BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.3. Farmakologi INH
2.3.2. Mekanisme kerja dan indikasi terapi
Isoniazid hanya aktif terhadap mikobakteria. Efeknya terutama terhadap M. tuberculosis complex, dan pada tingkat lebih rendah terhadap beberapa spesies mikobakteria lain misalnya, M. kansasii. Minimum Inhibition Concentration (MIC) M. tuberculosis adalah 0.025-0.05 mg/L dalam kaldu dan 0.1-0.2 mg/L dalam piring agar, hal ini menunjukkan ketidakpastian seputar penentuan MIC.
Isoniazid memiliki awal aktivitas bakterisidal yang paling ampuh dibandingkan semua OAT lain. Menambahkan obat lain tidak akan meningkatkan aktivitas INH tersebut. Dengan demikian, segera dapat diamati penurunan kemampuan mikobakteria dalam penularan selama pengobatan tahap intensif, kemungkinan besar ini disebabkan aktivitas bakterisidal dari isoniazid yang baik tersebut (IUATLD, 2002).
WHO merekomendasikan rentang dosis 4-6 mg/kg, dengan dosis harian maksimum tidak melebihi 300 mg. Dosis maksimum 300 mg juga digunakan untuk terapi pencegahan pada populasi dengan resiko tinggi. Pada dosis ini umumnya INH ditoleransi dengan baik (Becker et al., 2007).
Pada proses kinetikanya, INH cepat diserap melalui saluran cerna pada pemberian per-oral (Sweetman, 2009; Becker et al., 2007; Teixeira et al., 2013) dan mencapai hati melalui sistem vena porta. Sebelum mencapai sirkulasi sistemik INH akan mengalami metabolisme lintas awal (first pass metabolism) dihati dan terjadi pengurangan bioavailabilitasnya. Sekitar 75% - 95% dari INH diekskresikan oleh ginjal dalam 24 jam pertama, terutama sebagai metabolit berbentuk asam asetilisoniazid dan asam isonikotinat (Texeira et al., 2013).
Dalam jumlah yang kecil INH diekskresikan melalui feses, dan terbuang pada proses hemodialisa (Sweetman, 2009).
Rute metabolik utama asetilasi isoniazid menjadi asetilisoniazid oleh enzim N-asetiltransferase 2 (NAT2) ditemukan di hati dan usus halus. Dalam hati, INH dimetabolisme menjadi asetilisoniazid oleh N-asetiltransferase 2 (NAT2), diikuti oleh proses hidrolisis untuk menjadi asetilhidrazin dan kemudian dioksidasi oleh sitokrom P4502E1 (CYP2E1) menjadi senyawa intermediet yang
bersifat hepatotoksik. Metabolit ini dapat merusak sel hepatosit, baik dengan cara mengganggu homeostasis sel atau dengan memicu reaksi imunologis dimana metabolit yang bersifat reaktif ini terikat pada protein plasma sel hepatosit dan bertindak sebagai hapten. Jalur metabolisme lain yang berperan untuk menghasilkan metabolit toksik adalah hidrolisis langsung INH menjadi hidrazin (hepatotoksin yang poten). N-asetiltransferase 2 (NAT2) juga bertanggung jawab untuk mengkonversi asetilhidrazin menjadi diasetilhidrazin (komponen nontoksik). Glutation S-transferase (GST) merupakan enzim detoksifikasi penting pada fase II, berperan protektif sebagai pemungut/pengikat radikal bebas intraseluler, melalui reaksi konjugasi glutation dengan metabolit toksik yang dihasilkan dari CYP2E1. Konjugasi sulfhidril memfasilitasi pengeluaran metabolit dari tubuh dan mengurangi efek toksik. Dalam beberapa tahun terakhir, semakin banyak penelitian yang menunjukkan bahwa polimorfisme genetik pada gen NAT2, CYP2E1 dan GST berkaitan dengan kerentanan terhadap kejadian hepatotoksisitas yang diinduksi obat (drug-induced hepatotoxicity) selama pengobatan TB (Gambar 2.4 a & b) (Teixeira et al., 2013).
