PENYUSUN SALURAN GETAH KUNING PADA MANGGIS
(Garcinia mangostana L.)
Abstrak
Salah satu masalah utama dalam pengembangan tanaman manggis adalah adanya getah kuning pada buah yang disebabkan karena rusaknya dinding sel penyususn saluran getah kuning. Marka molekuler terpaut kekuatan dinding sel dapat digunakan untuk menseleksi buah manggis yang tidak bergeth kuning. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan marka molekuler spesifik terpaut karakter kekuatan dinding sel. Sebanyak 39 aksesi Garcinia mangostana L. telah dikoleksi dari Sumatra Barat dan Jawa Barat yang digunakan pada penelitian ini. Pengembangan marka molekuler ini dilakukan dengan membentuk kombinasi Nested PCR. Pada penelitian ini telah berhasil menghasilkan satu set marka molekuler terpaut karakter getah kuning pada buah manggis. Primer spesifik yang telah dikembangkan berhasil menghasilkan fragmen pita DNA spesifik dengan ukuran 260 pb yang polimorfik antara aksesi dengan buah bergetah kuning dan tidak bergetah kuning. Sehingga marka molekuler spesifik terpaut kekuatan dinding sel pada manggis dapat digunakan sebagai informasi awal dalam seleksi manggis dengan buah tidak bergetah kuning.
Kata kunci: Garcinia mangostana L., getah kuning, kekuatan dinding sel, marka molekuler
Pendahuluan
Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan salah satu komoditas buah tropik primadona ekspor Indonesia yang sangat disenangi dan diminati pasar internasional sehingga dijuluki “queen of tropical fruits”. Permintaan ekspor manggis masih sangat tinggi, tetapi kuota permintaan tidak dapat terpenuhi dengan baik (Mansyah 2011). Hal ini dikarenakan berbagai kendala, seperti rendahnya produksi dan mutu buah manggis yang tidak memenuhi kriteria ekspor dikarenakan oleh cemaran getah kuning (gamboge disorder) (Indriyani et al.
2002).
Menurut Syah et al. (2007) getah kuning pada buah manggis disebabkan karena dinding sel saluran getah kuning di endokarp pecah akibat perubahan tekanan turgor di dalam sel penyusun perikarp buah. Dorly et al. (2008), juga menyatakan bahwa getah kuning dihasilkan di dalam saluran getah yang berbentuk kanal bercabang dikelilingi oleh sel epitel pada endokarp dan rusaknya dinding sel epitel ini akan menyebabkan keluarnya getah kuning yang akan
23 mengotori daging buah (aril). Getah kuning yang merusak aril dapat menyebabkan rasa buah menjadi pahit (Sdoodee & Limpun-udom 2002). Hal ini didukung Jawal
et al. (2010), yang menyatakan bahwa getah kuning merupakan salah satu masalah fisiologis pada buah manggis berkaitan dengan perubahan turgiditas sel yang menyebabkan pecahnya dinding sel penyusun saluran getah kuning sehingga buah tercemar getah berwarna kuning.
Buah manggis yang bergetah kuning pada bagian aril sulit dibedakan dengan buah yang tidak bergetah kuning, kecuali buah dibuka terlebih dahulu. Hal ini menyulitkan proses seleksi untuk memperoleh buah manggis yang tidak bergetah kuning (Mansyah et al. 2004). Oleh karena itu diperlukan tanaman yang memiliki dinding sel epitel yang kuat dan tahan terhadap pecahnya dinding sel. Untuk membantu seleksi agar lebih cepat dan efektif, diperlukan marka molekuler yang terkait dengan sifat kekuatan dinding sel penyususn saluran getah kuning. Marka molekuler tersebut dapat digunakan untuk memilih tanaman manggis yang akan dikembangkan sebagai tetua buah manggis yang tidak bergetah kuning (Sobir 28 Maret 2012, komunikasi pribadi).
