M = DNA Lamda, 1 = Garcinia mangostana L., 2 = Garcinia hambroniana Pierre, 3 = Garcinia celebica L. (2) dan 4 = Garcinia malaccensis T. Anderson
Amplifikasi DNA Manggis dan Kerabat Dekatnya dengan Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis
Proses amplifikasi DNA manggis dan kerabat dekatnya dengan menggunakan primer terpaut karakter apomiksis, dilakukan dengan skrining PCR sampai diperoleh fragmen pita. Marka molekuler C4 berhasil menghasilkan fragmen pita DNA pada temperatur annealing 65°C (Gambar 5). Pada penelitian ini, kami menggunakan empat spesies Garcinia sebagai spesies acuan dalam mengembangkan marka molekuler terpaut karakter apomiksis. Untuk menganalisis kekerabatan Garcinia berdasarkan sifat apomiksis obligat dan
14
fakultatif. Empat spesies acuan tersebut, yaitu G. mangostana L., G. hambroniana
Pierre, G. celebica L. (2) dan G. malaccensis T. Anderson.
Empat spesies Garcinia tersebut digunakan sebagai sekuen acuan untuk mengembangkan marka molekuler terpaut karakter apomiksis, disebabkan karena berdasarkan beberapa penelitian sebelumnya diketahui bahwa G. mangostana L. merupakan tanaman hibrid hasil dari satu kali persilangan antara G. hambroniana
Pierre dan G. malaccensis T. Anderson yang mewarisi sifat apomiksis obligat (Richards 1990). Serta Sulassih (2011), berdasarkan data morfologi dan penanda molekuler ISSR diketahui bahwa G. mangostana L. memiliki tingkat kemiripan yang lebih tinggi dengan G. malaccensis T. Anderson dan G. celebica L.. Hal ini juga didukung oleh penelitian sebelumnya (Sinaga 2008) yang menyatakan bahwa
G. celebica L. menghasilkan fragmen pita isoenzim dan AFLP yang lebih banyak sama dengan G. mangostana L. dibandingkan dengan fragmen pita yang dihasilkan pada G. hambroniana Pierre.
Gambar 5 Hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis dan kerabat dekatnya dengan marka molekuler C4. M = 1 kb, 1 = Garcinia mangostana L., 2 = Garcinia hambroniana Pierre, 3 = Garcinia celebica L. (2) dan 4 = Garcinia malaccensis T. Anderson
Pada Gambar 5 di atas, dapat diketahui bahwa hasil amplifikasi marka molekuler C4 dari ke empat spesies yang digunakan hanya tiga spesies yang menghasilkan fragmen pita dengan ukuran ± 480 pb. Sedangkan satu spesies lainnya, yaitu spesies G. hambroniana Pierre tidak menghasilkan fragmen pita. Hal ini diperkirakan karena karakter apomiksis pada G. hambroniana Pierre memiliki susunan basa DNA yang berbeda dengan primer yang digunakan, sehingga tidak menghasilkan fragmen pita walaupun memiliki sifat apomiksis dan telah dilakukan skrining PCR. Oleh karena itu untuk analisis runutan basa DNA pada penelitian ini selanjutnya hanya ke tiga spesies yang digunakan sebagai spesies acuan untuk mengembangkan marka molekuler terpaut karakter apomiksis, yaitu, G. celebica L. (2) (apomiksis fakultatif), G. malaccensisT. Anderson(apomiksis fakultatif) dan G. mangostana L. (apomiksis obligat).
Analisis Sekuan DNA dan Pengembangan Marka Molekuler untuk Indentifikasi Karakter Apomiksis pada Manggis dan Kerabat Dekatnya
Hasil kromatogram analisis sekuen DNA manggis dan kerabat dekatnya (Lampiran 1, 2 dan 3) selanjutnya dianalisis untuk dapat dilakukan uji homologi pada database GenBank NCBI. Sekuen DNA yang dihasilkan dengan
15 menggunakan marka molekuler terpaut karakter apomiksis pada penelitian ini tidak memiliki kemiripan sekuen DNA database GenBank ketika di uji homologi. Hal ini diperkirakan karena sekuen terpaut karakter apomiksis belum banyak dilaporkan khususnya untuk tanaman manggis (G. mangostana L.) dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.).