Gambar 2.4a. Alur metabolisme INH dan enzim – enzim utama yang terlibat (terdapat didalam tanda kotak) (Teixeira et al., 2013).
Gambar 2.4b. Alur metabolisme INH (Preziosi, 2007).
Isoniazid masuk ke dalam sel M. tuberculosis secara difusi pasif. Isoniazid merupakan prodrug yang diaktivasi oleh enzim katalase-peroksidase (KatG) yang berada didalam sel M. tuberculosis. Enzim KatG memasangkan isonicotinic acyl (bentuk aktif INH) dengan NADH untuk membentuk isonicotinic acyl-NAD complex. Kompleks ini berikatan erat pada enoylacyl-acyl carrier protein (ACP) reductase yang dikenal sebagai InhA sehingga memblokade substrat alaminya (enoyl-AcpM) untuk dapat berikatan dan memblokade aktivitas sintesis asam lemak. Proses ini menghambat sintesis asam mikolat yang diperlukan untuk dinding sel mikobakteria (gambar 2.5 a & b) (FAD, 2013). Kompleks AcpM-KasA yang terlibat dalam sintesis asam mikolat berikatan dengan INH aktif (Wang et al, 1997). Mekanisme kerja isoniazid secara detail masih tetap sulit untuk dipahami, hanya mekanisme kerjanya secara umum yang telah dipahami dengan baik (IUATLD, 2002).
Gambar 2.5a. Inhibisi sintesis asam mikolat oleh isoniazid (INH) (Wright, 2012).
Gambar 2.5b. Potensi keterlibatan superoksida dalam aktivitas INH . INH sebagai prodrug yang diaktifkan oleh protein KatG (katalase - peroksidase) atau oleh Mn2+. Di sebelah kiri gambar adalah skema yang menunjukkan bentuk KatG non-aktif (FeIII KatG) yang diubah menjadi bentuk aktif oleh dua jalur, salah satunya (a) membutuhkan superoksida (O2
-). Di sebelah kanan adalah skema yang menunjukkan aktivasi INH oleh jalur dependen Mn2+ yang juga melibatkan superoksida (b), jalur ini dapat dihambat oleh superoksida dismutase (SOD). Jalur ini ditunjukkan dengan garis putus-putus karena mungkin tidak signifikan secara in vivo. INH aktif (INH*) menghambat sintesis asam mikolat dengan cara menonaktifkan InhA dan ACPM - KasA. Spesies oksigen reaktif (ROS) timbul selama aktivasi INH atau akibat kehadiran superoksida (c). Protein AhpC muncul untuk membatasi akumulasi kerusakan oksidatif makromolekul yang diharapkan timbul dari aktivasi INH atau adanya superoksida. Garis bergelombang menunjukkan penghambatan jalur, dan jalur dengan bar tegak lurus menunjukkan penghambatan enzim (Wang et al., 1997).
2.4 Resistensi Mycobacterium tuberculosis Terhadap INH 2.4.1 Mutasi dan mekanisme resistensi
Mutasi adalah perubahan pada materi genetik suatu mahluk hidup yang terjadi secara tiba-tiba dan acak, merupakan dasar bagi sumber variasi organisme hidup yang bersifat terwariskan (heritable). Menurut kejadiannya, mutasi dapat terjadi secara spontan (spontaneous mutation) dan juga dapat terjadi melalui induksi (induced mutation). Mutasi spontan adalah mutasi yang terjadi akibat adanya sesuatu pengaruh yang tidak jelas, baik dari lingkungan luar maupun dari internal organisme itu sendiri. Sedangkan mutasi terinduksi adalah mutasi yang terjadi akibat paparan dari sesuatu yang jelas misalnya paparan sinar UV, senyawa kimia mutagenik, obat – obatan dll. Secara mendasar tidak terdapat perbedaan antara mutasi yang terjadi secara alami dan mutasi hasil induksi (Warianto, 2011).
