Penelitian ini dilakukan di Bagian Teknologi Hasil Ternak, Bagian Ilmu Produksi Ternak Ruminansia Besar Fakultas Peternakan, Laboratorium Biokimia Pangan dan Gizi Fakultas Teknologi Pertanian, Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli sampai dengan Desember 2005.
Materi
Bahan-bahan yang digunakan meliputi bahan utama, bahan tambahan dan bahan untuk analisis kimia. Bahan utama yang digunakan adalah daging sapi bagian paha belakang (knuckle) sebanyak 5,5 kg. Bahan tambahan selain daging yang digunakan adalah bahan-bahan untuk pembuatan produk olahan bakso, sosis, abon, dendeng dan daging panggang. Bahan-bahan untuk analisis laboratorium meliputi bahan untuk analisis protein kasar (K2SO4, HgO, H2SO4, HCl 0,01 M, NaOH,
H3BO3, HCl 0,043664 N), kecernaan protein secara in vitro (HCl 0,1 N, NaOH 0,5
N, larutan buffer fosfat 0,2 M pH 8 ) dan bahan untuk elektroforesis.
Bahan untuk elektroforesis terbagi menjadi tiga bagian yaitu, bahan pembuat gel, buffer elektroforesis, buffer sampel, pewarna dan peluntur. Bahan pembuat gel yang terdiri atas gel pemisah dan gel penahan disajikan pada Tabel 9. Buffer elektroforesis terdiri atas (glisin 192 mM, SDS 0,1%, tris base 24,8 mM), buffer sampel (SDS 1 g, gliserol 50%, bromophenol blue 0,1%, tris HCl 1 M, aquades), larutan pewarna (50% metanol + 10% asam asetat + 0,06% coomassie blue R-250), dan larutan peluntur (5% metanol + 7,5% asam asetat).
Alat yang digunakan meliputi peralatan untuk pengolahan bakso, sosis, abon, dendeng dan daging panggang. Selain itu dipergunakan pula alat-alat analisis laboratorium yang meliputi peralatan analisis kadar protein kasar (labu Kjeldhal 30 ml, pemanas Kjeldhal, alat destilasi, labu Erlenmeyer 125 ml, kondensor), daya cerna protein secara in vitro (labu Erlenmeyer 50 ml, shaker, sentrifuse, kertas Whatman 41, oven) dan alat yang digunakan untuk elektroforesis terdiri atas alat elektroforesis dan penangas air.
Tabel 9. Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan pada Elektroforesis Komposisi Gel Pemisah 10%
Poliakrilamid
Gel Penahan 4% Poliakrilamid Larutan stok akrilamid (30%), 29%
(b/v) akrilamida, 1% (b/v) bis akrilamida 3,3 ml 0,67 ml 1,5 M Buffer Tris-Cl pH 8,8 2,5 ml - 0,5 M Buffer Tris-Cl pH 6,8 - 1,25 ml Akuades 4,11 ml 3,075 ml 10% (b/v) SDS 0,1 ml 0,05 ml 10% (b/v) APS 0,1 ml 0,05 ml TEMED 0,01 ml 0,005 ml Sumber : Laemmli (1970) Prosedur Preparasi Sampel
Daging yang berasal dari ternak sapi diolah menjadi bakso, sosis, dendeng, abon dan daging panggang. Produk olahan dan daging segar dari ternak sapi tersebut kemudian dianalisis mutu dan karakteristik proteinnya.
Pembuatan Bakso (Modifikasi Afrianti, 2002). Daging terlebih dahulu dibersihkan dari bagian lemak dan jaringan ikat, kemudian dipotong-potong menjadi ukuran yang lebih kecil. Persentase bumbu yang digunakan berdasarkan persentase daging segar. Daging dimasukkan ke dalam alat penggilingan (food processor) dengan ditambahkan 3% garam, 15% es batu dan 0,5% STPP, kemudian digiling selama 1,5 menit. Setelah itu ke dalam adonan ditambahkan 30% tepung tapioka, 0,5% merica dan 2,5% bawang putih, dan 15% es batu kemudian digiling kembali selama 1,5 menit. Adonan kemudian dicetak bulat dan direndam dalam air hangat dengan kisaran suhu 60oC-70oC. Proses dilanjutkan dengan perebusan bakso dalam air panas yang bersuhu 80oC selama 5 menit. Bakso yang telah mengapung diangkat dan ditiriskan.
