Penelitian ini dilakukan dari bulan September-Oktober 2008. Tempat penelitian dilakukan di Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, pipet ukuran 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; botol media, gunting, pinset,
jarum inokulasi (ose), stomacher, pembakar Bunsen, pH meter, timbangan,
magnetic stirrer, pengocok tabung (vortex), inkubator, penangas air,
autoklaf, lemari sucihama (clean bench), lemari pendingin (refrigerator),
freezer.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah lactose broth (LB, Oxoid,
England);selenite cystine broth (SCB, Oxoid, England);tetrathionate broth (TTB, Oxoid, England);rappaport vassiliadis (RV, Oxoid, England);xylose lysine deoxycholate agar (XLDA, Oxoid, England); hektoen enteric agar (HEA, Oxoid, England);bismuth sulfite agar (BSA, Oxoid, England),triplesugar iron agar (TSIA, Oxoid, England);lysine iron agar (LIA, Oxoid, England); brain
heart infusion broth (BHIB, Oxoid, England); lysine decarboxylase broth (LDB, Oxoid, England);kalium cyanida broth (KCNB, Oxoid, England);methyl red- voges-proskauer (MR-VP,Oxoid, England);tryticase soy tryptose broth (TSTB, Oxoid, England);sulphide indol motility (SIM, Oxoid, England);reagen kovac (Oxoid, England);urea broth (Oxoid, England);malonate broth (Oxoid, England);phenol red (Oxoid, England );phenol red sucrose broth (Oxoid, England); dulcitol broth (Oxoid, England); phenol red lactose broth (Oxoid, England);simmon’s citrate agar (SCA, Oxoid, England); kristal keratin;larutan
bromcresol purple dye 0,2%; larutan physiological saline 0,85%; PBS pH 7,4,
larutan formalinized physiological saline; Salmonella polyvalent somatic (O)
antiserum A-S (Oxoid, England);Salmonella polyvalent flagellar (H) antiserum fase 1 dan 2 (Oxoid, England);Salmonella somatic grup (O) monovalent antisera : Vi (Oxoid, England, Isolat murni S. Enteritidis dari Institut Pertanian Bogor.
Metode Pengujian
Ada dua macam metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu uji
kualitatif sesuai dengan Metode SNI yang diacu dari Isolation and Enumeration
dalam Bacteriological Analytical Manual, Food and Drug Administration. AOAC
International (BAM 2001); dan yang kedua adalah Salmonella latex test.
Pengujian Salmonella spp. dengan Metode SNI
Metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini adalah uji kualitatif diambil dari Metode Standar Nasional Indonesia yang mengacu pada
Bacteriological Analytical Manual, Food and Drug Administration, AOAC International (BAM 2001). Setiap proses pengujian selalu disertai dengan kontrol positif dan negatif.
Pra-pengayaan
Kotak pengangkutan DOC dengan luas 10 x 10 cm2 di-swab menggunakan
swab sucihama yang sebelumnya telah dibasahi dengan PBS pH 7,4. Swab-swab
tersebut dipindahkan ke dalam Erlenmeyer atau wadah sucihama yang berisi
lactose broth. Kemudian diinkubasikan pada suhu 35 0C selama 24 jam ± 2 jam.
Pengayaan
Biakan pra-pengayaan diaduk secara perlahan kemudian diambil, dipindahkan masing-masing 1 ml ke dalam 10 ml media TTB, dan 0,1 ml ke
dalam 10 ml media RV. Untuk contoh dengan dugaan cemaran Salmonella spp.
tinggi (high microbial load), maka media RV diinkubasikan pada suhu 42 0C ±
0,2 0C selama 24 jam ± 2 jam, sedangkan untuk media TTB diinkubasi pada suhu
43 0C ± 0,2 0C selama 24 jam ± 2 jam. Untuk contoh dengan dugaan cemaran
Salmonella spp. rendah (low microbial load), maka media RV diinkubasikan pada
suhu 42 0C ± 0,2 0C selama 24 jam ± 2 jam, sedangkan untuk media TTB
diinkubasi pada suhu 35 0C ± 2 0C selama 24 jam ± 2 jam.