Resistensi terhadap OAT terutama terjadi karena mutasi pada gen M.
tuberculosis. Penyebaran resistensi M. tuberculosis terjadi paska amplifikasi kuman resisten yang diinduksi oleh inadekuatnya obat disekitar kuman (Sjahrurachman, 2010).
Beberapa mutasi gen pada M. tuberculosis yang berperan sebagai penyebab resistensi INH telah dapat diidentifikasi. Mutasi yang terpenting berlokasi di gen KatG. Kepekaan terhadap INH tergantung pada keberadaan enzim katalase-peroksidase yang dikode oleh gen KatG. Mutasi pada gen ini menyebabkan tingginya angka kejadian resistensi INH (IUATLD, 2002).
2.4.2 Gen KatG dan mutasi kodon Ser315Thr (G944C)
Gen KatG berada di posisi antara 2,153,445 – 2,156,555 dari keseluruhan genom M. tuberculosis, dengan panjang 2223 bp dan merupakan bagian dari
pengkode protein katalase – peroksidase. Mutasi poin pada basa ke 944 dimana G berubah menjadi C menghasilkan perubahan kodon 315 dari AGC ACC. Hal ini menyebabkan perubahan asam amino serin menjadi treonin (SerThr) yang akan mengekspresikan protein katalase - peroksidase mutan (missense mutation) (Ensembl, 2015; Genbank, 2015; Ahmad et al., 2002; Mokrosov et al., 2002; Guo et al., 2006; Bostanabad et al., 2008; Marahatta et al., 2011).
Beberapa dekade terakhir, studi isolat M. tuberculosis pasien TB mencatat bahwa terdapat hubungan antara resistensi INH dan hilangnya aktifitas enzim katalase-peroksidase. Pengamatan ini mengarahkan untuk dilakukannya kloning dan skuensing struktur gen KatG yang mengekspresikan enzim tersebut. Studi genetika molekuler menegaskan bahwa KatG berperan dalam memediasi kepekaan terhadap INH. Peneliti – peneliti dari beberapa benua melaporkan bahwa terdapat beragam mutasi KatG yang unik terjadi pada strain M.
tuberculosis resisten INH, dan pergantian asam amino yang terletak pada posisi kodon 315Ser adalah yang paling banyak terjadi (gambar 2.6) (Ramaswamy dan Musser, 1998).
Terdapat beberapa varian mutasi pada kodon 315 gen KatG M.
tuberculosis yaitu Ser315Thr (AGCACC), Ser315Thr (AGCACA), Ser315Asn (AGCAAC), Ser315Ile (AGCATC), Ser315Arg (AGCCGC), Ser315Arg (AGCAGA) dan Ser315Gly (AGCGGC) (Ramaswamy dan musser, 1998), tetapi mutasi terbanyak adalah tipe mutasi Ser315Thr (AGCACC). Seperti pada penelitian Bostanabad et al di Belarusia pada tahun 2008 mendapatkan dari 40 isolat DNA M. tuberculosis yang berasal dari sputum penderita TB paru aktif dengan mutasi pada kodon 315 gen KatG, didapatkan 36
isolat (85%) merupakan mutasi Ser315Thr (G944C) (Bostanabad et al., 2008).
Mutasi gen KatG Ser315Thr (G944C) sangat potensial menjadi marker genetik untuk menentukan strain M. tuberculosis resisten INH (Bostanabad et al., 2008;
Marahatta et al., 2011).
Gambar 2.6. Polimorfisme protein KatG pada M. tuberculosis INHR. Varian asam amino diberi nomor secara vertikal. Dipakai singkatan asam amino satu huruf. Tampak dibawah skema perubahan nukleotida dan asam amino yang muncul pada kodon dengan 2 atau lebih varian kodon. A: alanin; C: sistein; D: asam aspartat; E: asam glutamat; F:
fenilalanin; G: glisin; H: histidin; I: isoleusin; M: metionin; N: asparagin; P: prolin; Q:
glutamin; R: arginin; S: serin; T: treonin; W: triptofan; V: valin (Ramaswamy dan Musser, 1998).
