MATERI DAN METODE

Waktu dan Lokasi Penelitian

Pengambilan data fenotipe dan contoh darah di Uluwatu, Ubud, dan Pusat Studi Satwa Primata-Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (PSSP-LPPM, IPB), dilakukan pada bulan Juni sampai dengan Desember tahun 2007. Pengambilan contoh darah dan data fenotipe di Alas Purwo dan Taman Nasional Baluran (Jawa Timur) dilakukan tahun 2005. Analisis laboratorium dilakukan di Laboratorium Biologi dan Reproduksi, PSSP-LPPM, IPB, Bogor dan Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB Bogor mulai Agustus 2007 sampai Agustus 2008. Pengurutan produk PCR menggunakan jasa Macrogen, Korea.

Materi Monyet Ekor Panjang

Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) jantan dewasa sebanyak 56 ekor (Tabel 1). Monyet ekor panjang jantan tidak terpengaruh oleh siklus kebuntingan sehingga bobot badan dan data fenotipe obesitas tidak dipengaruhi oleh siklus tersebut. Umur ditentukan berdasarkan gigi geligi yaitu: a) muda/remaja dengan ciri taring permanen dan molar permanen ke tiga belum tumbuh dan rambut sudah kecoklatan; b) pra dewasadengan ciri gigi geligi sudah permanen tetapi molar ke

tiga belum tumbuh dan rambut kecoklatan; dan c) dewasadengan ciri gigi taring

sudah panjang (pada jantan) dan molar permanen berjumlah 12 buah dan rambut kecoklatan.

Tabel 1 Jumlah monyet ekor panjang jantan yang digunakan dalam penelitian ini

Pulau/Kawasan Asal Kode Jumlah

Bali Ubud

Uluwatu UW ^UB ¹³11

Jawa Timur Alas Purwo

Baluran ^APBL 10 ⁷

Sumatera Palembang* Pal 15

Jumlah 56

*Sampel asal Palembang diambil di PSSP-IPB

Monyet ekor panjang tersebut berasal dari Bali (Uluwatu, dan Ubud), Jawa Timur (Alas Purwo dan Taman Nasional Baluran) dan Sumatera (Palembang).

Sampel asal Palembang diambil di PSSP-LPPM, IPB. Lokasi asal populasi monyet yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 8.

Gambar 8 Peta lokasi asal monyet ekor panjang yang digunakan dalam penelitian

Bahan dan Alat Pengambilan Sampel Darah dan Data Fenotipe

Pengambilan sampel darah monyet menggunakan bahan-bahan yaitu: alkohol 70%, EDTA (ethylene diamine tetraacetic), ketamin, xylazine dan kapas, sedangkan alat yang digunakan adalah tulup, pistol, spuit, tabung vacutainer, spidol permanen, kotak pendingin, dan lemari pendingin (freezer).

Alat yang digunakan untuk mendapatkan data fenotipe adalah pita ukur (skala terkecil 1 mm), timbangan (skala terkecil 0.1 kg), kaliper (skala terkecil 1 mm), alat tulis dan kertas.

Bahan dan Alat Isolasi DNA

Bahan yang digunakan dalam isolasi DNA dari darah adalah etanol absolut, larutan penyangga AW1, AW2, AL dan AE, proteinase K (produk Qiagen), sedangkan alat yang digunakan adalah mikro pipet beserta ujung

50 0 50 Kilometers Baluran Alas Purwo Ubud Uluwatu ^U 50 0 50 Km

pipetnya dengan ukuran 20, 200, dan 1000 µl, tabung 1.5 ml, QIAamp spin coloum,water bath, alat mikrosentrifugasi, termometer, rak dan vorteks.

Bahan dan Alat Analisis PCR

Bahan yang digunakan untuk PCR adalah ddH2O, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), primer (forward dan reverse), larutan penyangga 10X, Taq polimerase (Invitrogen), MgCl2, DNA, dan alkohol 70%. Alat yang digunakan adalah pipet beserta ujung pipetnya ukuran 10, 20, 200 µl, rak, tabung PCR 200 µl, tabung 1.5 ml, tisu, rak pendingin sampel, alat mikrosentrifugasi (Eppendorf) tipe 5415C, penstabil voltase (Voltage Stabilizer Ferro Resonant 1500 ICA) dan

mesin PCR (Gene Amp PCR System 2400, Perkin Elmer).