Sebanyak dua atau lebih biakan bakteri diambil dengan jarum öse dari masing- masing media pengayaan yang telah diinkubasikan, dan diinokulasikan pada media HE, XLD dan BSA. Selanjutnya media-media tersebut diinkubasi pada
suhu 35 0C selama 24 jam ± 2 jam. Bila masa inkubasi telah tercapai dan koloni
yang tumbuh di Media BSA belum jelas, maka inkubasi dilanjutkan lagi selama
24 jam ± 2 jam. Pengamatan dilakukan terhadap koloni Salmonella pada media
HE, yakni koloni yang terlihat berwarna hijau kebiruan dengan atau tanpa titik hitam (H2S). Pada media XLD pengamatan diarahkan kepada koloni yang terlihat merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni hitam. Pada media BSA pengamatan diarahkan kepada koloni yang terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam.
Tahap selanjutnya adalah mengambil koloni yang diduga Salmonella dari
ketiga media tersebut dan diinokulasikan ke media TSIA dan LIA. Inokulasi dilakukan dengan cara menusukkan jarum inokulasi ke dasar media agar dan selanjutnya digores pada bagian miring agar. Kedua media diinkubasi pada suhu
35 0C selama 24 jam ± 2 jam. Setelah masa inkubasi tercapai, dilakukan
pengamatan terhadap koloni yang mengarah kepada koloni Salmonella dengan
menggunakan hasil reaksi seperti yang tercantum pada Tabel 4.
Tabel 4 Hasil uji Samonella spp. pada TSIA dan LIA
Media Bagian Miring Agar (Slant) Bagian Dasar Agar (Buttom) H2S Gas TSIA Alkalin / K (merah) Asam / A (kuning) Positif (hitam) Negatif/ positif LIA Alkalin / K (ungu) Alkalin / K (ungu) Positif (hitam) Negatif/ positif Uji Biokimiawi - Uji Urease
Koloni yang positif Salmonella dari TSIA diinokulasikan dengan öse
ke urea broth. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 35 0C selama 24 jam ± 2 jam. Hasil uji positif ditandai dengan perubahan warna kuning menjadi
merah. Hasil uji negatif ditandai dengan tidak adanya perubahan warna. Hasil uji khas Salmonella adalah negatif uji urease.
- Uji Indole
Koloni dari media TSIA yang menunjukkan reaksi positif Salmonella,
diinokulasikan pada SIM dan diinkubasi pada suhu 35 0C selama 24 ± 2 jam.
Sebanyak 0,2-0,3 ml Reagen Kovacs ditambahkan ke atas permukaan media
setelah masa inkubasi tercapai. Hasil uji positif ditandai dengan adanya cincin merah di permukaan media. Hasil uji negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning. Hasil uji khas Salmonella adalah negatif uji
Indole.
- Uji Voges-Proskauer (VP)
Biakan dari media TSIA yang menunjukkan reaksi positif Salmonella,
diambil dengan öse lalu diinokulasi ke tabung yang berisi 10 ml media MR-
VP dan diinkubasi pada suhu 35 0C selama 48 ± 2 jam. Sebanyak lima
mililiter MR-VP dipindahkan ke tabung reaksi dan larutan α-naphthol
sebanyak 0,6 ml dan 0,2 ml KOH 40% ditambahkan ke dalamnya setelah masa inkubasi tercapai. Tabung digoyang sampai tercampur merata dan didiamkan. Untuk mempercepat reaksi ditambahkan kristal kreatin. Hasil dibaca setelah empat jam. Hasil uji positif apabila warna larutan berubah menjadi berwarna merah jambu sampai merah delima. Umumnya
Salmonella memberikan hasil negatif untuk uji VP (tidak terjadi perubahan warna pada media).