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan marka molekuler spesifik terpaut karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning pada buah manggis yang dapat digunakan untuk identifikasi buah manggis yang berpotensi tidak mengeluarkan getah kuning akibat kerusakan dinding sel. Marka molekuler tersebut dikembangkan berdasarkan sekuen DNA dari tanaman manggis. dalam peper ini dilaporkan marka molekuler yang terpaut sifat kekuatan dinding sel epitel penyusun saluran getah kuning pada buah manggis dan dapat digunakan untuk identifikasi buah manggis tidak bergetah kuning.
Bahan dan Metode Bahan Tanaman
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 39 tanaman (aksesi) manggis dengan buah bergetah kuning (20 aksesi) dan buah tidak bergetah kuning (19 aksesi), yang dikoleksi dari Pulau Sumatra (Balitbu) dan Pulau Jawa (Leuwiliang) (Mansyah 2011). Sampel 39 aksesi manggis yang telah dikoleksi dapat dilihat pada Tabel 5.
24
Tabel 5 Sampel 39 aksesi manggis buah bergetah dan tidak bergetah kuning No Aksesi Getah Kuning Keterangan Tempat Habitat
1 A1/Koleksi Balitbu Tidak Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
2 A2/Koleksi Balitbu Tidak Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
3 A3/Koleksi Balitbu Tidak Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
4 A4/Koleksi Balitbu Tidak Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
5 A5/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
6 A6/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
7 A7/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
8 A8/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
9 A9/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
10 A10/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
11 A11/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
12 A12/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
13 A13/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
14 A14/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
15 A15/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
16 A16/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
17 A17/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
18 A18/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
19 A19/Leuwiliang Tidak Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
20 B1/Koleksi Balitbu Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
21 B2/Koleksi Balitbu Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
22 B3/Koleksi Balitbu Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
23 B4/Koleksi Balitbu Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
24 B5/Koleksi Balitbu Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
25 B6/Koleksi Balitbu Ada Perkarangan, lahan kering dan 237 m dpl
26 B7/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
27 B8/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
28 B9/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
29 B10/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
30 B11/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
31 B12/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
32 B13/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
33 B14/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
34 B15/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
35 B16/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
36 B17/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
37 B18/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
38 B19/Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
39 B20/ Leuwiliang Ada Kebun, lahan kering dan 340 m dpl
Metode
Desain Primer untuk Marka Molekuler Terpaut Karakter Kekuatan Dinding Sel. Pengembangan marka molekuler terpaut sifat tersebut dilakukan berdasarkan sekuen manggis mengikuti metode Innis dan Gelfand (1990). Desain primer untuk marka molekuler terpaut kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning dilakukan berdasarkan hasil multiple aligment dari beberapa sekuen gen Fragile Fiber 1 (FRA 1) penyandi mikrofibril selulosa dinding sel tanaman dengan menggunakan program BioEdit (Hall 2007) dan ClustalX (Thomson et al.
1997). Data sekuen yang dipilih berdasarkan penelitian sebelumnya (Mansyah 2011) menggunakan informasi data sekuen hasil homologi sekuen yang berasosiasi dengan kekuatan dinding sel tanaman dari beberapa aksesi tanaman
25 (AY158083.1, AY158084.1, NM_180820.1, NM_124156.4 dan XM_002510131.1) menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida (BLAST-N) pada National Center for Biotechnology Information
(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov) dengan ukuran wilayah konserv yang lebih besar (20 pb) dan membentuk kombinasi nested PCR. Nested primer didesain dengan program Primer3 (Rozen et al. 2000).
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.). Isolasi DNA 39 aksesi manggis, dilakukan mengikuti metode Doyle dan Doyle (1990) dengan tahapan yang sama dengan proses isolasi DNA pada 41 spesies manggis (Garcinia mangostana L.) dan kerabt dekatnya (Garcinia spp.).
