DAFTAR GAMBAR
MATERI DAN METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan di Taman Margasatwa Ragunan Jakarta selama satu tahun, dari bulan Desember 2005 sampai dengan Desember 2006. Pelaksanaan penelitian ini melibatkan kerjasama dengan Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (KRP-FKH-IPB) pada Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong Bogor dan Laboratorium Klinik Prodia Pusat Jakarta.
Materi Penelitian Hewan Percobaan
Hewan percobaan sebanyak enam ekor rusa timor (Cervus timorensis) adalah hasil seleksi. Adaptasi lingkungan dilakukan dalam kandang kelompok yang telah dirancang dengan ukuran 10 x 10 meter dan di dalamnya terdapat kandang naungan ukuran 4 x 6 meter untuk mempermudah penanganan rusa menuju lorong memasuki kandang kawin (IB). Kelengkapan kandang lainnya tempat pakan, tempat minum, kubangan dan kandang untuk IB (Gambar 4).
c b dd a e f
Gambar 4 Kandang kelompok percobaan untuk perlakuan proses adaptasi, sinkronisasi dan pelaksanaan IB; (a) kandang IB, (b) lorong, (c) kandang naungan, (d) tempat pakan, (e) tempat minum dan (f) kubangan
Dari proses adaptasi rusa selama lima bulan, terseleksi sebanyak enam ekor dari 13 ekor rusa betina yang memenuhi kriteria digunakan untuk penelitian. Kriteria tersebut secara umum kondisi sehat, bersiklus estrus normal, tidak bunting, ukuran tubuh proporsional dengan kisaran umur dua sampai tiga tahun yang ditandai dengan satu sampai dua pasang gigi susu berganti menjadi gigi tetap dan berat badan rata-rata 44,1 kg±3,55. Selanjutnya dilakukan pengamatan gejala estrus alamiah terhadap keenam ekor rusa betina tersebut sebagai penelitian pendahuluan (Gambar 5).
A B
Gambar 5 Adaptasi rusa betina percobaan dalam lingkungan kandang kelompok. (A) 13 ekor yang diadaptasikan dan (B) enam ekor terseleksi untuk digunakan penelitian
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam pelaksanaan IB: pistol IB, plastik sheath, spekulum atau vaginoskop, lampu senter, termos air panas, pinset panjang, kontainer N2 cair + semen beku, mikroskop (Gambar 6) dan alat USG (Aloka
SSB 500); tabung plastik (koleksi feses); Freeze Dry Machine® Model 79480 Lab Conco (kering beku feses); Mortar, saringan, analitical balance, tabung skala 15 ml (penumbukan dan penimbangan feses); Tabung ukur 100 ml, tabung ukur 25 ml, elenmeyer 200 ml, sentrifusa dan vibrax digunakan untuk ekstraksi.
Bahan preparat hormon yang digunakan untuk sinkronisasi adalah dalam bentuk CIDR-G (Agriculture Devition, CHH Plastic products Ltd, Hamilton) yang mengandung 0,3 g progesteron untuk implan intravaginal, aplikator (gun) dan PMSG (Laboratorios Hipra, S.A., Spain) yang disuntikkan secara intramuskuler.
Gambar 6 Alat inseminasi yang digunakan dalam pelaksanaan IB rusa timor percobaan
Untuk pembiusan digunakan Xylazine dan Ketamin, sedangkan bahan untuk persiapan sebelum analisa metabolit hormon progesteron, yaitu: (1) Jelly es (untuk koleksi feses), alkohol 70 %, methanol, milli-Q, dan feses 0,050 g digunakan untuk ekstraksi dan (2) untuk analisa metabolit hormon progesteron dengan menggunaan kit progesteron (PILKPG-9).
Pakan Rusa Percobaan
Pakan hijauan yang disediakan berupa rumput gajah, rumput lapangan dan leguminosa diberikan sebanyak 5-7 kg/ekor/hari pada pagi, siang dan sore. Konsentrat yang diberikan berupa pelet (GALAC) sebanyak 3 kg/hari ditambah dedak 2 kg/hari atau sebanyak 830 g/ekor/hari. Pakan tambahan lainnya berupa wortel, pisang, ubi jalar, ketela pohon, kubis, pepaya, kacang panjang, ketimun dan jagung tongkol yang telah dicacah sebanyak 2-3 kg/hari yang diberikan setelah pemberian konsentrat, sedangkan air minum diberikan secara adlibitum.