- Uji Merah Metil (Methyl Red, MR)
Sebanyak 5 ml media MR-VP, yaitu setengah bagian dari pengujian VP digunakan untuk uji MR. Sebanyak 5-6 tetes indikator merah metil ditambahkan ke dalam larutan setelah masa inkubasi tercapai. Hasil uji positif ditandai dengan adanya difusi warna merah kedalam media. Hasil uji
negatif ditandai dengan terjadinya warna kuning pada media. Umumnya
Salmonella memberikan hasil positif untuk uji MR.
- Uji Sitrat
Koloni dari TSIA yang menunjukkan reaksi positif Salmonella,
diinokulasikan ke dalam SCA dengan öse. Kemudian diinkubasi pada suhu
35 0C selama 96 jam ± 2 jam. Hasil uji positif ditandai adanya pertumbuhan koloni yang diikuti perubahan warna dari hijau menjadi biru.Hasil uji negatif ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan koloni atau tumbuh
sangat sedikit dan tidak terjadi perubahan warna.Umumnya Salmonella
memberikan hasil positif pada uji sitrat.
- Uji Lysine Decarboxylase Broth (LDB)
Sebanyak satu öse koloni dari TSIA yang menunjukkan reaksi positif
Salmonella, diambil dan diinokulasikan k edalam LDB. Kemudian
diinkubasi pada suhu 35 0C selama 48 ± 2 jam dan diamati setiap 24 jam.
Salmonella memberikan reaksi positif yang ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada seluruh media dan hasil reaksi negatif memberikan warna kuning. Jika hasil reaksi meragukan (bukan ungu atau bukan kuning), maka
ke dalam media ditambahkan beberapa tetes 0,2 % bromcresol purple dye
dan diamati perubahan warnanya.
- Uji Potasium Sianida (KCN)
Sebanyak satu öse biakan dari TSIA yang menunjukkan reaksi positif
Salmonella, diinokulasikan ke media TB dan diinkubasi pada suhu 35 0C
selama 24 ± 2 jam. Sebanyak satu öse koloni dari TB diambil dan
diinokulasikan ke dalam KCNB. Inkubasi pada suhu 35 0C selama 48 ± 2
jam. Hasil uji positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan koloni yang ditandai dengan terjadinya kekeruhan. Hasil uji negatif ditunjukkan dengan
tidak adanya pertumbuhan pada media. Umumnya Salmonella memberikan
hasil negatif untuk uji KCN.
a) Phenol Red Dulcitol Broth atau Purple Broth Base dengan 0,5% Dulcitol
Koloni dari TSIA yang menunjukkan reaksi positif Salmonella,
diambil dan inokulasikan pada médium dulcitol broth. Kemudian
diinkubasi pada suhu 35 0C dan diamati setiap 24 jam selama 48 jam ± 2
jam.Reaksi positif oleh Salmonella ditandai dengan pembentukan gas
dalam tabung Durham dan warna kuning (pH asam) pada media.Reaksi
negatif oleh Salmonella ditandai dengan tidak terbentuknya gas pada
tabung Durham dan pada media terbentuk warna merah (pH basa) untuk
indikator phenol red atau ungu untuk indikator bromcresol purple.
b) Uji Malonate Broth
Sebanyak satu öse dari TB dipindahkan ke dalam malonate broth.