2.5 Metode Pemeriksaan Yang Berperan Pada Deteksi Mutasi Gen KatG Ser315Thr (G944C)
2.5.1 Pewarnaan ziehl-nielsen
Adalah suatu alat ukur untuk mendeteksi bakteri M. tuberculosis dengan metode pewarnaan bakteri tahan asam dan dilihat dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000x. Prinsip pewarnaan ini adalah bahwa M. tuberculosis mempunyai lapisan dinding lipid (asam mikolat) yang tahan terhadap asam.
Proses pemanasan mempermudah masuknya carbol fuchsin kedalam dinding sel, dan sel tetap mengikat zat warna carbol fuchsin walaupun didekolorisasi dengan asam alkohol (KEMENKES RI, 2012). Cara mengukurnya adalah dengan
menemukan bakteri tahan asam per-lapangan pandang. Hasil pengukuran pada pemeriksaan mikroskopis dengan mengacu pada skala International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD) yaitu:
− Negatif : tidak ditemukan BTA dalam 100 lapang pandang
− Scanty : ditemukan 1-9 BTA dalam 100 lapang pandang (ditulis jumlah BTAyang ditemukan)
− 1+ : ditemukan 10 – 99 BTA dlm 100 lapang pandang
− 2+ : ditemukan 1 – 10 BTA setiap 1 lapang pandang (periksa minimal 50 lapang pandang)
− 3+ : ditemukan ≥ 10 BTA dalam 1 lapang pandang (periksa minimal 20 lapang pandang) (KEMENKES RI, 2012).
Pada penelitian ini, pasien dengan mikroskpik BTA positif (Scanty, 1+, 2+, 3+) pada pemeriksaan awal sputum sebelum meminum OAT akan dimasukkan kedalam sampel yang diinginkan, apabila M. tuberculosis – nya belum mengalami mutasi gen KatG Ser315Thr (G944C) yang dikonfirmasi dengan PCR-RFLP. Selanjutnya, setelah akhir minggu ke 4 minum OAT M.
tuberculosis sputum diperiksa kembali pola mutasinya dengan PCR-RFLP, dinilai dan dihubungkan dengan tingkat kepatuhan selama pengobatan INH.
2.5.2 Polymerase chain reaction – Restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) dan elektroforesis
Polymerase chain reaction – Restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) dan elektroforesis digunakan sebagai alat ukur dan metode visualisasi untuk mendeteksi gen KatG M. tuberculosis dengan mutasi Ser315Thr (G944C).
Cara mengukurnya adalah dengan melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuens nukleotida tertentu dengan cara in vitro menggunakan metode enzimatis. PCR dilakukan dengan tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan extension. Hasil PCR akan diinkubasi dengan enzim restriksi (metode RFLP).
Hasil akan divisualisasikan dengan agarosa. Visualisasi elektroforesis hasil amplifikasi gen KatG dengan primer KatGF dan KatGR akan tampak pada band 200 bp. Pada proses restriksi, enzim MspI akan memotong di situs C↓CGG yang palindrom pada gen . Apabila terjadi mutasi gen KatG kodon 315 AGC ACC / basa ke 944 GC maka akan terbentuk situs tambahan C↓CGG yang dapat dipotong enzim MspI. Hasil produk RFLP terpanjang yang diperoleh adalah fragmen 153 bp gen KatG wild type dan 132 bp fragmen gen KatG mutan yang divisualisasikan dengan metode elektroforesis. Hasil pemotongan lain yang pendek (6 – 21 bp) tidak diperhitungkan karena tidak terlihat pada hasil elektroforesis dan dianggap tidak bermakna (gambar 2.7).