Skrining Primer. Primer yang telah didesain berdasarkan hasil homologi sekuen dengan program BLAST-N pada NCBI selanjutnya dilakukan skrining primer pada sampel tanaman manggis yang telah dikoleksi. Skrining primer dilakukan dengan tahapan yang sama dengan proses skrining primer terpaut karakter apomiksis sebelumnya, menggunakan mesin PCR (Termocycler Aplied Biosistems 2720 USA) dengan volume reaksi 25 µl. Dimana Proses amplifikasi nested PCR dilakukan sebanyak dua kali dengan menggunakan kombinasi pasangan primer yang berbeda, yaitu (1) K_2F dan K_1R, (2) K_2F dan K_2R, (3) K_1F dan K_2R dan (4) K_1F dan K_1R.
Elektroforesis Fragmen DNA Manggis Hasil PCR. Proses elektroforesis produk PCR dengan menggunakan marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel dilakukan seperti pada proses elektroforesis produk PCR menggunakan marka molekuler terpaut karakter apomiksis, yaitu menggunakan gel agarose 1.2%.
Purifikasi Fragmen DNA Polimorfik. Setelah di elektoforesis, selanjutnya fragmen DNA yang polimorfik dielusi dari potongan gel agarose dengan buffer elusi (50 mM Tris, pH 7.5;0.1% SDS) dan dipurifikasi dengan menambahkan 100 µl buffer CIA. Selanjutnya dilakukan proses pemisahan fraksi dengan cara sentrifugasi pada 11.000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh ditambahkan etanol dingin sebanyak 250 µl bersamaan dengan 10 µl Na Asetat, overnight dalam frezzer. Selanjutnya disentrifuse dan pelet yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70%. Pelet selanjutnya dikering anginkan dan siap dilakukan proses PCR serta purifikasi kembali sampai diperoleh fragmen DNA yang diinginkan (Sobir 28 Februari 2012, komunikasi pribadi).
Analisis Sekuen dan Pengembangan Marka Molekuler untuk Indentifikasi Karakter Kekuatan Dinding Sel pada Manggis. Analisis sekuen DNA dengan marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel juga dilakukan menggunakan jasa sekuensing. Pengembangan marka molekuler terpaut karakter ini akan dilakukan berdasarkan sekuen manggis yang menghasilkan buah tidak bergetah kuning dengan mengikuti metode Innis dan Gelfand (1990). Pengembangan marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel dilakukan berdasarkan sekuen DNA manggis dengan teknik STS.
26
Verifikasi Marka Molekuler. Verifikasi marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel dilakukan pada 39 aksesi manggis yang terdiri dari aksesi manggis dengan buah bergetah kuning (20 aksesi) dan buah tidak bergetah kuning (19 aksesi).
Analisis Data. Analisis data yang dilakukan sama dengan analisis sebelumnya (Halaman 12). Selanjutnya dilakukan uji homologi sekuen untuk melihat dan membuktikan bahwa sekuen yang telah dikembangkan merupakan marka molekuler untuk identifikasi karakter kekuatan dinding sel pada manggis dengan menggunakan program BLAST-N dan Align two (or more) sequences using BLAST (BL2SEQ) dengan sekuen acuan (AY158084.1) pada NCBI.
Hasil dan Pembahasan
Desain Primer untuk Marka Molekuler Terpaut Karakter Kekuatan Dinding Sel
Desain primer untuk marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel pada penelitian ini dilakukan berdasarkan data hasil sekuen homologi database kekuatan dinding sel dari beberapa tanaman pada NCBI (AY158083.1, AY158084.1, NM_180820.1, NM_124156.4 dan XM_002510131.1), yang dikembangkan dari penelitian sebelumnya (Mansyah 2011). Pemilihan beberapa aksesi tanaman dilakukan berdasarkan hasil seleksi sekuen penyandi kekuatan dinding sel dengan tingkat kemiripan tinggi (Tabel 6). Sekuen ini diperkirakan menyandi protein yang memiliki peranan penting dalam memberi kekuatan pada dinding sel. Hal ini dikarenakan protein tersebut merupakan salah satu protein yang berperan dalam orientasi penyusunan mikrofibril pada pembentukan dinding sel tanaman, sehingga memberikan kekuatan pada dinding sel agar tidak mudah lisis (Mansyah 2011).