Metode Penelitian
Dalam penelitian ini dilakukan empat tahap kegiatan, yaitu: adaptasi, sinkronisasi, inseminasi buatan dan diagnosa kebuntingan. Kegiatan penelitian yang dilakukan, adalah:
I. Perlakuan adaptasi selama lima bulan dalam kandang kelompok percobaan dimaksudkan untuk memudahkan dalam penanganan dan mendapatkan gejala estrus alamiah.
II. Perlakuan sinkronisasi menggunakan CIDR-G yang diimplan selama 14 hari dan penyuntikan PMSG dua hari sebelum pencabutan CIDR-G untuk menentukan onset estrus dan lama estrus.
III. Pelaksanaan IB dibedakan dengan dua waktu IB, yaitu 24 jam dan 30 jam setelah onset estrus.
IV. Diagnosa kebuntingan dilakuan dengan : (1) Pengamatan gejala estrus siklus berikutnya.
(2) Teknik USG dan analisa metabolit hormon progesteron dari feses.
Kegiatan penelitian secara jelas dapat dilihat dalam alur kegiatan pelaksanaan IB (Gambar 7).
Parameter
- Siklus Estrus
- Gejala Estrus Alamiah
Gejala Estrus : - Onset Estrus - Intensitas Estrus - Sehat - Siklus Normal - Tubuh Proporsional
Pelaksanaan
IB
Sinkronisasi menggunakan CDR-G selama 14 hari dan PMSG dosis 150 IU dan 300 IU
Hewan Percobaan Terpilih (6 ekor rusa betina)
Adaptasi 5 bulan Terhadap Calon Hewan Percobaan (13 ekor rusa betina)
Waktu 24 jam Setelah Onset Waktu 30 jam Setelah Onset Diagnosa Kebuntingan
USG Uji Metabolit
Hormon P4
- Pengamatan gejala estrus - USG 60 hari setelah IB - Uji P4 120 hari setelah IB
Hasil
Adaptasi Rusa Calon Percobaan
Dalam tahap awal pelaksanaan adaptasi dilakukan seleksi terhadap 13 ekor rusa betina yang diperoleh dari kelompok populasi rusa timor dengan cara pembiusan. Ke-13 ekor rusa calon hewan percobaan tersebut tidak bunting dari hasil pemeriksaan dengan menggunakan USG (Gambar 9A,B), yang ditempatkan ke dalam kandang kelompok percobaan yang telah disiapkan untuk proses adaptasi. Dari proses adaptasi rusa yang sedang berjalan selama lima bulan terseleksi sebanyak enam ekor rusa betina yang memenuhi kriteria untuk diberi perlakuan dalam penelitian. Proses adaptasi dimaksudkan untuk mendapatkan rusa agar lebih mudah ditangani dan tidak mengalami stres pada saat perlakuan. Hewan hasil seleksi sebanyak enam ekor diadaptasi dan diamati estrus alamiahnya. Gejala-gejala estrus yang diamati berdasarkan gejala yang sudah ditentukan sebagai parameter (Tabel 4).
Tabel 4 Gejala–gejala estrus sebagai parameter pada rusa betina
No Gejala – gejala estrus
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
Nafsu makan menurun
Mendekati betina lain (gelisah) Mengeluarkan suara khas Urinasi
Mengintip pejantan (kandang sebelah) Vulva merah, bengkak dan basah Lendir transparan
Menaiki betina lain
Tidak menolak jika vulva dipegang Diam dinaiki sesama betina lain
Perlakuan Sinkronisasi
Sinkronisasi estrus dilakukan terhadap enam ekor rusa yang telah beradaptasi dan memenuhi kriteria dengan menggunakan preparat hormon progesteron dalam bentuk CIDR-G diimplan selama 14 hari secara intravaginal menggunakan alat implan (aplikator). Dua hari sebelum pencabutan, dilakukan penyuntikan PMSG secara intramuskuler (im) terhadap rusa perlakuan, yaitu 150 IU dan 300 IU (Fathan 2006). Setelah pencabutan implan CIDR-G, dilakukan pengamatan gejala estrus setiap jam selama tiga hari berturut-turut dari
jam 06.00-18.00 wib. Dalam penelitian ini, intensitas estrus dikategorikan ke dalam tiga kriteria, yaitu: (1) Intensitas rendah (1-6), rusa memperlihatkan enam gejala estrus; (2) Intensitas sedang (1-8), rusa memperlihatkan delapan gejala estrus dan (3) intensitas tinggi (1-10), rusa memperlihatkan semua gejala estrus (Tabel 5). Pengamatan gejala-gejala estrus tersebut sebagai respon sinkronisasi yang diamati selama fase estrus dan muncul secara tidak berurutan.