Gambar 2.7. Skema ilustrasi fragmen 200bp KatG yang di amplifikasi dengan primer KatG. Garis lurus merupakan representasi situs restriksi Mspl (C↓CGG). Pada wild type, produk PCR gen KatG tidak ada situs tambahan untuk restriksi Mspl dan fragmen terpanjang adalah 153bp. Pada mutan produk PCR gen KatG ada tambahan situs restriksi Mspl akibat basa ke 944 G C dan menyebabkan fragmen terpanjang adalah 132bp (Shrestha et al., 2011).
2.5.3 Mengukur kepatuhan terhadap pengobatan INH dan pemeriksaan metabolit INH menggunakan Taxo urine test strip metode Arkansas Metode untuk mengukur kepatuhan terhadap pengobatan INH meliputi pelaporan langsung penderita secara personal (patient self-report), penghitungan tablet (tablet counting), tes metabolit INH dalam urin (urine testing for INH metabolites) dan perangkat elektronik yang merekam ketika kemasan tablet dibuka (electronic devices that record when tablet containers opened). Tes metabolit INH dalam urin adalah yang paling objektif dibandingkan metode yang lain (Hanifa et al., 2007).
The Arkansas Departement of Public Health mengembangkan sebuah metode yang simpel untuk mengecek metabolit INH urin. Metode ini dikembangkan oleh Potts, Cozart dan Reagan, tetapi tidak pernah mereka publikasikan. Sampai kemudian Henderson yang bekerja pada laboratorium yang sama dengan mereka mempublikasikannya. Metode Arkansas menggunakan 30 mg asam barbiturat, larutan kloramin-T 14 g/dl, larutan potasium sianida 5 g/dl. 4 tetes urin pasien dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 30 mg asam barbiturat, kemudian ditambahkan masing – masing 2 tetes larutan kloramin-T dan potasium sianida. Tabung reaksi dikocok selama ±10 detik.
Prinsip reaksi metode Arkansas pada ini adalah, cincin piridin dari asam nikotinat yang terdapat pada INH dan metabolitnya akan dipecah oleh sianogen klorida untuk membentuk derivat glutakonaldehid. Derivat ini akan berkondensasi dengan asam barbiturat membentuk polimetin berwarna biru – ungu (Schraufnagel et al., 1990).
Taxo urine test strip menggunakan prinsip metode Arkansas yang dikembangkan oleh Kilburn et al, untuk memonitor pasien yang mendapat pengobatan INH. Tes ini membantu tenaga medis untuk mengetahui apakah pasien patuh menelan INH dengan cara yang lebih sederhana dan mudah.
Potongan kertas (paper strip) yang telah diresapi reagen berupa kloramin T, potasium tiosianat, asam sitrat dan asam barbiturat ini akan mendeteksi keberadaan INH dan metabolitnya didalam urin.
Pada pemeriksaan dengan Taxo urine test strip, munculnya warna biru, ungu, biru kehijauan atau hijau pada paper strip menunjukkan hasil positif terdapatnya INH atau metabolit INH dalam spesimen urin. Hasil positif didapat pada larutan INH / metabolitnya pada konsentrasi antara 100 µg/mL – 5 µg/mL.
Hasil dinyatakan negatif apabila tidak terjadi perubahan warna pada strip, atau terjadi perubahan warna selain warna untuk hasil positif (Hanifa et al., 2007).
Metode Arkansas memiliki sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi pada populasi di Eropa, sensitifitasnya sebesar 96 – 99% sampai 24 jam setelah menelan INH (Schraufnagel et al., 1990; Hanifa et al., 2007). Tidak ada publikasi data mengenai perbedaan karakteristik metode Arkansas pada populasi tipe asetilator cepat dibandingkan dengan populasi tipe asetilator lambat (Meissner et al 2002; Hanifa et al., 2007).