Hasil analisis sekuen DNA terpaut karakter apomiksis yang telah diperoleh, selanjutnya dilakukan desain primer spesifik untuk membedakan
Garcinia berdasarkan sifat apomiksis yang dimiliki. Desain primer dilakukan dengan melihat variasi nukleotida hasil analisis runutan basa DNA pada tiga spesies acuan (G. celebica L. (2), G. malaccensis T. Anderson dan G. mangostana
L.), yang dikenal dengan istilah single nucleotide polymorphism (SNP). Desain primer dengan teknik SNP telah banyak dilakukan untuk pemetaan genetik, analisis keragaman, identifikasi kultivar dan seleksi karakter tertentu pada tanaman. Variasi nukleotida antar ke tiga spesies Garcinia acuan dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6 Hasil aligment sekuen DNA terpaut karakter apomiksis. bold = variasi nukleotida, = primer apomiksis forward dan reverse, Apo_F = Primer apomiksis forward, Apo_1R = Primer apomiksis
reverse 1, Apo_2R = Primer apomiksis reverse 2 dan Apo_3R = Primer apomiksis reverse 3
Berdasarkan gambar hasil aligment di atas, maka dapat dilihat bahwa terdapat variasi nukleotida terpaut karakter apomiksis antar spesies Garcinia. Desain primer spesifik terpaut karakter apomiksis berdasarkan sekuen DNA ke tiga spesies Garcinia, akan membedakan Garcinia apomiksis obligat dan fakultatif. Pada penelitian ini kami mendesain satu primer forward dan tiga primer
reverse dengan teknik SNP. Primer Apo_1R di desain berdasarkan variasi nukleotida sekuen DNA G. celebica L. (2) yang merupakan apomiksis fakultatif.
G. mangostana L. TCTACAATAA TCACCACCAT ACCAAAACCA ACCACTGCCC CTTATGTAAA [ 50]
G. malaccensis ... ... ... ... ... [ 50]
G. celebica L.(2) ... ... ... ... ... [ 50]
G. mangostana L. CAAAACCCAA GGCCCAACTA ACCCAACCAG CTCCACCAAC CTACAATGAG [100]
G. malaccensis ... ... ... ... ... [100]
G. celebica L.(2) ... ...T.. ... ... T... [100]
G. mangostana L. ACCATCGCCT ACCAATACCC TGAAACAAAT CCAACGACAA CCCAAAGATG [150]
G. malaccensis ... ... ... ... ... [150]
G. celebica L.(2) ... ... ... ... ... [150]
G. mangostana L. CCACCCAGTA ACTACACCAC CTTCAGTTGC TTCCCTCCAT GAAAAGGCTG [200]
G. malaccensis ... ... ... ... ... [200]
G. celebica L.(2) ... ... ... ... ... [200]
G. mangostana L. AATCCCAAGC TGCTTTCCCA AATCCTTCCA AACTAGCCTC AAAACCACCA [250]
G. malaccensis ... ... ... ... ... [250]
G. celebica L.(2) ... ... ... ... ... [250]
G. mangostana L. CCCCTTTTGT ACCGATCCAC CTTGAAGACC AAACCAAAAC GACCACATTC [300]
G. malaccensis ... ... ... ... ... [300]
G. celebica L.(2) ... ... ... ... ... [300]
G. mangostana L. CCAGCCCAAG TGGAAAA-GA CAACTAAGTT GAAGCCTGTC CCGCTATTCT [350]
G. malaccensis ... ...G...T.. ... ... ... [350] G. celebica L.(2) A... ...G...T.. ... ... ... [350] Apo_3R Apo_1R Apo_2R Apo_F
16
Sedangkan primer Apo_2R di desain berdasarkan sekuen DNA G. malaccensis T. Anderson (apomiksis fakultatif) dan primer Apo_3R berdasarkan sekuen DNA G. mangostana L. yang merupakan apomiksis obligat. Marka molekuler yang telah dikembangkan dapat dilihat pada Tabel 2.
Desain primer berdasarkan variasi nukleotida dilakukan agar primer yang didesain bersifat spesifik, sehingga menempel pada fragmen DNA terpaut karakter apomiksis dan dapat digunakan untuk analisis kekerabatan Garcinia. Hal ini disebabkan karena desain primer dengan teknik SNP memiliki struktur dengan ujung 3‟OH yang bervariasi antar ke tiga spesies Garcinia, sehingga primer tersebut hanya akan mengenali dan menempel secara spesifik pada spesies yang memiliki nukleotida komplementer (Miftahudin 27 Februari 2013, komunikasi pribadi).
Tabel 2 Marka molekuler spesifik terpaut karakter apomiksis pada Garcinia
Marka
molekulera Sekuen primer (5’ –3’) Annealing Suhu
(°C) Ukuran produk PCR (pb)a Termasuk dalam Kelompoka Apo_Fak1 F = ACAATAATCACCACCATACC 59 300 A1 R = TCATTTCCCACTTGGGCTGT Apo_Fak2 F = ACAATAATCACCACCATACC 62 317 A2 R = AGGCTTCAACTTAGTTGTCA Apo_Obli F = ACAATAATCACCACCATACC 63 300 B R = GTCTTTTCCACTTGGGCTGG a
Apo_Fak1: marka molekuler apomiksis fakultatif 1; Apo_Fak2: marka molekuler apomiksis fakultatif 2; Apo_Obli: marka molekuler apomiksis obligat, pb: pasang basa, A1: apomiksis fakultatif dengan bunga dioecious, A2: apomiksis fakultatif dengan bunga hermaprodit, B: apomiksis obligat.