Tabel 6 Aksesi tanaman yang digunakan sebagai acuan untuk mengembangkan marka molekuler
Aksesi Deskripsi Ukuran
(pb) Tingkat keindentikan Nilai Query coverage E-Value NM_180 820.1
Arabidopsis thaliana kinesin
family member 4/7/21/27
(FRA1) mRNA, complete cds 3288 100% 6072 100% 0.0
NM_124 156.4
Arabidopsis thaliana kinesin
family member 4/7/21/27
(FRA1) mRNA, complete cds 3601 100% 5967 98% 0.0
XM_002 510131.1
Ricinus communis Kinesin
heavy chain, putative, mRNA 3204 78% 1927 91% 0.0
AY1580 84.1
Arabidopsis thaliana kinesin-like protein (FRA1) gene,
complete cds 5725 100% 6226 100% 0.0
AY1580 83.1
Arabidopsis thaliana kinesin-like protein (FRA1) mRNA, complete cds
27 Desain primer untuk marka molekuler terpaut kekuatan dinding sel dilakukan mengunakan program Primer3 (Rozen et al. 2000) dengan kriteria pemilihan: (1) primer merupakan wilayah konservatif dengan panjang sekuen 20 pb dan rasio G/C 50% (Lampiran 7), (2) kesesuaian melting point primer forward
dan reverse tidak berbeda jauh dan tidak lebih dari 70°C (Sambrook & Russell 2001), (3) kestabilan ujung basa 5‟ dan spesifisitas ujung basa 3‟ yang tidak memiliki ujung T (Abd-Elsalam 2003), (4) tidak ditemukannya struktur jepit rambut dan dimer serta membentuk primer yang akan digunakan pada metode
nested PCR (Tabel 7).
Tabel 7 Primer untuk marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel berdasarkan hasil seleksi dari Database GenBank
Primera Sekuen primer (5’ –3’) Temperatur Annealing (°C) Ukuran produk PCR (pb)a K_1F GCGTTAAAGCAGCATTTTGG 65 875 K_1R TTGCAGCCTCTTCTGTCTTC K_2F CAAAGGAATGGGAGCATAAG 60 414 K_2R TGAACATCTTGCAACTTCTG a
K_1F: primer forward 1, K_1R: primer reverse 1, K_2F: primer forward 2 dan K_2R: primer reverse 2, pb: pasang basa.
Sekuen primer yang digunakan dalam proses amplifikasi DNA akan mempengaruhi spesifitas dan sensitivitas reaksi PCR. Desain primer dengan teknik nested PCR, dilakukan dengan memilih primer yang berada di dalam wilayah primer lainnya. Sehingga akan menghasilkan fragmen pita DNA berdasarkan fargmen pita dari reaksi PCR sebelumnya, sebab pada reaksi nested
PCR dilakukan dua kali proses reaksi PCR dengan konsentrasi reaksi yang sama dan kombinasi primer yang berbeda. Urutan basa nukleotida sekuen acuan yang didesain menjadi primer dengan teknik nested PCR dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10 Urutan basa nukleotida terpaut kekuatan dinding sel (5‟–3‟) hasil seleksi Database Genbank. Hijau = marka molekuler K_1F, ungu = primer K_1R, biru = primer K_2F dan kuning = primer K_2R
28
Berdasarkan Gambar 10 di atas, maka proses amplifikasi DNA manggis dilakukan secara nested PCR dengan empat kombinasi pasangan primer, yaitu (1) K_1F dengan K_1R, (2) K_2F dengan K_2R, (3) K_2F dengan K_1R dan (4) K_1F dengan K_2R. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan fragmen pita spesifik dan polimorfik yang hanya dimiliki aksesi manggis tahan terhadap lisisnya dinding sel, sehingga tidak ditemukannya getah kuning pada buah manggis. Pada teknik nested PCR setiap proses reaksi PCR menggunakan kombinasi primer yang berbeda-beda. Desain kombinasi primer dengan nested PCR terpaut kekuatan dinding sel dapat dilihat pada Tabel 8.