2.6 Kepatuhan Terhadap Pengobatan OAT
Di negara berkembang kepatuhan terhadap pengobatan OAT menghadapi masalah tersendiri akibat keadaan epidemiologik dan sosial ekonomi yang ada.
Studi yang dilakukan di Aleksandria Mesir tentang hubungan karakteristik
demografi dengan kepatuhan terhadap pengobatan OAT menunjukkan adanya perbedaan – perbedaan tingkat kepatuhan akibat perbedaan karakteristik demografi penderita. Perbedaan karakteristik demografi tersebut berupa usia, ras, jenis kelamin, tingkat pendidikan, dan status sosial ekonomi penderita (Gad et al., 1997).
Perbedaan karakteristik demografi tersebut memunculkan perbedaan – perbedaan seperti berikut:
• Pemahaman dan pengetahuan tentang regimen pengobatan
• Persepsi penderita atas manfaat yang diperoleh dari pengobatan
• Persepsi penderita atas hambatan – hambatan dalam pengobatan
• Dukungan sosial dan stresor dari kehidupan. Dukungan sosial biasanya akan kurang pada tunawisma, penyakit mental, sosial ekonomi lemah.
• Keyakinan budaya tertentu tentang penggunaan obat, proses penularan penyakit, dan perkembangan penyakit.
Perbedaan – perbedaan karakteristik tersebut mengakibatkan perbedaan tingkat kepatuhan dalam menjalankan proses pengobatan tuberkulosis (Frank et al., 2005).
Jika ditelaah lebih mendalam, kepatuhan adalah sebuah fenomena multi-dimensi yang mencakup lima faktor penting, yaitu:
1. Faktor terkait sosial ekonomi.
Beberapa kondisi sosioekonomi yang dapat mempengaruhi kepatuhan pada pengobatan tuberkulosis adalah tidak adanya sistem dukungan yang efektif, lingkungan yang tidak stabil, faktor budaya sekitar, stigma, mahalnya biaya medikasi, mahalnya biaya transportasi, dan lain sebagainya.
2. Faktor terkait sistem layanan kesehatan.
Pelayanan kesehatan yang buruk, dan adanya hubungan yang kurang baik antara pasien dengan penyedia layanan kesehatan, petugas yang kurang terlatih, serta ketidaktersediaan dokter ahli, berakibat kepatuhan pasien menjadi berubah.
3. Faktor terkait kondisi.
Beberapa kondisi khusus yang dialami oleh pasien dapat memberikan pengaruh buruk pada kepatuhan meminum obat, misalnya kasus asimtomatik, penurunan kesadaran akibat penyalahgunaan obat, stres psikologis, dan depresi.
4. Faktor terkait terapi.
Pengobatan TB merupakan hal yang kompleks, tidak jarang menimbulkan efek samping dan dapat pula menimbulkan efek toksik sebagai akibat dari mengkonsumsi obat.
5. Faktor terkait pasien.
Pada dasarnya, seluruh aspek kepatuhan dikembalikan kembali pada sifat dari pasiennya. Kepatuhan yang buruk akan ditemui pada pasien pelupa, pasien dengan penyalahgunaan obat, depresi, stres, maupun pasien yang terasingkan sebagai akibat dari stigma yang ada. Kondisi berbeda akan ditemui pada pasien yang telah mendapatkan motivasi yang cukup ataupun percaya benar pada efektifitas terapi (WHO, 2003).
2.7 Kerangka Konsep
Mutasi gen KatG Ser315Thr (G944C) diinduksi
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian analitik komparatif kategorik dengan desain cohort, untuk mengetahui apakah terdapat hubungan antara kepatuhan pasien TB paru mengkonsumsi INH selama pengobatan OAT dengan mutasi gen KatG Ser315Thr (G944C) M. tuberculosis.
3.2 Tempat Dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di SMF Ilmu Penyakit Paru RSU dr. Pirngadi Medan, dan Laboratorium Terpadu FK USU selama 9 bulan.