Verifikasi Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis dan Analisis Data Primer yang telah di desain, selanjutnya di verifikasi dengan melakukan amplifikasi pada DNA manggis dan kerabat dekatnya. Verifikasi ini dilakukan untuk membuktikan bahwa primer yang telah dikembangkan berfungsi mengenali dan mengamplifikasi sesuai dengan sifat yang dikembangkan. Verifikasi marka molekuler terpaut karakter apomiksis dilakukan pada tiga spesies Garcinia acuan dan pada 41 spesies Garcinia. Verifikasi pada tiga spesies acuan dilakukan untuk membuktikan bahwa primer yang telah dikembangkan, akan menghasilkan fragmen pita yang sesuai. Sedangkan verifikasi pada 41 spesies Garcinia
dilakukan untuk analisis kekerabatan dan mengelompokkan Garcinia berdasarkan sifat apomiksis yang dimiliki. Hasil verifikasi pada tiga spesies acuan (G. celebica
L. (2), G. malaccensis T. Anderson dan G. mangostana L.) dapat dilihat pada Gambar 7.
Pada Gambar 7 dapat diketahui bahwa marka molekuler yang telah dikembangkan menghasilkan fragmen pita DNA yang sesuai dengan rancangan primer, yaitu marka molekuler Apo_Fak1 menghasilkan fragmen pita pada G. celebica L. (2), Apo_Fak2 menghasilkan fragmen pita pada G. malaccensis T. Anderson dan G. celebica L. (2). Sedangkan Apo _Obli menghasilkan pita pada
G. mangostana L.dengan ukuran ± 300 pb. Hal ini menunjukkan bahwa marka molekuler spesifik terpaut karakter apomiksis yang telah dikembangkan pada penelitian ini, dapat mengamplifikasi DNA Garcinia sesuai dengan variasi
17 nukleotida yang dimiliki dan komplementer dengan ujung 3‟OH primer tersebut. Oleh karena itu marka molekuler terpaut karakter apomiksis ini dapat digunakan untuk membedakan Garcinia berdasarkan karakter apomiksisnya. Marka molekuler terpaut karakter apomiksis ini selanjutnya dapat digunakan dalam analisis kekerabatan Garcinia dan dapat dikembangkan lebih lanjut untuk pemuliaan tanaman Garcinia. Sebab kemampuan suatu marka molekuler dalam mengelompokan dan membedakan spesies menunjukkan bahwa marka molekuler tersebut dapat digunakan.
Gambar 7 Hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis dan kerabat dekatnya. M = 1 kb, 1 = Garcinia celebica L. (2), 2 = Garcinia malaccensis, 3 =
Garcinia mangostana L., Apo_Fak1 = marka molekuler apomiksis fakultatif 1, Apo_Fak2 = marka molekuler apomiksis fakultatif 2 dan Apo_Obli = marka molekuler apomiksis obligat
Verifikasi pada 41 spesies Garcinia dilakukan untuk menganalisis kekerabatan antar Garcinia, hal ini dilakukan karena analisis kekerabatan dengan menggunakan penanda molekuler terpaut suatu karakter dapat menjelaskan hubungan kekerabatan baik di dalam maupun antar spesies (Hurtado et al. 2002). Menurut Roy et al. (2006), penanda molekuler dari suatu sifat tertentu akan memberikan informasi genetik yang sangat berguna pada tingkatan molekuler untuk analisis kekerabatan suatu individu. Berdasarkan hasil verifikasi pada 41 spesies Garcinia dengan menggunakan marka molekuler terpaut karakter apomiksis, maka dapat dilakukan pengelompokan antar spesies manggis dan kerabat dekatnya berdasarkan karakter apomiksis obligat dan fakultatif.
Fragmen pita yang terbentuk menunjukkan hubungan kekerabatan antar spesies, dimana muncul tidaknya fragmen pita menjelaskan bahwa adanya perbedaan sekuen DNA antar spesies yang dapat dideteksi primer. Suatu primer dapat mengenali dan mengamplifikasi DNA apabila terdapat urutan nukleotida yang homolog dan ada tidaknya variasi genotipe antara sekuen DNA sample dengan marka molekuler (Upadhyay et al. 2004). Hasil verifikasi pada 41 spesies
Garcinia dapat dilihat pada Tabel 3, dimana spesies Garcinia yang menghasilkan