Kemudian diinkubasi pada suhu 35 0C dan diamati setiap 24 jam selama
48 jam ± 2 jam. Hasil uji positif ditunjukkan dengan adanya perubahan
warna menjadi biru. Reaksi negatif Salmonella yang ditandai dengan
adanya warna hijau atau tidak ada perubahan warna.
c) Uji Phenol Red Lactose Broth
Koloni dari TSIA yang menunjukkan reaksi positif Salmonella,
diinokulasikan ke dalam phenol red lactose broth. Kemudian diinkubasi
pada suhu 35 0C dan diamati setiap 24 jam selama 48 jam ± 2 jam. Hasil
reaksi positif ditandai dengan dihasilkannya asam (warna kuning) dengan atau tanpa gas.Hasil reaksi negatif Salmonella ditandai dengan tidak ada perubahan warna dan pembentukan gas.
d) Uji Phenol Red Sucrose Broth
Koloni dari TSIA yang menunjukkan reaksi positif Salmonella,
diinokulasikan ke dalam phenol red sucrose broth. Kemudian diinkubasi
pada suhu 35 0C selama 48 jam ± 2 jam dan diamati setiap 24 jam. Hasil
uji positif ditandai dengan adanya asam yang disertai perubahan warna (kuning) dan dengan atau tanpa pembentukan gas. Hasil uji negatif
Salmonella ditandai dengan tidak ada perubahan warna dan pembentukan gas.
Uji Serologik
- Uji Polyvalent Somatik (O)
Sebanyak satu öse koloni dari TSIA atau LIA yang menunjukkan
reaksi positif Salmonella, diletakkan pada gelas obyek dan ditetesi satu tetes larutan garam fisiologis (NaCl 0,85%) sucihama dan diratakan
dengan biakan Salmonella spp.. Sebanyak satu tetes antiserum Salmonella
polyvalent somatic (O) diberikan di samping suspensi koloni. Suspensi koloni dicampur ke antiserum sampai tercampur sempurna. Gelas objek dimiringkan ke kiri dan ke kanan dengan latar belakang gelap sambil
diamati adanya reaksi aglutinasi. Kontrol negatif dibuatdengan
mencampur hanya larutan garam fisiologis dan antiserum.
- Uji Polyvalent Flagelar (H)
Koloni dari TSIA yang memberikan hasil uji urease negatif
diinokulasikan ke dalam BHIB dan diinkubasi pada suhu 35 0C selama 4-6
jam atau ke dalam TSTB dan inkubasi pada suhu 35 0C selama 24 ± 2 jam.
Sebanyak 2,5 ml larutan garam fisiologis berformalin (formalinized
physiological saline) ditambahkan ke dalam lima mililiter dari salah satu
biakan di atas. Sebanyak 0,5 ml larutan antisera Salmonella Polyvalent
flagellar (H) diambil dengan menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam tabung serologik ukuran 10 x 75 mm. Kemudian ditambahkan 0,5 ml antigen yang akan di uji. Larutan garam fisiologis kontrol disiapkan dengan mencampurkan 0,5 ml larutan garam fisiologis berformalin dengan
0,5 ml antigen berformalin (formalinized antigen). Kemudian diinkubasi
kedua campuran tersebut dalam penangas air pada suhu 48-50 0C.
Pengamatan dilakukan terhadap ada-tidaknya penggumpalan setiap 15 menit selama satu jam. Hasil uji yang positif ditandai dengan adanya penggumpalan, sedangkan pada kontrol tidak terjadi penggumpalan.
Interpretasi Hasil Salmonella spp.
Interpretasi hasil uji biokimiawi Salmonella spp. terpapar pada Tabel 5.