Bahan dan Alat Elektroforesis

Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah agarosa, loading dye, penanda 100 pb, TBE 1X (1M Tris, 0.9 M Asam Borat dan 0.01 M EDTA pH 8.0) dan etidium bromida. Peralatan yang digunakan untuk elektroforesis adalah ujung pipet T-300 (axygen), mikropipet 10 P (Gilson), gelas ukur, timbangan

elektronik (AD HX 100), pengaduk bermagnet (magnetic stirrer MG78), pemanas

litrik, piranti Submarime Electrophoresis (Hoeffer USA), power supply

electrophoresis, alat foto UVi dan disket ukuran 3.5 inci.

Metode Pengambilan Darah dan Data Fenotipe

Monyet dibius dengan campuran ketamin (10 mg/kg bobot badan) dan xylazine (2 mg/kg bobot badan). Obat bius disuntikkan secara intramuskuler dengan alat bantu berupa tulup atau senapan. Darah diambil dengan spuit dari vena femoralis sebanyak 5 ml dan selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung

yang mengandung EDTA. Darah ini disimpan pada suhu -20oC yang selanjutnya

diekstrak untuk mendapatkan DNA. Tata cara pengambilan darah mengikuti prosedur yang telah disetujui Komisi Pengawasan Kesejahteraan dan Penggunaan Hewan Penelitian PSSP-IPB (ACUC No. 07-A004-IR).

Fenotipe obesitas yang diukur adalah bobot badan, tinggi duduk, tebal lipatan kulit (di daerah perut, lengan, paha, leher dan punggung) serta lingkar pinggang, dada, paha, dan lengan. Tinggi duduk (crown rump length/CRL) diukur dari bagian atas kepala (vertex) sampai pangkal ekor (Kaufman et al. 2005). IMT dihitung dari bobot badan (kg) dibagi tinggi-duduk kuadrat (m2)

(Angeloni et al. 2004; Kaufman et al. 2005). Monyet digolongkan gemuk (mengalami obesitas) bila IMT lebih besar atau sama dengan 30 kg/m2 (WHO 2005; Kaufman et al. 2005). Lokasi pengukuran lipatan kulit perut, lengan, paha, leher dan punggung masing-masing adalah pusar, trisep, pangkal paha (selangkangan), leher bagian dorsal, dan lumbal. Tebal lipatan kulit diukur dengan skinfold lange caliper. Lingkar pinggang, dada, paha dan lengan atas (trisep) diukur dengan pita ukur. Lingkar pinggang, dada, paha dan lengan masing-masing diukur di daerah umbilikus, penonjolan bagian kaudal dari tulang sternum, pangkal paha, dan trisep (Gambar 9). Alat yang digunakan adalah timbangan (skala terkecil 0.1 kg), pita ukur dan kaliper (skala terkecil 1 mm).

Gambar 9 Lokasi pengukuran lingkar bagian tubuh dan tebal lipatan kulit

Keterangan : (1) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit pada bagian leher dorsal, (2) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit punggung, (3) lokasi pengukuran lingkar paha, (4) lokasi pengukuran lingkar lengan atas, (5) lokasi pengukuran lingkar pinggang, (6) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit trisep, (7) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit paha, (8) lokasi pengukuran tebal lipatan kulit perut, dan (9) lokasi pengukuran lingkar dada

Ekstraksi DNA dari Darah

Ekstraksi DNA menggunakan QIAamp DNA Blood Kits (Qiagen) dengan

cara sebagai berikut: (1) Sebanyak 20 µl proteinase K Qiagen, 200 µl sampel darah, dan 200 µl larutan penyangga AL dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml

yang selanjutnya dicampur dengan menggunakan vorteks selama 15 detik.

Campuran ini diinkubasi pada suhu 56oC selama 10 menit, kemudian

disetrifugasi beberapa saat. (2) Sebanyak 200 µl etanol (96-100%) ditambahkan pada sampel, dicampur menggunakan vorteks selama 15 detik, dan disentrifugasi beberapa saat. (3) Campuran ini dimasukkan ke dalam QiAamp spin column dan disetrifugasi dengan kecepatan 6 000 x g (8 000 rpm) selama satu menit setelah ditutup terlebih dahulu. Selanjutnya, QiAamp spin column ini diletakkan di dalam tabung dua ml yang bersih, dan tabung yang mengandung filtrat dibuang. (4) Tutup spin column dibuka dengan hati-hati, dan 500 µl larutan

penyangga AW1 dimasukkan. QiAamp spin column ditutup kembali, dan

disentrifugasi dengan kecepata 6 000 x g (8 000 rpm) selama satu menit.