Pembuatan Sosis (Modifikasi Ridwanto, 2003). Lemak dan jaringan ikat pada daging dihilangkan. Daging yang telah siap kemudian dimasukkan ke dalam alat penggiling (food processor) dan ditambahkan 3% garam, 8% susu skim dan 1/3 bagian es batu, kemudian digiling selama 1,5 menit. Adonan ditambah 10% minyak,
1,5% bawang putih yang telah dipotong-potong kecil, 1% merica, 0,5% pala dan 1/3 bagian es batu, kemudian digiling kembali selama 1,5 menit.
Adonan ditambah 12% tepung tapioka dan 1/3 bagian es batu (total es batu yang ditambahkan adalah 35%), kemudian digiling kembali selama 2 menit. Persentase bahan tambahan dihitung dari berat daging. Adonan kemudian dimasukkan ke dalam selongsong sosis (casing) dengan menggunakan stuffer. Sosis yang telah dimasukkan ke dalam selongsong dikukus selama 45 menit dengan suhu 65oC.
Pembuatan Dendeng Giling (Modifikasi Nuraini, 2002). Daging segar dihilangkan dari lemak dan jaringan ikatnya terlebih dahulu, kemudian digiling dengan menggunakan alat penggiling (Food Processor) selama 30 detik. Sejumlah bumbu yang terdiri atas 3% garam, 30% gula merah, 1% asam jawa, 2,5% ketumbar, 10,9% laos, 2,5% bawang merah, 0,2% merica, 0,1% jinten dan 2,5% bawang putih dihaluskan terlebih dahulu. Gula merah 30% dan 1% asam jawa dilarutkan dalam air sebagai bumbu perendam.
Bumbu yang telah dihaluskan kemudian dicampur dengan larutan gula merah dan asam jawa. Persentase bumbu perendam dihitung dari berat daging. Campuran bumbu dituangkan pada daging yang telah digiling, diaduk rata dan disimpan pada pendingin (refrigerator) selama 24 jam. Daging dicetak pada loyang yang telah dilapisi dengan plastic high dencity poly ethylene (HDPE) dengan ketebalan daging 6 mm. Daging kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 70oC selama 7 jam. Sebelum dianalisis, dendeng digoreng pada suhu 120oC selama 2 menit hingga matang.
Pembuatan Abon (Modifikasi Rahmat, 2002). Daging dibersihkan dari lemak dan dikukus selama 1 jam, kemudian disuir-suir dengan menggunakan garpu dan digiling dengan menggunakan alat penggilingan (food processor). Bumbu yang terdiri atas 5% bawang merah, 2,5% bawang putih, 7% gula pasir, 25% santan, 1% garam, 0,2% merica dihaluskan yang kemudian ditambahkan 10% air jeruk nipis. Persentase bumbu yang digunakan berdasarkan berat daging.
Daging yang telah halus kemudian dimasak dengan semua bumbu yang telah dihaluskan sambil diaduk-aduk hingga bumbu meresap. Daging diangkat dan
ditiriskan, kemudian digoreng dengan minyak sebanyak 450 ml selama 15 menit dengan api kecil (suhu 150oC). Abon diangkat dan dipres dengan alat pengepres. Pengurangan kadar minyak dan air dapat dilakukan dengan cara pengeringan menggunakan oven selama 15 menit pada suhu 130oC.