Tabel 5 Parameter gejala estrus pada rusa betina, dibagi ke dalam tiga kriteria intensitas (rendah, sedang dan tinggi)
No Gejala-gejala estrus Kriteria
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Nafsu makan menurun
Mendekati betina lain (gelisah) Mengeluarkan suara khas Urinasi
Mengintip pejantan (kandang sebelah) Vulva merah, bengkak dan basah
Rendah - - 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Nafsu makan menurun
Mendekati betina lain (gelisah) Mengeluarkan suara khas Urinasi
Mengintip pejantan (kandang sebelah) Vulva merah, bengkak dan basah Lendir transparan
Menaiki betina lain
- Sedang - 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
Nafsu makan menurun
Mendekati betina lain (gelisah) Mengeluarkan suara khas Urinasi
Mengintip pejantan (kandang sebelah) Vulva merah, bengkak dan basah Lendir transparan
Menaiki betina lain
Tidak menolak jika vulva dipegang Diam dinaiki sesama betina lain
- - Tinggi
Pelaksanaan IB
Pelaksanaan IB pada rusa yaitu dengan pengamatan gejala estrus, penentuan waktu IB dan penggunaan bahan dan peralatan IB dan diagnosa kebuntingan. Kegiatan perlakuan IB dengan menerapkan dua cara, yaitu pada 24 jam dan 30 jam setelah onset estrus dengan tujuan memperkirakan waktu
optimum IB untuk memperoleh kebuntingan. Pelaksanaan IB pada rusa percobaan dilakukan tanpa pembiusan dengan penanganan rusa yang dimasukkan dalam kandang jepit (kawin). Rusa betina yang akan di IB digiring satu per satu ke dalam lorong menuju kandang kawin. Waktu pelaksanaan IB dihitung dari mulai muncul estrus sampai 24 jam merupakan perlakuan I (W1) dan pelakuan II (W2) sampai 30 jam (Gambar 8). Setelah keenam ekor rusa di IB, selanjutnya masih diamati tingkah laku estrusnya untuk mengetahui intensitas estrus.
Gambar 8 Jadwal kegiatan pelaksanaan IB 24 jam (n=3) dan 30 jam (n=3) hasil sinkronisasi berdasarkan onset estrus dan diagnosa kebuntingan dengan teknik USG 60 hari dan analisa metabolit hormon progesteron 120 hari setelah IB
Teknik inseminasi yang digunakan, yaitu dengan posisi intraservikal dengan mendeposisikan semen beku pada mulut cervix sampai ke posisi cincin satu. IB dilakukan terhadap enam ekor rusa betina dengan posisi rusa ditunggingkan dan dalam keadaan tenang semen beku motil pasca thawing dideposisikan secara intraservikal dengan bantuan spekulum dan lampu senter. Peralatan tersebut sebelumnya dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol dan spekulum diolesi jeli. Semen beku yang digunakan berasal dari hasil penelitian sebelumnya yang mempunyai motilitas pasca thawing kurang dari 40 % (Nalley et al. 2004). Dosis IB yang dipakai 150 juta sel spermatozoa motil per straw. Sebelum pelaksanaan IB, dilakukan thawing semen beku pada temperatur 37 ºC selama 30 detik. Kemudian straw ditempatkan pada alat IB (gun) yang biasa dilakukan pada IB domba (Minitube, Jerman).