QiAamp spin column diletakkan di dalam tabung dua ml yang bersih, dan tabung yang mengandung filtrat dibuang. (5) Sebanyak 500 µl larutan penyangga AW2

dimasukkan ke dalam QiAamp spin column, dan disentrifugasi dengan kecepatan

20 000 x g (14 000 rpm) selama tiga menit. (6) QiAamp spin column dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml, ditambahkan 200 µl larutan penyangga AE, diinkubasi pada suhu ruangan (15-25oC) selama satu menit, dan disentrifugasi dengan kecepatan 6 000 x g (8 000 rpm) selama satu menit. Tabung terakhir mengandung DNA yang selanjutnya dapat digunakan untuk PCR.

Hasil ekstraksi dilihat dengan elektroforesis pada gel agarosa 1.2% dalam

larutan TBE 1x dalam piranti Submarine Eletrophoresis (Hoefer, USA). Fragmen

dimunculkan dengan pewarna etidium bromida setelah dimigrasikan selama 40 menit dengan voltase 85 V. Fragmen DNA yang terwarnai dilihat di bawah iluminasi ultraviolet. Konsentrasi DNA ditentukan dengan spektrofotometer. DNA dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan disimpan di dalam lemari pendingin dengan suhu -20oC untuk proses berikutnya.

Amplifikasi Gen MC4R

Amplifikasi daerah penyandi gen MC4R menggunakan primer forward (5’–

AATAACTGAGACGACTCCCTGAC–3’) dan reverse (5’–CAGAAGTACA

ATATTCAGGTAGGG–3’) (Yeo et al. 1998) dengan teknik PCR. Setiap unit

reaksi PCR mengandung ddH2O, larutan penyangga 1X, MgCl2 1.5 mM; dNTP

masing-masing 0.2 mM (invitrogen); sepasang primer masing-masing 0.4 µM; Taq DNA Polimerase sebanyak 1.25U, dan 100 ng DNA. Konsentrasi DNA

ditentukan dengan spektrofotometer dan diencerkan dengan ddH2O sehingga konsentrasi seluruh sampel sama dengan 25 ng/µl.

Setiap tabung untuk satu unit reaksi PCR (volume reaksi 50 µl) ditambahkan 5 l larutan penyangga 10x, 1.5 µl MgCl2 50 mM, 5µl dNTP mix 2mM, primer 10µM masing-masing 2 µl, 0.25 µl Taq Polymerase (5 U/µl), 4 l DNA (25 ng/µl), dan 30.25 l ddH2O. Campuran divorteks dan disentrifugasi

sebentar. Amplifikasi menggunakan mesin GeneAmp®PCR sistem 2400 (Perkin

Elmer) dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi awal selama 5 menit pada suhu 95oC selanjutnya diikuti dengan 35 siklus (95oC selama 45 detik untuk denaturasi, 57oC selama 1 menit untuk penempelan primer, 72oC selama 1

menit untuk perpanjangan); kemudian diakhiri 7 menit pada 72oC. Produk PCR

dari gen MC4R adalah sebesar 1146 pb (angka ini diperoleh dengan menjajarkan primer forward dan reverse dengan urutan MC4R monyet ekor panjang yang ada di GenBank).

Elektroforesis DNA Total dan Produk PCR

DNA total dan produk PCR dideteksi dengan cara dimigrasikan pada gel agarosa 1.2 %. Gel ini dibuat dengan melarutkan 0.6 g agarosa dengan 50 ml TBE 1X, kemudian dipanaskan sampai mendidih, diaduk dengan pengaduk bermagnet, kemudian ditambahkan etidium bromida sebanyak 2.5 l (10mg/ml) dan dibiarkan sebentar agar dingin. Sebelum membeku, agarosa tersebut dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan, kemudian dipasang sisir untuk 12 sampel dan dibiarkan sampai membeku selama 50 menit. Gel yang telah membeku selanjutnya direndam dalam piranti elektroforesis yang telah diisi larutan penyangga TBE 1X.

Sebelum menjalankan elektroforesis, campuran sampel (5 l) dan loading dye (1 l) dimasukkan ke dalam sumur sampel (agarosa). Elektroforesis dilakukan dengan Submarine Electrophoresis (Hoeffer USA) yang menjalankan sampel dari kutub negatif ke kutub positif dengan voltase 85V selama 40 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan sinar UV (gelombang 200-400 nm), difoto dengan Gel DOC (UVi), dan disimpan dalam disket 3.5 inci. Adanya DNA total atau produk PCR ditunjukkan dengan adanya pita (band) dalam gel hasil elektroforesis.