Pembuatan Daging Panggang (Saji, 2005). Daging terlebih dahulu dibersihkan dari lemak kemudian dipotong-potong bentuk dadu dengan ukuran yang relatif sama. Daging yang telah dipotong-potong kemudian digarami (curing) sebanyak 2,567% garam selama 15 menit. Persentase bumbu yang digunakan berdasarkan berat daging. Sebanyak 1,4% garam, 11,6% bawang merah, 4,3% bawang putih, 0,5% ketumbar, 0,7% kunyit, 0,7% jahe, dan 4,3% kemiri dihaluskan kemudian, 0,026% lengkuas dan 0,003% serai dimemarkan. Daging dimasak bersama dengan bumbu yang telah dihaluskan lengkap dengan lengkuas dan serai yang telah dimemarkan kemudian dicampurkan dengan 0,054% kecap manis, 4,2% gula merah, 0,001% gula pasir dan 0,003% asam jawa (yang telah dicampur dengan 1 sendok makan air) hingga bumbu meresap. Ditambahkan 0,833% ml air kelapa dan dimasak kembali. Daging dipanggang di dalam oven listrik dengan suhu 120oC selama 10 menit.
Peubah yang Diamati
Protein Kasar (metode Kjeldahl-Mikro) (Apriyantono et al., 1988). Sampel ditimbang sebanyak 0,05-0,1 g, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 30 ml. Ditambahkan katalis (1,9 + 0,1 g K2SO4, 40 + 10 mg HgO dan 2,0 + 0,1 ml H2SO4)
dan 3-10 ml HCl 0,01 N atau 0,02 N, kemudian dididihkan di dalam pemanas Kjeldahl lengkap yang dihubungkan dengan penghisap uap melalui aspirator sampai cairan menjadi jernih. Labu didinginkan dan isinya dipindahkan ke dalam alat destilasi. Labu dicuci dan dibilas 5-6 kali dengan 1-2 ml air dan air hasil pencucian ini dipindahkan ke dalam alat destilasi, kemudian ditambahkan 2-3 ml NaOH.
Labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 2-4 tetes
indikator (campuran 2 bagian metil merah 0,2% dalam alkohol dan 1 bagian metilen blue 0,2% dalam alkohol) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam di bawah larutan H3BO3. Larutan NaOH sebanyak 2-3 ml
ditambahkan, kemudian dilakukan destilasi sampai tertampung 50 ml larutan destilat (berwarna hijau) di dalam labu Erlenmeyer.
Tabung kondensor dibilas dengan air dan air bilasannya ditampung di dalam Erlenmeyer yang sama. Dilakukan titrasi dengan HCl 0,043664 N (0,382%) sampai terjadi perubahan warna menjadi ungu (warna semula) dan dilakukan penetapan blanko. Perhitungan kadar protein kasar dan protein sisa dilakukan dengan rumus: (a-b) x 0,014 x N HCl x c x 100
bobot sampel Keterangan: a = ml titer
b = ml blanko
c = faktor konversi daging
Kecernaan Protein secara In Vitro (Saunders et al., 1973). Pengukuran kecernaan protein secara in vitro dilakukan dengan menggunakan sampel sebanyak 1-2 g. Sampel dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 50 ml, ditambahkan 15 ml HCl 0,1 N yang mengandung 1,5 mg enzim pepsin dan dikocok pada shaker water-bath dengan kecepatan rendah dan suhu 37oC selama 3 jam. Larutan dinetralkan (pH 7) dengan NaOH 0,5 N dan ditambahkan 4 mg enzim pankreatin di dalam 7,5 ml larutan buffer fosfat 0,2 M dengan pH 8 yang mengandung natrium azida 0,005 M.