Diagnosa Kebuntingan
Pengamatan estrus terhadap enam ekor rusa betina setelah IB pada siklus berikutnya. Rusa betina yang tidak menunjukkan gejala estrus pada siklus estrus berikutnya diduga bunting. Pada hari ke-60 setelah IB dilakukan pemeriksaan kebuntingan menggunakan alat USG (Aloka SSB 500) (Gambar 9B), dengan metode probe trans abdominal (Gambar 9A). Sebelum di USG keenam ekor rusa tersebut dianastesi (dibius) dengan Xylazine hydrochloride® dan Ketamin® dengan dosis 1 mg/kg berat badan secara intramuskuler (im) menggunakan blow pipe/sumpit (Drajat 2000). Dosis yang dipakai dalam pembiuasan ini adalah Xylazine 2 mg/kg berat badan dan Ketamin 30 mg/kg berat badan. Setelah rusa dibius dan tidak sadar, rusa direbahkan dengan posisi dibaringkan sehingga posisi abdomen berada di atas dan selanjutnya dilakukan pemeriksaan USG (Gambar 9 A dan B).
A B
Gambar 9 (A) Probe yang digunakan diagnosa kebuntingan dengan cara trans abdominal dan (B) Alat USG (Aloka SSB 500)
Cara lain untuk mendukung hasil kebuntingan yang diperiksa dengan USG, yaitu dengan analisa metabolit hormon P4 dari feses rusa umur kebuntingan 120 hari. Sampel feses dikoleksi dari enam ekor rusa sebanyak dua kali pengambilan, yaitu hari kesatu dan ke-10 serta pengambilan dari dua ekor rusa estrus sebagai pembanding level progesteron.
Sebelum analisis P4, dilakukan proses persiapan sampel yang meliputi: (1) Pengeringan dengan dikeringbeku selama tiga hari menggunakan Freeze Dry Machine®, Model 79480, Lab Conco pada temperatur -20 °C, (2) Hasil kering
beku, feses dihaluskan dengan menggunakan pestle, mortar dan saringan untuk memisahkan bubuk dari bahan feses yang berserat dan (3) Ekstrak, yaitu hasil bubuk feses dari masing-masing sampel ditimbang sebanyak 0,050 g dan diekstrak dengan 3 ml MeOH 80 % (Heistermann et al. 1995 dalam Agil 2005). Masukkan 3 ml MeOH + 0.050 g bubuk feses dalam tabung 15 ml, dihomogenkan selama 10 menit dengan 1400 rpm menggunakan vibrax (IKA-Vibrax-VXR). Kemudian langsung disentrifusa selama 15 menit dengan 4000 rpm. Setelah itu, pisahkan cairan supernatan dari endapan. Hasil ekstraksi dari masing-masing sampel, dituangkan ke dalam tabung, disegel dan langsung di simpan pada
temperatur -20°C untuk dianalisa berdasarkan prosedur manual
Immulite/Immulite® 1000 Progesteron (PILKPG-9) (Pabric Dpc 2002) yang dilakukan oleh Laboratorium Klinik Prodia Pusat Jakarta, terakreditasi Certified LLOYD,S REGISTER QUALITY ASSURANCE ISO9001 Quality Management 001. Certificate No.: JKT 0403247.
IMMULITE dan IMMULITE 1000 adalah untuk penggunaan diagnosa secara in vitro. Analisa konsentrasi metabolit hormon progesteron dilakukan dengan menggunaan prosedur pengujian Immulite/Immulite® 1000 Progesteron (kit progesteron ) dimaksudkan untuk pengukuran kadar progesteron dalam feses untuk membantu dalam pendiagnosaan. Nomor katalog: LKPG1 (100 tests), LKPG5 (500 tests). Kode uji: warna PGN violet, Kode pengenal analisa CDC: 4914, Kode pengenal sistem uji CDC: 10159, Kategori komplek CLIA: moderat. Peubah yang Diamati
1. Kriteria hewan percobaan yang terpilih kondisi sehat, siklus estrus normal, tidak bunting, ukuran tubuh proporsional dan kisaran umur dua sampai tiga tahun.
2. Siklus estrus dan gejala estrus alamiah.
3. Onset estrus (jam) dan lama estrus (jam) untuk waktu pelaksanaan inseminasi buatan.
4. Intensitas estrus (jam), yaitu taraf aktivitas tingkah laku estrus yang muncul selama fase estrus berlangsung.
5. Hasil pemeriksaan kebuntingan menggunakan USG 60 hari dan analisa metabolit hormon progesteron 120 hari setelah IB.