Pengurutan Produk PCR

Reaksi pengurutan dilakukan dalam MJ Research PTC-225 Peltier Thermal

Cycler menggunakan ABI PRISM BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Kits

dengan AmpliTaq DNA polymerase (FS enzyme) (Applied Biosystems) mengikuti

prosedur yang disediakan oleh pabrik pembuatnya. Produk PCR dari gen MC4R pada monyet ekor panjang diurutkan menggunakan primer forward (5’–AATA

ACTGAGACGACTCCCTGAC–3’) dan reverse (5’–CAGAAGTACAATATTCA

GGTAGGG–3’) (Yeo et al. 1998). Dengan demikian, urutan yang didapat

terkoreksi dari arah yang berlawanan (dua arah). Tahapannya adalah sebagai berikut: fragmen berlabel fluorescen dimurnikan dengan prosedur presipitasi etanol, selanjutnya sampel dilarutkan kembali dalam air terdestilasi dan diurut

dalam ABI 3730XL sequencer (Applied Biosystems).

Analisis Data Analisis Data Fenotipe

Untuk mengetahui perbedaan antar lokasi, data fenotipe dianalisis dengan analisis deskriptif dan analisis varian dengan program MINITAB Statistical Software, Release 14 (Minitab Inc. 2003). Sebelum analisis, data diuji normalitasnya dengan uji Anderson-Darling. Bila sebaran data tidak normal, data ditransformasi dengan box-cox tranformation (? antara -5 sampai dengan 5). Bila analisis varian berbeda nyata, dilanjutkan dengan uji beda Tukey. Analisis komponen utama (AKU) juga dilakukan dengan program yang sama.

Persamaan yang digunakan untuk analisis statistika deskriptif dan analisis varian (Minitab Inc. 2003) adalah:

Rata-rata (

)

Simpangan baku (

)

Koefien keragaman (KK)

31 Derajat bebas (db) db (faktor)

= r–1

db

(galat)

= n

–r

db (total)

= n

–1

Jumlah kuadrat (JK)

dengan: rata-rata pengamatan ke i = rata-rata semua pengamatan

nilai pengamatan ke jdan faktor ke i Kuadrat tengah (KT)

F hitung

Uji Tukey

dengan : = rata-rata pengamatan faktor ke i

= rata-rata pengamatan faktor ke j

= jumlah pengamatan ke i

= jumlah pengamatan ke j r = jumlah level

s= simpangan baku

Q = persentila dengan distribusirdan derajat bebas

Persamaan untuk analisis komponen utama adalah: Nilai Eigen: ragam komponen utama Z = A Y

dengan:

Z = skor matriks komonen utama(n*m)

Y = matriks data terstandar(n*p)

A = matriks faktor eigen(p*m)

Proporsi: proporsi ragam yang dijelaskan oleh komponen utamake k =

1 2

...

dengan: k adalah nilai eigen ke k

Proporsi total:

Proporsi total ragam yang dijelaskan oleh komponen utama

sejumlahkpertama=

+

+ ...

+

+ ...

+

dengan

:

_kadalah nilai eigen ke k

Vektor eigen (Loading factor) diperoleh dengan rumus: R = V L V

dengan:

R = matriks kovarian

V = matrriks vektor eigen

L = matriks diagonal nilai eigen

Analisis Data Molekuler

Hasil urutan DNA diedit dan dijajarkan dengan menggunakan program Mega 4.0 (Tamura et al. 2007). Dengan program yang sama, ditentukan jarak genetik (p distance), diversitas nukleotida (p) dan pohon filogeni dengan metode

bootstrap Neighbor-Joining (NJ) dengan 1000 kali pengulangan. Penentuan jumlah mutasi dan situs polimorfik juga menggunakan program yang sama.

33 Penentuan mutasi yang bersifat transisi dan transversi menggunakan program Arlequin 3.11 (Excoffier et al. 2005).

Persamaan yang dipakai dalam perhitungan p distance, dan diversitas nukleotida (Nei dan Kumar 2000) sebagai berikut:

p distance ( )

dengan : nd = jumlah perbedaan nukleotida antar dua urutan, dan

n= jumlah total nukleotida yang di uji.

diversitas nukleotida ( )

dengan : q= jumlah alel total, xi= frekuensi populasi dengan alel ke i, xj= jumlah frekuensi populasi dengan alel ke j, dan

dij=jumlah perbedaan nukleotida antara alel idan j

Dalam dokumen Polimorfisme Gen Penyandi Karakter Obesitas (MC4R Reseptor Melanokortin 4) Pada Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) Asal Bali, Jawa Timur dan Sumatera (Halaman 41-51)