Tabel 5 Reaksi biokimiawi Salmonella
No Uji substrat
Hasil reaksi
Positif Negatif Salmonella
1 Glucose (TSI) Bagian dasar agar kuning Bagian dasar agar
merah +
2 Lysine decarboxylase
(LIA)
Bagian dasar agar ungu Bagian dasar agar
kuning +
3 H2S (TSI dan LIA) Hitam Tidak hitam
+ 4 Lysine decarboxylase
broth
Warna ungu Warna kuning
+ 5 Phenol red dulcitol broth Warna kuning dan atau
dengan gas
Tanpa berubah warna dan tanpa terbentuk gas
+a)
6 KCN broth Ada pertumbuhan Tidak ada
pertumbuhan -
7 Malonat broth Warna biru Tidak berubah warna -b
8 Uji Urease Warna merah Tidak berubah warna + 9 Uji Indole Permukaan warna merah Permukaan warna
kuning -
10 Uji polyvalent flagelar Aglutinasi Tidak aglutinasi + 11 Uji polyvalent somatik Aglutinasi Tidak aglutinasi + 12 Phenol red lactosebroth Warna kuning
dengan/tanpa gas
Tidak terbentuk gas dan tidak berubah warna
-b) 13 Phenol red sucrosebroth Warna kuning
dengan/tanpa gas
Tidak terbentuk gas dan tidak berubah warna
- 14 Uji voges-proskauer pink sampai merah Tidak berubah warna - 15 Uji methyl red Merah menyebar Warna kuning
menyebar +
16 Simmon’s sitrat Pertumbuhan warna biru Tidak ada per- tumbuhan dan tidak ada perubahan
- Keterangan :
a
) Mayoritas dari pembiakan S.arizonae adalah negatif
b)
Mayoritas dari pembiakan S.arizonae adalah positif
Sumber : BAM (2001)
Pengujian Salmonella spp. dengan Salmonella Latex Test
Contoh dibiakkan melalui teknik pra-pengayaan dan pengayaan sebelum
diuji menggunakan Salmonella latex test kit. Reagen latex dibawa ke suhu ruangan yaitu berkisar ± 27 0C. Sebanyak satu tetes larutan NaCl fisiologis 0,85% yang terdapat pada kit, dimasukkan ke dalam satu lingkaran tes dalam kartu reaksi. Hal yang sama juga dilakukan untuk kontrol positif dan negatif. Isolat
Salmonella spp. dari media Blood Agar diambil dan dilarutkan dalam larutan
NaCl fisiologis 0,85% di kartu reaksi. Kemudian reagen latex diteteskan
disamping suspensi tersebut. Kedua larutan dicampurkan dan kartu uji digoyang- goyang dengan gerakan melingkar selama dua menit. Dilakukan pengamatan ada- tidaknya reaksi aglutinasi
Reaksi dinyatakan positif jika terjadi aglutinasi dalam waktu dua menit dan tidak
terjadi aglutinasi dalam waktu dua menit pada kontrol latex (Anonimus 2007).
Rancangan Penelitian
Contoh yang diperiksa adalah kotak pengangkutan DOC yang
dilalulintaskan melalui Bandara Internasional Soekarno-Hatta. Pengambilan
contoh dilakukan dengan metode acak berkelompok (cluster random sampling).
Jumlah contoh diambil secara proporsional sebanyak 50 kotak yang berasal dari lima perusahaan pembibitan yang berbeda dan 50 kotak yang dicemari
S. Enteritidis sebagai kontrol positif. Dari kelima perusahaan pembibitan tersebut diambil masing-masing 10 contoh. Contoh diambil dari dinding bagian dalam dan
bagian bawah kotak pengangkutan DOC pada luasan 10 x 10 cm2 menggunaan
gauze swab yang telah dibasahi phosphat buffer saline (PBS) pH 7,4. Kapas
tersebut kemudian dimasukkan ke sebuah tabung Erlenmeyer berisi 100 ml
lactose broth dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 42 0C (Wray dan Davies 1994).
Terhadap kotak-kotak yang menunjukkan hasil positif adanya cemaran
Salmonella spp., selanjutnya dilakukan pemeriksaan identifikasi Salmonella spp.
dan keragaman spesies Salmonella yang ada.
Analisis Data
Data yang diperoleh akan dianalisis secaradeskriptif, yaitu mengumpulkan,
menyederhanakan dan menyajikan data sehingga bisa memberikan informasi dalam bentuk tabel dan gambar (Montgomery 2001) dan dilakukan analisis statistik kappa untuk kesesuaian dua pengujian (Thrusfield 2005).