Tabel 8 Kombinasi primer kekuatan dinding sel dengan nested PCRa Primera Sekuen primer (5’ –3’) Annealing (Temperatur °
C) Ukuran Produk PCR (pb)a K_2F CAAAGGAATGGGAGCATAAG 60 1081 K_1R TTGCAGCCTCTTCTGTCTTC K_2F CAAAGGAATGGGAGCATAAG 60 414 K_2R TGAACATCTTGCAACTTCTG K_1F GCGTTAAAGCAGCATTTTGG 60 308 K_2R TGAACATCTTGCAACTTCTG K_1F GCGTTAAAGCAGCATTTTGG 65 875 K_1R TTGCAGCCTCTTCTGTCTTC a
PCR: Polymerase Chain Reaction, K_1F: primer forward 1, K_1R: primer
reverse 1, K_2F: primer forward 2 dan K_2R: primer reverse 2, pb: pasang basa. Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.)
Proses isolasi DNA 39 aksesi manggis pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode yang sama dengan proses ektraksi sebelumnya, yaitu metode Doyle dan Doyle (1990) dengan beberapa modifikasi. Hasil ekstraksi DNA manggis dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11 Hasil elektroforesis ektraksi DNA manggis. M = Lamda, 1–3 = DNA manggis buah tidak bergetah kuning dan 4–5 = DNA manggis buah bergetah kuning
Amplifikasi DNA Manggis dengan Marka Molekuler Terpaut Karakter Kekuatan Dinding Sel
Proses amplifikasi DNA manggis dilakukan secara skrining primer pada setiap kombinasi, sampai diperoleh fragmen pita polimorfik pada aksesi manggis dengan buah tidak bergetah kuning. Hasil amplifikasi DNA menunjukkan bahwa primer terpaut karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning dapat mengamplifikasi DNA manggis baik aksesi dengan buah yang bergetah kuning
29 maupun yang tidak bergetah kuning. Hasil amplifikasi DNA manggis dengan metode nested PCR menunjukkan, bahwa fragmen pita DNA yang dihasilkan polimorfik antara aksesi buah bergetah kuning dan tidak bergetah kuning dengan kombinasi pasangan primer pertama K_2F dan K_1R dan primer ke dua K_2F dan K_2R pada suhu annealing 60°C (Gambar 12).
Gambar 12 Hasil eletroforesis amplifikasi DNA manggis menggunakan kombinasi pasangan primer pertama K_2F dan K_1R dan primer ke dua K_2F dan K_2R. M = 1 kb, 1 = DNA satu individu manggis dengan buah bergetah kuning dan 2 = DNA satu individu manggis dengan buah tidak bergetah kuning
Berdasarkan Gambar 12 di atas dapat dilihat bahwa, pada penelitian ini telah diperoleh fragmen pita DNA polimorfik dengan ukuran fragmen berkisar ± 400 pb. Hasil ini sesuai dengan ukuran fragmen DNA target kombinasi primer K_2F dan K_2R, yang menghasilkan ukuran target DNA ± 414 pb. Akan tetapi pada proses amplifikasi pertama fragmen pita yang dihasilkan monomorfik dengan ukuran ± 500 pb, ini tidak sesuai dengan ukuran target DNA berdasarkan primer yang telah didesain. Ukuran target DNA yang diinginkan berdasarkan primer yang digunakan berkisar 1081 pb, ini diperkirakan karena posisi dan ukuran wilayah (ekson dan intron) yang dikenali antara genom manggis dan tanaman acuan berbeda. Sehingga kombinasi primer K_F2 dan K_R1 pada manggis (± 500 pb) menghasilkan ukuran fragmen yang berbeda dengan tanaman acuan (± 1080 pb).