3.3 Populasi Dan Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi target
Pasien TB paru yang akan mulai mengkonsumsi INH pada fase inisial pengobatan OAT.
3.3.2 Populasi terjangkau
Pasien TB paru yang akan mulai mengkonsumsi INH pada fase inisial pengobatan OAT di SMF Ilmu Penyakit Paru RSU dr. Pirngadi Medan.
3.3.3 Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah semua pasien TB paru yang akan mulai mengkonsumsi INH pada fase inisial pengbatan OAT yang sesuai dengan kriteria inklusi dan ekslusi di SMF Ilmu Penyakit Paru RSU dr. Pirngadi Medan.
3.4 Kriteria Subjek Penelitian 3.4.1 Kriteria inklusi
• Pasien TB paru baru yang belum pernah mendapatkan pengobatan OAT dengan BTA positif yang dikonfirmasi secara mikroskopik dari hasil pewarnaan Ziehl-Nielsen.
• Pasien TB paru yang akan mulai mengkonsumsi INH pada fase intensif pengobatan OAT.
• Pasien belum dengan mutasi gen KatG Ser315Thr (G944C) M. tuberculosis, ditegakkan dengan pemeriksaan PCR-RFLP.
• Pasien berumur lebih dari 15 tahun.
3.4.2 Kriteria eksklusi
• Pasien dengan anuria.
• Pasien dengan HIV.
• Pasien dengan gizi buruk
• Pasien yang sudah mulai mengkonsumsi INH.
3.5 Besar Sampel
Perhitungan besar sampel dihitung dengan menggunakan rumus Lemeshow untuk populasi tidak diketahui. Perhitungan besar sampel ini digunakan karena belum ada data besar sampel dari penelitian sebelumnya yang menghubungkan tingkat kepatuhan dengan kejadian mutasi gen KatG Ser315Thr (G944C). Agar tingkat kepercayaan yang dikehendaki sebesar 95% dan ketepatan relatif yang diinginkan sebesar 10%, maka digunakan rumus ini.
Rumus :
n
=
Zα = Deviat baku alfa Kesalahan tipe I ditetapkan sebesar 5%, sehingga Zα = 1,96
P = Proporsi 0,50 Q = 1 – P = 1 – 0,50 d2 = Presisi 0,10
Dengan memasukksan nilai-nilai diatas pada rumus, diperoleh :
n
= = 97
Didapat jumlah sampel minimal yang akan diteliti adalah 97 orang, dalam penelitian ini dibulatkan menjadi 100 orang.
3.6 Cara Pengambilan Sampel
Sampel diambil dengan cara konsekutif sampling sesuai kriteria inklusi dan eksklusi.
3.7 Variabel Penelitian
Variabel Dependen Variabel Independen
• KatG mutan
• KatG wild type
• Patuh mengkonsumsi INH
• Tidak patuh mengkonsumsi INH
3.8 Definisi Operasional
penelitian - 3.9.1 Pengambilan sampel sputum 1. Bahan dan alat
Sarung tangan, masker, pot sputum diameter mulut pot ≥ 3.5 cm (standar WHO), spidol, box plastik, sputum.
2. Cara kerja
Spesimen sputum ditampung dalam pot sputum bersih dan kering, diameter mulut pot ≥ 3.5 cm, transparan, berwarna bening, dapat menutup dengan erat, bertutup ulir minimal 3 ulir, pot kuat dan tidak mudah bocor (KEMENKES RI, 2012). Sputum yang tidak langsung dikerjakan disimpan di lemari es 2-8 °C.
Cara berdahak yang baik diawali dengan kumur-kumur memakai air bersih, bila memakai gigi palsu harus dilepaskan sebelum kumur-kumur.
Kemudian penderita menarik nafas dalam 2-3 kali, buka tutup pot, dekatkan ke
mulut, berdahak dengan kuat dan ludahkan ke dalam pot sputum. Tutup pot yang berisi sputum dengan rapat (KEMENKES RI, 2012).