Larutan yang diperoleh dikocok pada shaker water-bath kembali dengan kecepatan rendah dan suhu 37oC selama 24 jam. Padatan yang diperoleh dari akhir penyaringan disaring dengan kertas saring Whatman 41 (sebelumnya bobot kertas saring sudah dicatat). Padatan beserta kertas Whatman dikeringkan dalam oven 105oC selama 2 jam kemudian ditimbang, dan dilanjutkan dengan menganalisis kandungan nitrogennya dengan menggunakan metode Kjeldahl-Mikro. Perhitungan daya cerna protein dilakukan dengan rumus:
Protein Kasar - Protein Sisa x 100% Protein Kasar
Elektroforesis (Laemmli, 1970). Tahapan elektroforesis terdiri atas preparasi sampel, pembuatan gel, penetasan sampel, proses pemisahan protein, pewarnaan, pencucian, interprestasi hasil. Sampel ditimbang masing-masing sebanyak 1 g dan dihaluskan. Buffer fosfat 0,1 M sebanyak 5 ml ditambahkan ke dalamnya, lalu disentrifuse. Kemudian diambil supernatan dari hasil sentrifuse sebanyak 1 ml. Supernatan tersebut kemudian dilarutkan dalam 1 ml larutan buffer tris dan % N =
dipanaskan dalam air mendidih sebanyak 1 menit. Cetakan gel berupa dua lempeng kaca berukuran 7,25x10,25 cm dan 8,25x10,25 cm dihimpitkan dan diantaranya diletakkan pemisah (spacer). Bahan untuk gel pemisah (separating gel) dan gel penahan (stacking gel) dibuat dari komposisi seperti pada Tabel 9. Sebanyak 1,5 ml larutan gel pemisah ditambahkan 3µl TEMED, diaduk rata dan dipipetkan pada bagian dasar kaca pencetak gel yang telah dipasang diatas lempeng kaca membentuk garis lurus. Setelah larutan mengeras sisa larutan gel pemisah ditambah 5µl atau 10µl TEMED dan dipipetkan perlahan-perlahan kedalam cetakan dan dijaga agar tidak berbentuk gelembung udara. Aquades dipipet untuk membentuk tepi gel yang rata dan untuk membasahi gel agar tidak kering. Pemasukan gel kedalam cetakan harus dilakukan secepat mungkin karena adanya TEMED gel akan cepat mengeras. Setelah gel pemisah membeku, aquades, diserap dengan kertas dan larutan gel penahan dimasukkan hingga batas atas cetakan, sisir pencetak sumur segera dimasukkan dan gel dibiarkan terpolimerisasi sempurna.
Gel yang telah terpolarisasi sempurna dapat langsung digunakan. Sisir dan klip dilepaskan, kemudian gel dipasang, buffer elektroforesis dimasukkan dan alat elektroforesis dirangkai. Sebelum dimasukkan ke dalam sumur, marker dan sampel ditambahkan buffer sampel (1:1) diinkubasi pada penangas air mendidih selama 1 menit. Volume sampel yang dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 20 µl tergantung tebal tipisnya pita protein yang diinginkan. Elektroforesis (SDS PAGE) dijalankan pada tegangan 100 V dan arus listrik 125 mA selama 1–1,5 jam hingga bromphenol blue mencapai 1 cm dari bawah gel. Gel yang telah terbentuk dicelupkan dalam larutan pewarna, kemudian dimasukkan ke dalam shaker selama 24 jam. Kelebihan warna dibuang dengan merendam gel dalam larutan peluntur sampai diperoleh pita- pita protein yang berwarna biru dengan latar belakang jernih. Silver staining dilanjutkan bila pita pada gel tidak tampak jelas. Metode silver staining dapat dilihat pada Lampiran 1.
Interpretasi Data
Hasilelektroforesisdilihat dari grafik yang dihasilkan berdasarkan markernya seperti terlihat pada Gambar 1. Nilai yang dihasilkan, yaitu Rf (hasil pembagian jarak pita dan jarak running) dan logaritma berat molekul marker (kD), ditransformasikan dalam bentuk persamaan regresi linier Y = ax + b.
Y adalah logaritma berat molekul marker dan x adalah Rf. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap pola searah dengan satu faktor perlakuan yaitu berbagai proses pengolahan. Perlakuan yang dilakukan yaitu pembuatan produk olahan bakso (T1), sosis (T2), dendeng (T3),
abon (T4), daging panggang (T5) dengan (T0) adalah daging segar. Masing-masing
perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Pengujian peubah dilakukan dengan cara komposit yaitu dengan mengambil 1/3 bagian dari setiap ulangan sampel kemudian dicampur. Sampel hasil komposit diaduk rata kemudian diambil sampel untuk dianalisa sesuai peubah yang diamati. Interpretasi data dilakukan secara deskriptif.
Gambar 1. Kurva Standar Berat Molekul Rendah (Low Molecular Weight)
y = a x + b
R f L o g