Fragmen pita polimorfik tersebut selanjutnya dipurifikasi dengan cara memotong fragmen pita pada gel elektroforesis (gel agarose). Proses ini dikenal dengan istilah elusi, dimana fragmen pita DNA yang telah dipotong dipisahkan dari gel agarose dan digunakan untuk analisis runutan basa DNA selanjutnya. Analisis Sekuan DNA dan Pengembangan Marka Molekuler untuk Indentifikasi Karakter Kekuatan Dinding Sel pada Manggis
Berdasarkan hasil kromatogram analisis sekuen DNA dengan marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel (Lampiran 8), selanjutnya dilakukan uji homologi BLAST-N pada NCBI. Hasil uji homologi menunjukkan tidak ditemukan kemiripan sekuen dengan tanaman lain pada database GenBank
NCBI. Hal ini diperkirakan karena sekuen nukleotida yang berasosiasi dengan kekuatan dinding sel pada G. mangostana L. belum dilaporkan pada NCBI. Sehingga pada penelitian ini selanjutnya dilakukan uji homologi dengan teknik BL2SEQ dengan sekuen DNA dari Arabidopsis thaliana (AY158084.1).
30
Hasil uji homologi BL2SEQ antara G. mangostana L. dan A. thaliana
menghasilkan nilai E-value sebesar 0.69 dengan nilai query coverage sebesar 15% dan nilai identiknya 100%. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat homologi sekuen antar kedua sampel sangat rendah. Sekuen DNA dikatakan memiliki homologi tinggi jika E-value lebih kecil dari e-04, sehingga semakin rendah nilai E maka semakin tinggi tingkat kemiripan sekuen DNA (Claverie & Notredame 2003). Rendahnya tingkat homologi ini, diperkirakan karena tanaman yang digunakan sebagai sekuen acuan (A. thaliana) berbeda dengan tanaman yang di uji (G. mangostana L.).
Berdasarkan hasil analisis sekuen DNA tersebut, selanjutnya dilakukan desain primer spesifik untuk karakter kekuatan dinding sel dengan teknik STS mengikuti kriteria Sambrook dan Russell (2001), yaitu marka molekuler kekuatan dinding sel manggis (KDSM). Desain primer ini dilakukan dengan memilih urutan nukleotida yang tidak konserv dengan aksesi acuan sebelumnya. Hal ini dilakukan agar marka molekuler yang dikembangkan spesifik mengenali sekuen terpaut karakter kekuatan dinding sel pada G. mangostana L. (Tabel 9).
Tabel 9 Primer untuk marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel dari manggis
Markaa Primera Sekuen primer (5’ –3’) Annealing (Temperatur °
C) Ukuran produk PCR (pb)a KDSM K_2F CAAAGGAATGGGAGCATAAG 60 260 K_3R AGCGGACCACATTTAGAGTG a
KDSM = kekuatan dinding sel manggis, K_2F: primer forward 2 dan K_3R: primer reverse 3, pb: pasang basa.