3.9.2 Pewarnaan ziehl-nielsen
Pewarnaan BTA metode Ziehl-Nielsen dan pembacaan hasil secara mikroskopik dilakukan oleh staf di RSU dr Pirngadi Medan. Pasien yang ditemukan kuman M. tuberculosis dengan variasi hasil Scanty, +1, +2 dan +3 selanjutnya dilakukan skrining awal apakah kuman sudah bermutasi atau belum.
Pasien dengan hasil M. tuberculosis tidak bermutasi dijadikan sampel pada penelitian ini.
3.9.3 PCR-RFLP
3.9.3.1 Dekontaminasi sputum dengan NaOH 1. Bahan dan alat
Sarung tangan, masker, tabung falcon, autoclave, vortex mixer, inkubator, pengatur waktu/timer, mesin sentrifugasi rotor conical tube 50ml 3000x g, sputum, buffer fosfat steril pH 6.8, NaOH (Lisdawati et al., 2010).
2. Cara kerja
Pengerjaan dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara (FK USU).
Sampel dalam pot dibuka lalu didekontaminasi dengan larutan NaOH 5%
untuk menghilangkan kontaminasi silang. Sampel dalam tabung falcon dihomogenkan menggunakan vortex mixer selama 5-20 detik, lalu biarkan selama 15 menit. Tambahkan buffer fosfat steril pH 6.8 lalu spesimen dipekatkan menggunakan sentrifuse 3.000x g selama 15 menit. Larutan supernatan dibuang dan resuspensi endapan dengan buffer fosfat hingga volume 1-3 ml. Simpan di
inkubator pada suhu 37°C selama 15 menit, kemudian sampel disiapkan untuk proses ekstraksi DNA.
3.9.3.2 Ekstraksi DNA Mycobacterium tuberculosis 1. Bahan dan alat
Sarung tangan, masker, pipet automatik, tabung ependorf 1.5 ml, mesin sentrifugasi, tip kuning, tip putih, pengatur waktu, kit ekstraksi DNA.
2. Cara kerja
Ekstraksi DNA M. tuberculosis sampel dan strain standar (H37RV) sebagai kontrol positif dilakukan dengan menggunakan Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) dengan prosedur sesuai ketentuan pabrikan. 1 ml sampel hasil dekontaminasi dipindahkan ke eppendorf 1.5 ml, sentrifus 13.000 – 16.000 g selama 2 menit. Buang supernatan, ditambahkan 600 µl Nuclei lysis Solution. Resuspensi dengan baik. Inkubasi 80°C selama 5 menit dan biarkan dingin sampai suhu ruangan 25°C. Tambah 3 µl larutan RNAse. Bolak – balikkan 2 – 5 kali. Inkubasi pada 37°C 15 – 60 menit dan biarkan sampai dingin.
Tambahkan 200 µl Protein Precipitation Solution kemudian divortex pada kecepatan max selama 20 detik. Inkubasi pada es selama 5 menit. Sentrifus 13.000 – 16.000 g selama 3 menit. Transfer supernatan ke eppendorf baru berisi 600 µl isopropanol suhu ruangan. Bolak – balikkan sampai nampak benang putih.
Sentrifus 13.000 – 16.000 g selama 2 menit lalu buang supernatan hati – hati dan keringkan tabung pada tissue. Tambah 600 µl etanol 70% dan dibolak – balik untuk mencuci pelet DNA. Sentrifus 13.000 – 16.000 g selama 2 menit. Hisap dan buang etanol dengan pipet automatik perlahan dan hati – hati. Keringkan tabung
Sentrifus 13.000 – 16.000 g selama 2 menit lalu buang supernatan hati – hati dan keringkan tabung pada tissue. Tambah 600 µl etanol 70% dan dibolak – balik untuk mencuci pelet DNA. Sentrifus 13.000 – 16.000 g selama 2 menit. Hisap dan buang etanol dengan pipet automatik perlahan dan hati – hati. Keringkan tabung