Verifikasi Marka Molekuler Terpaut Kekuatan Dinding Sel dan Analisis Data
Primer yang telah didesain, selanjutnya diverifikasi pada 39 aksesi manggis dengan buah bergetah kuning yang diduga tidak memiliki kekuatan dinding sel (20 aksesi) dan tidak bergetah kuning yang diduga memiliki kekuatan dinding sel (19 aksesi). Verifikasi ini dilakukan untuk memastikan bahwa marka molekuler yang telah dikembangkan berfungsi mengenali dan mengamplifikasi sesuai dengan sifat yang dikembangkan. Sehingga dapat digunakan untuk deteksi dini kandidat aksesi manggis yang berpotensi memiliki buah tidak bergetah yang dapat dikembangkan lebih lanjut untuk keperluan pemuliaan tanaman manggis. Sebab kemampuan suatu marka molekuler dalam mengelompokkan dan membedakan aksesi menunjukkan bahwa marka molekuler tersebut dapat digunakan. Contoh hasil verifikasi marka molekuler KDSM terpaut kekuatan dinding sel pada 32 aksesi manggis, dapat dilihat pada Gambar 13 (7 aksesi manggis lainnya yang terdiri dari 2 aksesi tidak bergetah kuning dan 5 aksesi bergetah kuning tidak ditampilkan).
Hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel (Gambar 13), menunjukkan bahwa pada aksesi manggis dengan buah tidak bergetah menghasilkan pita DNA spesifik (single band) berukuran ± 260 pb, sedangkan pada aksesi manggis dengan buah bergetah kuning tidak menghasilkan pita DNA. Perbedaan ini menunjukkan bahwa marka
31 molekuler yang telah didesain dapat mendeteksi aksesi-aksesi manggis yang berpotensi menghasilkan buah yang tidak bergetah kuning, sehingga dapat dikembangkan dan digunakan untuk program pemuliaan tanaman manggis.
Gambar 13 Contoh hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis menggunakan marka molekuler KDSM. M = 1 kb, 1–17 = aksesi manggis buah tidak bergetah dan 20–34 = aksesi manggis buah bergetah kuning Berdasarkan hasil verifikasi (Gambar 13), maka diketahui bahwa terdapat 3 aksesi manggis yang memiliki karakter fenotipe buah tidak bergetah kuning, akan tetapi tidak manghasilkan fragmen pita yaitu aksesi 5, 6 dan 13 (dilingkari). Hal ini mungkin disebabkan penilaian fenotipe dari ke tiga buah manggis tersebut dilakukan pada waktu dan lingkungan yang kurang tepat, sehingga menghasilkan kesimpulan yang kurang tepat. Syah (2007) dan Shi et al. (2008) serta Srivastava
et al. (2005), menyatakan bahwa gejala getah kuning pada buah manggis merupakan masalah fisiologis yang berkaitan dengan tugoritas sel dan stress oksidatif akibat terjadi perubahan fluktuasi kadar air tanah serta toksisitas logam yang cukup ekstrim. Hal ini didukung dari hasil penelitian Balitbu (2007) yang manyatakan bahwa pemberian air secara berkala pada tanaman manggis dapat menurunkan persentase cemaran getah kuning pada buah manggis berkisar 35– 48%.
Kandungan hara dalam tanah juga berpengaruh terhadap cemaran getah kuning pada buah manggis, seperti Ca (Martias et al. 2012) dan Mn (Hue et al.
2001). Sebab peningkatan Ca (Hirshi 2004) dan Mn (Pittman 2005) meningkatkan stabilitas membran. Hal ini menunjukkan bahwa ada tidaknya getah pada buah manggis sangat dipengaruhi lingkungan pada saat perkembangan buah manggis. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa marka molekuler yang dikembangkan dapat digunakan sebagai informasi awal untuk menseleksi aksesi manggis yang berpotensi memiliki buah yang tidak bergetah kuning.
Simpulan
Pada penelitian ini telah berhasil dikembangkan marka molekuler kekuatan dinding sel manggis (KDSM) terpaut karakter kekuatan dinding sel yang tidak menghasilkan fragmen pita pada aksesi manggis dengan buah bergetah kuning dan menghasilkan fragmen pita berukuran ± 260 pb pada aksesi manggis dengan buah tidak bergetah kuning. Marka molekuler terpaut karakter kekuatan
32
dinding sel ini, dapat digunakan dalam program pemuliaan tanaman manggis untuk menseleksi manggis yang tidak bergetah kuning.